利用nlsGPS1 Förster共振能量转移（FRET）生物传感器可视化细胞内赤霉素水平

该方法有助于解答植物发育领域中关于生长调控类植物激素分布的关键问题。通过使用基因编码的FRET生物传感器（例如可检测赤霉素的nlsGPS1），可以在细胞分辨率下测量拟南芥组织中重要化合物的动态分布。通常，初次接触该技术的研究者会面临一定困难，因为FRET生物传感器的分析涉及比率成像，与强度成像相比，其噪声更高且需要额外的分析步骤。

首先，在1/2 Murashige和Skoog（MS）琼脂方板上播种约20粒灭菌的Arabidopsis种子。用透气医用胶带密封培养板，并用铝箔包裹，在4°C条件下避光孵育1至3天以进行分层处理。为进行根部成像，将培养板垂直放入生长室中，在指定条件下培养3天。

对于暗中生长的下胚轴，将培养皿转移至生长室中进行一至四小时的光照脉冲处理，以同步种子萌发。随后用铝箔纸包裹培养皿，并将其垂直放置于生长室中继续培养三天。对于稳态测量，取50 µL模拟溶液加入洁净的显微镜载玻片上，轻轻将三株表达核定位的赤霉素感知传感器1（nlsGPS1）的幼苗置于液滴中。

然后在洁净的盖玻片每个角上点一滴真空脂，轻轻将盖玻片覆盖在幼苗上。根据需要小心添加额外的模拟溶液，以去除任何气泡。在赤霉素四（GA4）处理前，使用一个装有真空脂的20毫升注射器，并配备一个开口直径为1毫米的改良200微升移液器吸头，在洁净的载玻片上绘制一个均匀分层的矩形区域，长3.5厘米，宽2.5厘米。

向矩形中央加入 50 微升模拟溶液，使用洁净的镊子夹住表达 nlsGPS1 的幼苗子叶底部，小心地将其转移至模拟溶液中。将一滴真空脂点在盖玻片上，如前所示将其置于真空脂矩形的中央，然后小心地向储液区补充额外的模拟溶液，注意不要扰动幼苗。随后，在配备有适当激光器以激发 CFP 和 YFP 的共聚焦显微镜上采集幼苗的图像，进行荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer）成像。

进行GA4处理时，将载玻片从显微镜载物台上取下，并设置20分钟计时器。立即从盖玻片右侧移除模拟溶液，同时在盖玻片左侧加入17 µL含1 µM GA4的一半浓度MS液体培养基，直至完全替换掉模拟溶液。然后将玻璃载玻片重新放回显微镜载物台上，再等待10分钟，随后采集GA4处理后的图像。

为了建立目标组织的时间序列实验，在 ibidi sticky-slide 的灌注通道中央加入 200 微升的对照溶液，并按照演示方法将 nlsGPS1 幼苗轻轻放入对照溶液中。使用镊子轻轻将盖玻片覆盖在幼苗上，并用镊子背面轻压盖玻片的外缘，直至其与 sticky-slide 周围的粘性材料形成牢固结合。接下来，使用两个内径为 0.8 毫米的弯头 Luer 接头和一段内径为 0.8 毫米的硅胶管，将 sticky-slide 连接到装有对照溶液的 20 毫升注射器，并将 slide 连接到用于收集流出液的废液容器。

轻轻按压活塞，向腔室中加入足量溶液以确保无气泡存在，随后将注射器装载到可编程注射泵上。启动泵以开始时间进程。在时间进程期间进行GA4处理时，暂停泵以停止灌注，并将装有对照缓冲液的注射器更换为含有四分之一MS液体培养基并补充GA4的注射器。

进行三维图像分析时，将文件导入 IMARIS 图像分析软件并打开表面重建向导。将背景扣除设置为 3 微米，阈值设置为默认值。在对细胞核进行分割时，需注意避免包含大量荧光较弱的细胞核，因为信号接近背景水平的物体其信噪比过低，不适合进行比率图像分析。

然后根据使用YFP发射创建的表面，对CFP和FRET发射通道进行掩膜。使用XT平均强度比值扩展功能，计算供体激发下受体发射与供体激发下供体发射的比值，即两个通道中各个表面平均强度值之间的比值。为了用nlsGPS1发射比值对各个表面对着色，请选择基于统计量的颜色编码，并将平均强度比值设置为统计量类型。

在统计图标下，导出表格中各个数值的比值，并将这些数值复制粘贴到电子表格中，以便对数据进行图形化展示。在拟南芥根中，nlsGPS1发射比值梯度表明分生区和分裂区的GA4水平较低，而在后期伸长区GA水平较高。相比之下，在对nlsGPS1无响应的根中未观察到发射比值梯度，这表明内源性GA4梯度并非人为假象。

在暗处生长的下胚轴中，nlsGPS1 发射比率梯度也形成，其子叶和典型弯钩处水平较低，而在下胚轴快速伸长的基部区域水平较高。相比之下，在对 nlsGPS1 无响应的下胚轴中未观察到发射比率梯度。此外，外源施加的 GA4 与拟南芥根的分裂区相比，优先积累在伸长区，表明 nlsGPS1 可用于研究内源性和外源性赤霉素（GA）的分布模式。

此外，对经GA4处理的nlsGPS1幼苗进行时间过程分析，发现外源GA4在根伸长区的积累速度较之分生区更快。在进行该实验操作时，需注意避免定量成像过程中出现像素饱和，保持成像参数恒定，并在样品灌流过程中尽量减少漂移和焦平面变化问题。在本方法基础上，可进一步采用更精细的技术，例如对生长于根芯片类控流装置中的根系进行成像，以探究不同生长速率或响应胁迫条件下拟南芥根尖中赤霉素梯度的变化规律。该技术建立后，为植物生长领域研究赤霉素在拟南芥（Arabidopsis thaliana）其他组织与器官中的动态分布奠定了基础。