Name: 利用 nlsgps1 förster 共振能量转移 (fret) 生物传感器可视化细胞赤霉素水平 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解利用nlsGPS1 FRET生物传感器在拟南芥根尖和下胚轴中可视化赤霉素分布的方法。该技术通过比率成像实现植物激素动态的高分辨率定量分析，为植物发育生物学研究提供重要工具。

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本工作获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（资助协议编号 n° 759282）。

1. 准备工作
<ol>
	<li>配制不含蔗糖的½ Murashige和Skoog琼脂培养基（pH 5.7，1 L）。
	<ol>
		<li>将2.2 g Murashige和Skoog（MS）基础培养基溶解于950 mL超纯水中，用5 M KOH调节pH至5.7。</li>
		<li>用超纯水定容至终体积1 L，分装至两个500 mL的瓶子中，每瓶含1%植物琼脂。在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制不含蔗糖的¼ MS液体培养基（pH 5.7，1 L）。
	<ol>
		<li>将1.1 g MS溶解于950 mL超纯水中，用5 M KOH调节pH至5.7，再用超纯水定容至终体积1 L。分装至两个500 mL的瓶子中，在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制GA4溶液。
	<ol>
		<li>将GA4溶解于70%乙醇中，配制成终浓度为100 mM的GA4母液。</li>
		<li>工作液的配制：将GA4母液用pH 5.7的¼ MS液体培养基稀释至0.1–1 µM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 植物生长
<ol>
	<li>灭菌 拟南芥 种子。
	<ol>
		<li>在通风橱中操作。将种子分装至2 mL 微量离心管中（每管约200粒种子）。使用含耐氯染料的记号笔标记，并将管盖打开的离心管放入灭菌容器（一个可密封的大型盒子）中。</li>
		<li>在灭菌容器内放置一个含有50 mL超纯水和50 mL次氯酸钠溶液的250 mL烧杯。</li>
		<li>向烧杯中加入3 mL浓盐酸（HCl）。立即密封容器，使氯气作用6–16 h以完成灭菌。</li>
		<li>打开容器后，立即盖紧种子架中所有微量离心管的管盖。灭菌后的种子可干燥保存，直至接种时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>播种约20粒已灭菌的 拟南芥 将种子接种于½ MS琼脂方形培养板上。用透气医用胶带密封培养板，并用铝箔包裹。于4 °C条件下避光孵育1–3天进行春化处理。</li>
	<li>用于根部成像时，将培养皿垂直置于生长培养箱中培养3天，生长条件如下：长日照条件（LD，16小时光照/8小时黑暗）；光照强度120 µmol⋅m⁻²⋅s⁻¹；温度22 °C。-2s-1&#160;光照强度；光周期温度为22 °C，暗周期温度为18 °C，相对湿度65%（RH）。</li>
	<li>对于暗生长的下胚轴：将培养皿转移至生长室中，接受1–4小时的光照脉冲以同步萌发。用铝箔纸包裹培养皿，并将其垂直放置于生长室中培养3天。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>稳态测量（图1A)
	<ol>
		<li>在洁净的显微镜载玻片上加入50 µL ¼ MS液体培养基（此后称为模拟处理液）。将表达nlsGPS1的幼苗从培养板中轻轻转移至载玻片上。</li>
		<li>取一片干净的盖玻片，在其四个角上各点一滴真空脂。轻轻将盖玻片覆盖在幼苗上，并小心添加额外的模拟溶液以去除任何气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GA4 处理：化学交换实验（图1B).
	<ol>
		<li>在GA之前4 处理时，使用一支装有真空润滑脂的20 mL注射器（连接移液器吸头），在洁净的载玻片上均匀涂抹出一个矩形（长：3.5 cm，高：2.5 cm）图1B）。为了获得细线状的真空脂，应将移液器吸头剪至直径1 mm的开口。</li>
		<li>向载玻片上加入 50 µL 模拟溶液。用洁净的镊子夹取 nlsGPS1 幼苗，轻轻放置于模拟溶液中。为避免损伤，转移幼苗时应使用镊子托住子叶下方，切勿直接夹持幼苗。</li>
		<li>取一片洁净的盖玻片，在其四个角上各点一滴真空脂。用镊子将盖玻片置于真空脂矩形区域的中央。此时，盖玻片已沿真空脂矩形的两条长边侧密封。</li>
		<li>小心添加额外的模拟溶液以填满储液室，并去除储液室内的任何气泡，注意不要扰动其中的幼苗。</li>
		<li>在GA之前获取图像4 使用共聚焦显微镜进行处理。操作步骤详见本方案第4节。</li>
		<li>对于GA4 处理时，从共聚焦显微镜载物台上取下玻片，设置20分钟计时器。</li>
		<li>启动计时器后，将缓冲液更换为含 1 µM GA 的 ¼ MS 液体培养基4加入GA4 从盖玻片左侧加入约 50 µL 溶液，并从右侧移除先前的模拟溶液。持续更换溶液直至完全替换模拟溶液，整个过程约需 10 分钟。图1B).</li>
		<li>将玻璃载玻片放回显微镜载物台。等待10分钟后，再获取加药后的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为感兴趣组织设置时间进程 
	注意： 感兴趣的组织可能是下胚轴或根。我们通常使用商用灌流系统对nlsGPS1生物传感器进行成像的时间过程实验。图1C，参见 材料表）或 RootChip7,10,11.
	<ol>
		<li>向粘附滑片灌注通道的中央加入 200 µL 模拟溶液（参见 材料表). 轻轻挑取nlsGPS1幼苗，将其放置于粘性载片的模拟溶液中。</li>
		<li>用镊子轻轻放置盖玻片，并用镊子背面轻压盖玻片外缘，使其与粘附滑片周边的粘性材料形成牢固结合。</li>
		<li>使用两个肘型鲁尔接头（内径 [ID] 为 0.8 mm）和硅胶管（内径为 0.8 mm），将粘性滑槽连接至一个 20 mL 注射器和一个收集流出液的出口容器。使用鲁尔锁接头（内径为 0.8 mm）将注射器与硅胶管连接。</li>
		<li>手动轻压含有模拟溶液的注射器，使足够溶液流经腔室，确保腔室内无残留气泡。将注射器放置于可编程注射泵上并固定。</li>
		<li>根据所使用的注射器设定泵的参数（即.，直径和体积）以及泵随附手册中规定的流速。 
		注意： 在本方案中，采用1–3 mL/h的流速，可根据实验需求进行调整。通过启动泵来开始时间进程。</li>
		<li>对于GA4 时间过程中的处理（图1C)，暂停泵以停止灌注，更换含有添加GA的¼ MS液体的新注射器4.&#160;按照下一节所示进行共聚焦成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 显微镜检查
注意：我们进行共聚焦激光显微镜观察。
<ol>
	<li>使用配备激光器的共聚焦显微镜获取图像，以进行FRET成像。 
	注意：对于nlsGPS1，需对青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）的变体进行成像。在本方案中，使用商用显微镜（见材料表，列为显微镜1和2），配备10倍或20倍干式0.70数值孔径的谐波复消色差PLAN APO物镜。</li>
	<li>对于显微镜1，使用波长为448 nm和514 nm的激光分别激发CFP和YFP。采集顺序扫描图像。将探测器（例如HyD SMD）设置为在CFP激发后检测460–500&#8201;nm范围的信号，用于CFP（供体发射），以及525–560&#8201;nm范围的信号，用于YFP（FRET发射）。在第二个扫描序列中，设置探测器在YFP激发后检测525–560 nm范围的信号，用于YFP（YFP发射）。 
	注意：该YFP荧光信号用作表达量对照，并用于核分割，在商用三维显微图像可视化与分析软件中生成表面结构。</li>
	<li>对于显微镜2，使用波长为440 nm和514 nm的激光线分别激发CFP和YFP。采集两个通道图像。在通道1中，将探测器（例如.，ChS）设置为在CFP激发后检测464–500&#8201;nm范围的信号，用于CFP（供体发射），以及526–562&#8201;nm范围的信号，用于YFP（FRET发射）。在通道2中，设置探测器在YFP激发后检测526–562 nm范围的信号，用于YFP（YFP发射）。 
	注意：该YFP荧光信号用作表达量对照，并用于核分割，在三维可视化与分析软件中生成表面结构。</li>
	<li>以512 × 512像素的格式和12位分辨率采集图像。</li>
	<li>增益需调整至一个经验确定的数值，以获得良好的信号强度，同时避免像素饱和。在整个实验过程中，CFP和FRET发射通道的增益设置应保持一致，不得更改。将针孔设置为1艾里单位（AU）。&#160;将IBIDI粘附式载玻片放置于共聚焦显微镜载物台上，并按照先前所示方法进行成像。</li>
	<li>在显微镜1的软件中，当处于实时扫描状态时，利用图像屏幕左上角的过曝/欠曝高亮显示（Glow over/under）功能，判断感兴趣区域的曝光不足或饱和情况。在显微镜2的软件中，利用图像屏幕底部的范围指示器（Range Indicator）功能，判断感兴趣区域的曝光不足或饱和情况。任何定量图像分析均不应存在像素饱和现象。</li>
	<li>设置z轴堆栈，步长为1 μm。可根据需要减小步长以提高z轴分辨率，或增大步长以加快采集速度，或增加可成像的位置/样本数量。对于自动时间序列实验，结合z轴堆栈设置时间参数（在采集模式选项卡中选择xyzt模式），以在设定的时间间隔自动采集图像。</li>
</ol>
5. 使用 Fiji 进行图像分析
注意：使用 ImageJ（Fiji）可以处理成像数据，并生成拟南芥（Arabidopsis）幼苗中 nlsGPS1 发射比率的二维（2-D）图像。图像示例见图&#160;2A、2C、2E、2G 和 3A。在 ImageJ 中，可通过搜索功能查找本方案中的各个命令。按下计算机键盘上的空格键和 L，将打开一个新窗口，在搜索框中输入所需命令即可。
<ol>
	<li>将文件（.lif 或 .lsm 文件）拖入 Fiji（Image J）中，并以超堆栈（hyper-stack）形式打开图像。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 堆栈 &#62; Z 投影，并选择 叠加切片，以捕获所有像素，而非仅如 最大值投影 那样仅保留最亮像素。</li>
	<li>从主菜单中选择 处理 &#62; 减去背景，并将滚动球半径设置为 50 像素。取消选择其他所有选项，并对三幅图像均执行此操作。此步骤使用“滚动球”算法去除背景。 
	注意： 经验确定 50 像素的半径可将细胞核包含在前景中。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 颜色 &#62; 拆分通道。将打开三个新窗口：C1-SUM（CFP 通道）；C2-SUM（FRET 通道）；以及 C3-SUM（YFP 通道）。</li>
	<li>选择 C3-SUM 窗口，然后从主菜单中选择 处理 &#62; 滤波器 &#62; 高斯模糊，并应用大小为 1 的高斯模糊以降低图像噪声。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 调整 &#62; 亮度/对比度，并选择自动。</li>
	<li>从主菜单中选择 处理 &#62; 增强对比度，并将 饱和度 设置为 0.35。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 类型 &#62; 8 位，将堆栈转换为 8 位图像。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 调整 &#62; 自动局部阈值。在 自动局部阈值 窗口中选择以下参数：Phansalkar 方法，半径 = 15，参数 1 = 0，参数 2 = 0，以及 白色堆栈。此步骤使用 YFP 堆栈生成二值掩膜。</li>
	<li>选择 C2-SUM 窗口，然后从主菜单中选择 处理 &#62; 滤波器 &#62; 高斯模糊，并应用大小为 1 的高斯模糊。</li>
	<li>选择 C1-SUM 窗口，然后从主菜单中选择 处理 &#62; 滤波器 &#62; 高斯模糊，并应用大小为 1 的高斯模糊。</li>
	<li>为从两个通道生成发射比堆栈，从主菜单中选择 处理 &#62; 图像计算器。在弹出的新窗口中，选择 C2-SUM 作为图像 1，选择 除法 作为运算符，选择 C1-SUM 作为图像 2。</li>
	<li>务必选择 创建新窗口 和 32 位格式。将出现一个名为 C2-SUM 的结果 的新窗口。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 查找表 &#62; LUT 16_colors。</li>
	<li>从主菜单中选择 处理 &#62; 图像计算器。在弹出的新窗口中，选择 C2-SUM 的结果 作为图像 1，选择 乘法 作为运算符，选择 C3-SUM 作为图像 2。此步骤将 YFP 二值掩膜与 YFP/CFP 堆栈相乘，以仅显示 YFP 控制通道中存在的像素。</li>
	<li>从主菜单中选择 处理 &#62; 数学 &#62; 除法，并将数值设为 255。在打开的新窗口中，选择 是 以分析堆栈中的所有图像。将出现一幅名为 C2-SUM 的结果的结果 的新图像。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 调整 &#62; 亮度/对比度，并选择 自动。</li>
	<li>从主菜单中选择 处理 &#62; 增强对比度，并将 饱和度类型 = 0.35。</li>
	<li>从主菜单中选择 图像 &#62; 调整 &#62; 亮度/对比度，并设置最小值和最大值以捕捉 GA 分布。可选步骤：从主菜单中选择 分析 &#62; 工具 &#62; 标尺 和 显示 LUT 标定条，并将 C2-SUM 的结果的结果 保存为 .tiff 文件。</li>
	<li>为获取发射比数值，从主菜单中选择 分析 &#62; 设置测量，并选择 平均灰度值 和 标准差。</li>
	<li>从工具栏中选择矩形形状，绘制感兴趣区域（ROI）。从主菜单中选择 分析 &#62; 测量。新窗口将报告所选 ROI 的平均值。</li>
	<li>将获得的数值复制并粘贴至电子表格软件（例如 Excel 或 OriginPro）中，并为 GA4 处理前后的实验绘制直方图，或为时间序列实验绘制折线图。</li>
</ol>
6. 使用三维可视化与分析软件进行图像分析
注意：使用所选软件（见材料表）的优势在于能够对物体（例如细胞核）进行分割，并从共聚焦z轴层扫数据生成三维图像。有关图像示例，请参见图&#160;2B、2D、2F、2H和3B。
<ol>
	<li>打开软件并导入文件（.lif 或 .lsm 文件）。</li>
	<li>基于对照 YFP 发射通道，使用 Surfaces 向导 对细胞核进行分割。分割得到的对象称为“表面”（surfaces）。该分割步骤可将细胞核内所有体素作为一个整体对象进行分析，同时排除细胞核外体素的背景信号。</li>
	<li>在 Surfaces 向导 中，将背景扣除（局部对比度）设置为 3 µm，阈值设置为默认值。基于 YFP 发射通道（受体激发-受体发射 [AxAm]）生成的表面，对 CFP 发射通道（供体激发-供体发射 [DxDm]）和 FRET 发射通道（供体激发-受体发射 [DxAm]）进行掩膜处理。</li>
	<li>使用扩展功能 XT Mean Intensity Ratio，计算每个表面在两个通道中的平均荧光强度比值，即供体激发-受体发射与供体激发-供体发射的比值（DxAm/DxDm）。 
	注意： 该扩展功能可在线下载。</li>
	<li>为使用 nlsGPS1 发射比值对各个表面进行着色，请选择表示为色轮图标的 Color coding with statistics，并在统计类型中选择 Mean intensity ratio。</li>
	<li>从 Statistics 图标下的表格中导出各个表面的比值数据。</li>
	<li>将数值复制粘贴至电子表格中，用于绘制 GA4 处理前后的直方图，或用于时间序列实验的线性图。</li>
</ol>
7. 统计分析
注意：有关 nlsGPS1 发射比率的蜂群图和箱线图，请参见 图 3D。
<ol>
	<li>打开软件，将细胞核表面的发射比率粘贴为 Y 列。</li>
	<li>选择感兴趣的列，然后选择 统计 &#62; 统计描述 &#62; 正态性检验，以判断样本是否呈正态分布。运行正态性检验后，将弹出一个新窗口并报告结果。</li>
	<li>如果样本呈正态分布，则使用 t 检验作为统计方法。选择 统计 &#62; 假设检验 &#62; 行双样本 t 检验，并运行 t 检验。</li>
	<li>如果样本不呈正态分布，则选择 统计 &#62; 统计假设检验 &#62; 双样本方差检验，以判断样本间的方差差异是否不显著。</li>
	<li>如果方差差异不显著，则使用 Mann-Whitney U 检验 作为统计方法。选择 统计 &#62; 非参数检验 &#62; Mann-Whitney 检验，并运行该检验。</li>
	<li>如果方差差异显著，则使用 Kruskal-Wallis ANOVA 检验 作为统计方法。选择 统计 &#62; 非参数检验 &#62; Kruskal-Wallis ANOVA 检验，并运行该检验。</li>
</ol>

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<li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cytosolic+zinc+in+Arabidopsis+roots+combining+FRET+sensors+and+RootChip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology.</a> New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).</li>
<li>Krebs, M., Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+cytoplasmic+and+nuclear+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots.</a> Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于FRET的GA生物传感器nlsGPS1提供了一种定量报告和测量多细胞植物中赤霉素（GA）激素梯度的方法。相比通过质谱直接检测或利用转录报告基因及基于信号蛋白降解的间接测量方法，基于FRET的生物传感器在时空分辨率上更优，可对动态变化进行定量分析12,13。在不同类型组织中进行高分辨率的细胞成像，有助于深入理解赤霉素生物学，并激发关于多细胞环境中GA积累调控机制及其功能的新假说。例如，在特定的GA生物合成、分解代谢及转运突变体中，以及在时空特异性诱导干扰条件下，监测nlsGPS1生物传感器的变化，可为研究根中GA梯度的建立方式以及根细胞对GA梯度的响应提供重要信息。该传感器还可应用于其他模式植物和作物物种，以检验调控种子萌发、细胞伸长和开花等GA介导过程的机制是否具有保守性。
基于FRET的nlsGPS1生物传感器成像的关键步骤包括：1）在进行定量FRET分析时，像素信号不应饱和；2）在采集供体发射（DxDm）和受体发射（DxAm）图像时，应保持成像参数（如&#34;探测器增益&#34;）恒定；3）应使用对照nlsGPS1-NR品系以排除假象干扰；4）样品制备应尽量减少漂移和焦平面变化问题。此外，样品生长的环境条件也需严格控制，因为赤霉素（GA）水平对光照时长和光照强度等环境因素敏感14,15,16,17。此类分析的一个主要局限在于，由于比率成像本身会增加噪声，因此需要较高的信噪比才能获得有效图像。因此，对于那些难以通过青色和黄色荧光蛋白进行比率荧光显微成像的组织和器官（例如荧光蛋白检测效果较差的深层组织），nlsGPS1成像将不适用。另一方面，比率型读数通常优于强度型读数，因为内部对照有助于排除因生物传感器在特定细胞、组织或条件下表达水平、稳定性、亮度或可检测性变化所引起的假象。例如，FRET生物传感器成像及图像分析已被用于研究多种组织中的多种配体5,6,18,19,20,。本文所报道的成像实验与图像分析方法可进行调整，以适应新的成像技术（如光片显微镜），从而可能为例如更深层的根组织类型提供新的研究见解。
第一代nlsGPS1生物传感器是一种高亲和力传感器，可提供高分辨率的赤霉素（GA）梯度图谱，并能够报告外源性GA处理后细胞内GA水平的升高。目前nlsGPS1的一个局限性在于该传感器的响应不可快速逆转，因此它所反映的并非稳态GA水平，而更可能是目标溶液中近期达到的最高GA浓度。该传感器的确切周转速率尚不明确，加之其可逆性较低，因而无法检测某些组织类型中可能在数分钟至数小时内发生的内源性GA水平下降。还需注意的是，在对其他具有生物活性的GA进行成像时，nlsGPS1对GA4 具有较高的亲和力（Kd = 24 nM），相比之下，对GA3&#160;（Kd= 240 nM）和GA1&#160;（Kd = 110 nM）的亲和力较低7。未来的GA生物传感器可通过设计提高其可逆性，同时保持高亲和力，或针对不同的GA前体、生物活性形式及分解代谢产物展现出不同的特异性。

植物激素在植物生长和发育中起着基础性作用。这些小分子、可移动的信号分子通常在多个层面受到调控，例如生物合成、分解代谢以及短距离和长距离运输1,2,3,4。近年来，人们对激素信号通路及其下游转录响应的理解不断加深。然而，要将激素信号通路所引发的多样化细胞响应与调控激素分布的输入信号联系起来，我们需要在细胞尺度上对激素水平进行时空定量分析。基于FRET的生物传感器能够检测植物激素，从而提升科学家在细胞水平上定量激素浓度的能力。基于FRET的生物传感器由一对FRET荧光蛋白（供体和受体）与一个感应结构域连接而成，该结构域可结合特定配体或响应生物学刺激。对于小分子生物传感器而言，配体的结合会引发感应结构域发生构象变化，从而导致FRET荧光蛋白对之间的距离和/或相对取向发生改变。FRET生物传感器的比率分析通过激发供体荧光蛋白并测量受体与供体的荧光发射强度比值来实现5,6。配体结合可通过该发射比值的变化被检测到7。
我们最近开发了一种基于FRET的植物激素GA生物传感器。GAs是一类能够促进种子萌发、细胞伸长以及植物从营养生长向开花阶段发育转变的激素。nlsGPS1生物传感器定位于细胞核，可提供多种植物组织中GA动态变化的时空信息。 拟南芥 细胞中，赤霉素（GA）与可溶性受体赤霉素不敏感矮化蛋白（GID）结合，该复合物诱导DELLA蛋白降解，而DELLA蛋白是GA信号通路的负调控因子2nlsGPS1的GA感应结构域包含 拟南芥 赤霉素受体（AtGID1C）与一个截短的DELLA蛋白（AtGAI，缺失74个氨基酸）相连，并与一对FRET荧光蛋白组成检测系统，其中供体荧光蛋白为增强二聚化的Cerulean变体，受体荧光蛋白为Aphrodite（密码子多样化的Venus）8nlsGPS1生物传感器是一种针对生物活性GA的高亲和力传感器4 (Kd = 24 nM 对于 GA4）并可用于多种组织类型以绘制和量化GA梯度。为避免对结果的误读 拟南芥 为了在体内检测GA水平，我们还开发了一种对GA无响应的nlsGPS1非响应变体（nlsGPS1-NR），用作阴性对照。nlsGPS1-NR蛋白在GA结合口袋中携带突变，可破坏GA的结合，同时在DELLA蛋白中携带突变，可破坏其与GID受体蛋白的相互作用。7,9nlsGPS1 和 nlsGPS1-NR 系中观察到的发射比率模式或变化可视为与 GA 结合事件无直接关联的人为假象。还需注意，nlsGPS1 与 GA 的结合4 不可快速逆转，因此细胞核内的nlsGPS1发射比率应被解读为反映特定细胞核中赤霉素（GA）最近的最高浓度，而非实时稳态水平。因此，无法利用nlsGPS1对下降中的GA水平进行分析。
本文提供了一种利用nlsGPS1生物传感器在模式植物拟南芥（Arabidopsis）细胞中进行高分辨率共聚焦成像的详细实验方案。该方案介绍了在稳态条件下以及随时间动态过程中对植物根部和下胚轴进行成像的方法。nlsGPS1传感器有望被应用于多种组织类型及不同植物物种中，以绘制并定量分析赤霉素（GA）的分布情况。

<table><tbody><tr><td>nlsGPS1 Col0 拟南芥种子</td><td>NASC</td><td>N2107734</td><td></td></tr><tr><td>nlsGPS-NR Col0 拟南芥种子</td><td>NASC</td><td>N2107735</td><td></td></tr><tr><td>赤霉素 A&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (GA&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>G7276</td><td>溶于 70% EtH，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液（漂白剂）</td><td>Fisher S/5040</td><td>HSRA 064</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 HCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>微孔胶带</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>ibidi 粘附式载片</td><td>Ibidi</td><td>81128</td><td>Luer 0.1，用于根部成像</td></tr><tr><td>ibidi 粘附式载片</td><td>Ibidi</td><td>80168</td><td>Luer 0.2，用于下胚轴成像</td></tr><tr><td>粘附式载片用玻璃盖玻片</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>弯头 Luer 接头</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Ibidi</td><td>108401</td><td></td></tr><tr><td>Luer 锁定接头</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>可编程注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>AL-1000</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Sigma</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog 基本盐</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>植物琼脂，1 kg</td><td>Melford</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>磨边显微镜载玻片，76 mm × 26 mm，厚度 1.0 mm 至 1.2 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12383118</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 No.1 1/2，玻璃，22 mm × 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12363138</td><td></td></tr><tr><td>Luer 接头式注射器，20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10785126</td><td></td></tr><tr><td>3M Micropor 外科手术纸胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>12787597</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾，500 g</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>10428671</td><td></td></tr><tr><td>钟表匠镊子 5 号，不锈钢</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4340</td><td></td></tr><tr><td>剪刀，125 mm，不锈钢</td><td>Fisher Scientific</td><td>12338099</td><td></td></tr><tr><td>接头变径管 0.5 至 1.6</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8</td><td></td><td></td><td>共聚焦激光显微镜 1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780</td><td></td><td></td><td>共聚焦激光显微镜 2</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>三维可视化与分析软件</td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>Origin Lab</td><td></td><td>统计分析软件</td></tr></tbody></table>

利用nlsgps1 förster共振能量转移（fret）生物传感器可视化细胞内赤霉素水平

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

植物激素赤霉素（GA）是一种小分子、可移动的信号分子，在种子萌发、细胞伸长以及植物发育转变过程中发挥关键作用。赤霉素感知传感器1（GPS1）是首个基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器，可用于活体监测细胞内的赤霉素水平。通过测量定位于细胞核的GPS1（nlsGPS1）的荧光发射比值，可在细胞尺度上实现对不同组织类型中内源性和外源性施加的赤霉素梯度进行时空动态成像。本实验方案将描述如何在三个示例实验中成像nlsGPS1的发射比值：稳态条件下的成像、外源施加赤霉素A4（GA4）前后的比较成像，以及随处理时间进程的时间序列成像。我们还提供了使用Fiji软件和一种商用三维（3-D）显微图像可视化与分析软件来分析nlsGPS1发射比值的方法，并解释了利用nlsGPS1定量赤霉素水平时可能存在的局限性和常见问题。

利用 nlsGPS1，可以测量细胞内的 GA4 适用于荧光成像的组织中的水平，包括根尖和暗处培养的下胚轴（图2）。在 拟南芥 根中，nlsGPS1 发射比率梯度表明分生区和细胞分裂区赤霉素（GA）水平较低，而在伸长后期区赤霉素水平较高（图 2A 和 2B）。相比之下，nlsGPS1-NR 根中未观察到发射比率梯度，表明内源性 GA 梯度并非人为假象。图 2C 和 二维).在暗处生长的下胚轴中也形成了nlsGPS1的发射比率梯度，其在子叶和顶端弯钩处水平较低，而在下胚轴快速伸长的基部区域水平较高（图 2E 和 2F）。相比之下，在nlsGPS1-NR下胚轴中未观察到发射比率梯度。图 2G 和 2H）。在两者中 拟南芥 根和暗生长的下胚轴细胞中，内源GA积累与细胞伸长速率相关。
此外，外源提供的 GA4 相较于分生区，主要在伸长区积累 拟南芥 根（图3)，表明nlsGPS1可用于研究内源性和外源性GA的分布模式。
在时间进程实验中，将 nlsGPS1 幼苗置于粘性载片腔室中，先用 ¼ MS 液体培养基灌注，随后用 0.1 µM GA4 处理 30 分钟。视频显示外源 GA4 在根伸长区的积累速度较分生区更快（视频 1）。
<img alt="微流控装置示意图，显示流动通道；用于分析的流体注入；标注有进样口（IN）和出样口（OUT）。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：共聚焦成像的样品制备 这些图示展示了以下样品制备过程的示意图：（A稳态实验，B外源GA处理前后的对比4 处理，以及用于（C使用粘性载玻片的处理时间进程实验（C）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像、根细胞表达水平、温度梯度标尺、对比图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：拟南芥 根和暗培养下胚轴中的 GA 梯度。 使用 ImageJ 软件分析了 (A) nlsGPS1 和 (C) nlsGPS1-NR 根的二维图像，使用商业化的三维图像分析软件分析了 (B) nlsGPS1 和 (D) nlsGPS1-NR 的三维图像。两种分析方法均显示了 拟南芥 根中内源性 GA4 梯度的存在。使用 ImageJ 软件分析了 (E) nlsGPS1 和 (G) nlsGPS1-NR 暗培养下胚轴的二维图像，使用商业化的三维图像分析软件分析了 (F) nlsGPS1 和 (H) nlsGPS1-NR 的三维图像。两种分析方法均显示了暗培养下胚轴中存在内源性 GA4 梯度。LUT 标尺显示了 nlsGPS1 发射比率的伪彩色表示。YFP 图像作为表达对照提供。下胚轴图像通过两个载物台位置采集获得。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GA4处理前后nlsGPS1发射比率的荧光分析；包含图示与图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：根中外源GA梯度 前两个面板显示（A二维和（B) 外源GA处理前后nlsGPS1根系的三维图像（处理前及处理后20分钟）4 (1 µM）。YFP 图像被用作表达对照。最后两列显示（C) 平均值与标准差以及 (D) 伸长区（以白色框标示的区域）细胞核的nlsGPS1发射比率的蜂群图与箱线图。在伸长区，经GA处理后，nlsGPS1发射比率显著升高4 处理（Mann-Whitney U 检验，*** P-值 &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光微珠分散示意图；光学分析；细胞分选模拟；微流控。" src="/files/ftp_upload/58739/58739movie1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 1"> 
视频 1：使用粘性载玻片对 nlsGPS1 根进行灌流实验。 本视频展示了用 1/4 MS 液体培养基灌流并用 0.1 µM GA4 处理 30 分钟的 nlsGPS1 的三维图像。在时间序列中，每 10 分钟采集一次图像，持续 3 小时，具体时间间隔如下：先用模拟溶液处理 30 分钟（帧 t = 1，t = 2，t = 3），再用 GA4 处理 30 分钟（帧 t = 4，t = 5，t = 6），随后用模拟溶液处理 2 小时（帧 t = 7 至 t = 18）。在图像采集前，样品已用模拟溶液灌流 2 小时。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/Movie1.mov" target="_blank">请点击此处观看此视频。（右键可下载。）</a>

赤霉素感知传感器1（GPS1）是首个基于荧光共振能量转移的生物传感器，可用于高时空分辨率地测定细胞内赤霉素类植物激素的水平。本实验方案介绍了利用遗传编码的nlsGPS1生物传感器在拟南芥（Arabidopsis）下胚轴和根尖中可视化并定量细胞内赤霉素水平的方法。

利用nlsGPS1 Förster共振能量转移（FRET）生物传感器可视化细胞内赤霉素水平

植物激素赤霉素（GA）是一种小分子、可移动的信号分子，在种子萌发、细胞伸长和发育过程中发挥关键作用……

该方法有助于解答植物发育领域中关于生长调控类植物激素分布的关键问题。通过使用基因编码的FRET生物传感器（例如可检测赤霉素的nlsGPS1），可以在细胞分辨率下测量拟南芥组织中重要化合物的动态分布。通常，初次接触该技术的研究者会面临一定困难，因为FRET生物传感器的分析涉及比率成像，与强度成像相比，其噪声更高且需要额外的分析步骤。首先，在1/2 Murashige和Skoog（MS）琼脂方板上播种约20粒灭菌的Arabidopsis种子。用透气医用胶带密封培养板，并用铝箔包裹，在4°C条件下避光孵育1至3天以进行分层处理。为进行根部成像，将培养板垂直放入生长室中，在指定条件下培养3天。对于暗中生长的下胚轴，将培养皿转移至生长室中进行一至四小时的光照脉冲处理，以同步种子萌发。随后用铝箔纸包裹培养皿，并将其垂直放置于生长室中继续培养三天。对于稳态测量，取50 µL模拟溶液加入洁净的显微镜载玻片上，轻轻将三株表达核定位的赤霉素感知传感器1（nlsGPS1）的幼苗置于液滴中。然后在洁净的盖玻片每个角上点一滴真空脂，轻轻将盖玻片覆盖在幼苗上。根据需要小心添加额外的模拟溶液，以去除任何气泡。在赤霉素四（GA4）处理前，使用一个装有真空脂的20毫升注射器，并配备一个开口直径为1毫米的改良200微升移液器吸头，在洁净的载玻片上绘制一个均匀分层的矩形区域，长3.5厘米，宽2.5厘米。向矩形中央加入 50 微升模拟溶液，使用洁净的镊子夹住表达 nlsGPS1 的幼苗子叶底部，小心地将其转移至模拟溶液中。将一滴真空脂点在盖玻片上，如前所示将其置于真空脂矩形的中央，然后小心地向储液区补充额外的模拟溶液，注意不要扰动幼苗。随后，在配备有适当激光器以激发 CFP 和 YFP 的共聚焦显微镜上采集幼苗的图像，进行荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer）成像。进行GA4处理时，将载玻片从显微镜载物台上取下，并设置20分钟计时器。立即从盖玻片右侧移除模拟溶液，同时在盖玻片左侧加入17 µL含1 µM GA4的一半浓度MS液体培养基，直至完全替换掉模拟溶液。然后将玻璃载玻片重新放回显微镜载物台上，再等待10分钟，随后采集GA4处理后的图像。为了建立目标组织的时间序列实验，在 ibidi sticky-slide 的灌注通道中央加入 200 微升的对照溶液，并按照演示方法将 nlsGPS1 幼苗轻轻放入对照溶液中。使用镊子轻轻将盖玻片覆盖在幼苗上，并用镊子背面轻压盖玻片的外缘，直至其与 sticky-slide 周围的粘性材料形成牢固结合。接下来，使用两个内径为 0.8 毫米的弯头 Luer 接头和一段内径为 0.8 毫米的硅胶管，将 sticky-slide 连接到装有对照溶液的 20 毫升注射器，并将 slide 连接到用于收集流出液的废液容器。轻轻按压活塞，向腔室中加入足量溶液以确保无气泡存在，随后将注射器装载到可编程注射泵上。启动泵以开始时间进程。在时间进程期间进行GA4处理时，暂停泵以停止灌注，并将装有对照缓冲液的注射器更换为含有四分之一MS液体培养基并补充GA4的注射器。进行三维图像分析时，将文件导入 IMARIS 图像分析软件并打开表面重建向导。将背景扣除设置为 3 微米，阈值设置为默认值。在对细胞核进行分割时，需注意避免包含大量荧光较弱的细胞核，因为信号接近背景水平的物体其信噪比过低，不适合进行比率图像分析。然后根据使用YFP发射创建的表面，对CFP和FRET发射通道进行掩膜。使用XT平均强度比值扩展功能，计算供体激发下受体发射与供体激发下供体发射的比值，即两个通道中各个表面平均强度值之间的比值。为了用nlsGPS1发射比值对各个表面对着色，请选择基于统计量的颜色编码，并将平均强度比值设置为统计量类型。在统计图标下，导出表格中各个数值的比值，并将这些数值复制粘贴到电子表格中，以便对数据进行图形化展示。在拟南芥根中，nlsGPS1发射比值梯度表明分生区和分裂区的GA4水平较低，而在后期伸长区GA水平较高。相比之下，在对nlsGPS1无响应的根中未观察到发射比值梯度，这表明内源性GA4梯度并非人为假象。在暗处生长的下胚轴中，nlsGPS1 发射比率梯度也形成，其子叶和典型弯钩处水平较低，而在下胚轴快速伸长的基部区域水平较高。相比之下，在对 nlsGPS1 无响应的下胚轴中未观察到发射比率梯度。此外，外源施加的 GA4 与拟南芥根的分裂区相比，优先积累在伸长区，表明 nlsGPS1 可用于研究内源性和外源性赤霉素（GA）的分布模式。此外，对经GA4处理的nlsGPS1幼苗进行时间过程分析，发现外源GA4在根伸长区的积累速度较之分生区更快。在进行该实验操作时，需注意避免定量成像过程中出现像素饱和，保持成像参数恒定，并在样品灌流过程中尽量减少漂移和焦平面变化问题。在本方法基础上，可进一步采用更精细的技术，例如对生长于根芯片类控流装置中的根系进行成像，以探究不同生长速率或响应胁迫条件下拟南芥根尖中赤霉素梯度的变化规律。该技术建立后，为植物生长领域研究赤霉素在拟南芥（Arabidopsis thaliana）其他组织与器官中的动态分布奠定了基础。

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