利用 nlsgps1 förster 共振能量转移 (fret) 生物传感器可视化细胞赤霉素水平
2019年1月12日
赤霉素感知传感器 1 (gps1) 是第一个用于测量具有高时空分辨率的赤霉素植物激素细胞水平的 förster 共振能量转移基生物传感器。该协议报告了利用拟南芥下胚和根尖的基因编码 nlsgps1 生物传感器对细胞赤霉素水平进行可视化和量化的方法。
这种方法可以帮助回答植物开发领域有关生长调节植物激素分布的关键问题。通过使用基因编码的FER生物传感器，例如检测长臂猿的nlsGPS1，可以测量细胞溶液中重要的化合物在阿拉伯组织中的动态分布。一般来说，对这个问题的新鲜人将很难，因为分析F FRET生物传感器涉及比位成像，与意图公制成像相比，比例成像增加了噪音和额外的分析步骤。
首先在1/2 Murashige和Skoog或MS agar方板上播种约20个灭菌的阿拉伯种子。用毛孔手术胶带密封板，用铝箔包裹，在四摄氏度下孵育一到三天，进行分层。对于根成像，在指示条件下，将板以垂直方向转移到生长室三天。
对于深色生长的低磷基，将板转移到生长室一到四个小时的光脉冲，以同步发芽。然后用铝箔包裹板，并将它们以垂直方向放入生长室三天。为了稳定状态测量，在干净的显微镜幻灯片中添加 50 微升模拟溶液，并轻轻地将三个核局部 gibberellin 感知传感器一个或 nlsGPS1 在幻灯片上表达幼苗。
然后，在清洁盖滑的每个角落发现一滴真空润滑脂，然后轻轻地将吸尘油脂盖在幼苗上。小心添加额外的模拟溶液，以清除任何气泡，如有必要。在 Gibberellin 四或 GA4 治疗之前，使用充满真空润滑脂的 20 毫升注射器，并配备经过修改的 200 微升移液器尖端，开口直径为 1 毫米，在干净的玻璃滑梯上绘制一个均匀分层的三厘米半长两个半厘米宽的矩形。
在矩形中心添加 50 微升的模拟溶液，并使用干净的钳子将 nlsGPS1 从它们的科蒂龙下侧提升为表达幼苗，小心地转移到模拟溶液中。将真空润滑脂的盖滑点放置，就像刚刚演示的真空润滑脂矩形中心一样，在不干扰幼苗的情况下，小心地将储液罐填充额外的模拟溶液。然后在配备适当激光的共合显微镜上获取幼苗的图像，用于刺激性的 CFP 和 YFP，以执行福斯特共振能量转移成像。
对于 GA4 进行治疗，请从显微镜阶段取下幻灯片，并设置 20 分钟的计时器。立即从盖滑的右侧取出模拟溶液，同时在盖滑的左侧添加 17 微升四分之一 MS 液体，并辅以一个微摩尔 GA4，直到更换所有模拟溶液。然后将玻璃幻灯片放回显微镜阶段，再等待 10 分钟，然后获取 GA4 后处理图像。
要为感兴趣的组织设置时间课程，在 ibidi 粘滑的灌注通道中心添加 200 微升的模拟溶液，并轻轻地将 nlsGPS1 幼苗放入模拟溶液中，如所证明的。使用钳子轻轻将盖滑在幼苗上，使用钳子的背面轻轻压在盖滑的外边缘，直到它与粘性滑轨外围的粘性材料形成牢固的粘结。接下来，使用两个0.8毫米内径弯头Luer连接器和0.8毫米内径硅胶管将粘性滑杆连接到充满模拟溶液的20毫米注射器，并将滑轨连接到出口容器以收集流出溶液。
轻轻按下柱塞，向腔室分配足够的溶液，以确保没有气泡，然后将注射器加载到可编程注射器泵上。然后启动泵以启动时间过程。对于在时间过程中进行 GA4 治疗，暂停泵以停止灌注，用装满四分之一 MS 液体的注射器替换含有含有注射器的模拟缓冲液，并辅以 GA4。
对于 3D 图像分析，请将文件导入 IMARIS 图像分析软件程序并打开曲面向导。将背景减法设置为三微米，将阈值设置为默认值。在核的分割过程中，注意不要包括荧光暗的核，因为信号接近背景水平的物体的信号噪声配给过低，无法进行比例图像分析。
然后根据使用 YFP 发射创建的表面屏蔽 CFP 和 FRET 发射通道。使用 XT 均强度比扩展计算供体激发接受器发射比除以供体激励供体发射在两个通道中单个表面的均强度值之间。要使用 nlsGPS1 发射比为单个曲面着色，请选择带统计数据的颜色编码，并设置平均强度比作为统计类型。
在统计图标下，从表中导出单个值的比率，然后复制这些值并将其粘贴到电子表格中，以图形表示数据。在 Arabidopsis 根中，nlsGPS1 排放比梯度表示在中分区和低 GA4 水平，在后期伸长区中低 GA 水平。相比之下，在 nlsGPS1 无响应根中未观察到发射比梯度，这表明内源 GA4 梯度不是神器。
nlsGPS1排放比梯度也形成于暗生长的低血小体中，在低血小板中含量较低，在低血小板快速拉长的基底区域形成典型的钩和高水平。相比之下，在 nlsGPS1 非反应性低血性中未观察到排放比梯度。此外，与阿拉伯根系的分区相比，外源提供的GA4在伸长区优先积累，表明nlsGPS1可用于研究内生和外源性GA模式。
此外，对GA4处理的nlsGPS1幼苗进行时间过程分析，发现与分系区相比，外源GA4在根伸长中积累得更快。在尝试此过程时，必须记住在定量成像过程中避免饱和像素，以保持成像参数不变，并最大限度地减少样品灌注期间的漂移和焦变问题。按照这个程序阐述的方法，如成像根生长在根芯片类型控制填充装置可以回答额外的问题，GA梯度如何变化的阿拉伯根尖以不同的速率或响应压力后，其发展，这项技术铺平了道路的研究，在植物生长领域的研究，探索在更多的阿拉伯多普西沙组织和器官的吉百利。
概述
本文介绍了一种新型的基于Förster共振能量转移（FRET）的生物传感器，即赤霉素感知传感器1（GPS1），用于测量植物中的赤霉素植物激素。该方法能够对拟南芥下胚轴和根尖中的赤霉素水平进行高分辨率的可视化和定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 植物激素信号
- 细胞成像技术
背景
- 赤霉素是植物中至关重要的生长调节植物激素。
- 了解其分布对于研究植物发育至关重要。
- FRET生物传感器为测量激素水平提供了一种动态方法。
- 先前的方法缺乏GPS1所提供的时空分辨率。
研究目的
- 开发一种用于实时测量植物组织中赤霉素水平的方法。
- 可视化拟南芥中赤霉素的分布。
- 增进对植物生长调节的理解。
使用的方法
- 在拟南芥幼苗中使用遗传编码的nlsGPS1生物传感器。
- 使用比值成像分析FRET信号。
- 使用共聚焦显微镜成像赤霉素水平。
- 进行时间过程实验以评估赤霉素分布的动态变化。
主要结果
- nlsGPS1显示拟南芥根和下胚轴中的赤霉素水平存在梯度。
- 在下胚轴的伸长区发现高赤霉素水平。
- 外源GA4处理确认了生物传感器对赤霉素变化的敏感性。
- 结果表明nlsGPS1生物传感器有效用于研究赤霉素动态。
结论
- GPS1生物传感器是研究赤霉素分布的宝贵工具。
- 该方法可以推进植物发育生物学研究。
- 研究结果有助于深入理解植物中的植物激素信号。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring dynamic phytohormone gradients at cellular resolution supports mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular signaling to phenotypic outcomes. The nlsGPS1 FRET biosensor enables quantitative, spatiotemporal mapping of gibberellin dynamics, providing predictive confidence in target pathway modulation. This approach aids in translational biomarker alignment and preclinical model validation for growth-regulatory pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gibberellin signaling dynamics in living tissues to clarify target engagement and pathway activity.
- Operational Value: Provides ratiometric readouts that reduce variability and support reproducible target validation assays.
- Predictive Value: Facilitates dose-response characterization of gibberellin-modulating compounds with subcellular resolution.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescence ratio outputs suitable for high-content screening of gibberellin biosynthesis or signaling inhibitors.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging that corrects for expression level and environmental artifacts, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with microfluidic perfusion systems for time-course compound exposure studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports evaluation of gibberellin pathway modulation in plant-based preclinical models of growth dysregulation.
- Translational Continuity: Links cellular hormone flux to tissue-level phenotypes, aiding in biomarker-driven go/no-go decisions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target gibberellin modulation versus off-target effects.
Pipeline & Workflow Integration
The nlsGPS1 biosensor integrates into discovery workflows from target validation through lead optimization by providing real-time, quantitative feedback on pathway modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gibberellin-dependent mechanisms in growth and development pathways.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for compound libraries targeting hormone biosynthesis or perception.
- Analytics: Delivers ratiometric FRET measurements that allow comparison of intracellular gibberellin levels across conditions and time points.
- Translational Research: Connects subcellular hormone dynamics to organ-level responses in Arabidopsis, supporting extrapolation to complex systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform for longitudinal studies of phytohormone flux in genetic or chemical perturbation models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in phytohormone signaling by providing direct, real-time readouts of cellular gibberellin levels.
- Operational Value: Enhances reproducibility through ratiometric imaging that normalizes for biosensor expression and environmental variables.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by linking compound treatment to quantifiable changes in target pathway activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gibberellin pathway modulators based on validated target engagement in relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and FRET imaging techniques for accurate ratiometric analysis.
- Dependent on stable transgenic expression of nlsGPS1 in Arabidopsis lines for consistent biosensor performance.
- Necessitates careful control of imaging parameters to avoid pixel saturation and maintain signal-to-noise ratio during time-course experiments.
- Involves analytical steps to segment nuclei and compute intensity ratios, requiring validated image analysis pipelines (e.g., Fiji or IMARIS).
- Limited to gibberellin perception; does not distinguish between bioactive and inactive forms or downstream signaling events.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Plant Growth and Sample Preparation
2:09
Gibberellin4 (GA4) Treatment
3:45
Tissue of Interest Time Course Setup
5:09
3-D Image Analysis
6:36
Results: Representative Endogenous and Exogenous GA Gradients in Arabidopsis Roots and Dark-grown Hypocotyls
7:58
Conclusion
