使用表达增强型绿色荧光蛋白的Escherichia Coli评估小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用

本方案展示了一种简单且可重复的方法，用于评估表达EGFP的大肠杆菌测定巨噬细胞的吞噬能力。大家好，我是来自大连医科大学第二附属医院的Jun-Yu。今天我们将向您展示一种简便且直观的方法来评估巨噬细胞的吞噬作用，该方法可在两小时内轻松完成。

该方法广泛应用于先天免疫功能的研究。人们认为，老年人的先天免疫功能保持完整。因此，今天我们将从老年和年轻小鼠中分离腹腔巨噬细胞，并比较这两组细胞的吞噬能力。

那么，我们开始吧。首先，合成EGFP基因片段，并使用高保真Taq DNA聚合酶对该片段进行克隆。然后将PCR产物连接至pET SUMO载体中。

第三步，将连接产物转化至大肠杆菌菌株中，并用乳糖诱导EGFP表达。这些表达EGFP的大肠杆菌将作为吞噬作用检测的标记物。接着，分离并培养小鼠腹膜巨噬细胞。

然后，将表达EGFP的大肠杆菌与巨噬细胞在37°C下共孵育一小时。淬灭步骤完成后，巨噬细胞即可用于荧光显微镜和流式细胞仪检测。合成EGFP基因片段，并使用高保真Taq DNA聚合酶及上下游引物扩增该片段。

为了确保PCR产物在下一步TA克隆中具有单个3'端腺苷突出端，建议在最后一个循环后于72摄氏度延伸30分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。如果片段被正确扩增，则可在凝胶上观察到一条717 bp的条带。

使用T4 DNA连接酶通过TA克隆方法将PCR产物克隆至pET SUMO载体中。在室温下孵育反应30分钟。将5 µL PCR产物加入100 µL BL21感受态细胞中。

将细胞在42摄氏度下热激90秒，然后将混合物置于冰上3分钟。加入400 µL预热至37摄氏度的LB培养基。在37摄氏度、120 rpm条件下振荡培养1小时。

将细菌接种至含有100 µg/mL卡那霉素的LB平板表面，以筛选转化载体的大肠杆菌。将平板置于37°C培养箱中过夜培养。次日，挑取一个阳性菌落接种于5 mL含有100 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中。

在37°C、120 rpm条件下，于摇床培养箱中孵育两小时。然后加入诱导剂乳糖，使其终浓度为0.5 mmol/L，并继续振荡培养六小时，以诱导EGFP表达。根据经验，振荡培养六小时后，OD600可能达到0.7或更高。

最后，使用荧光显微镜验证EGFP的表达程度。取10 µL细菌培养液滴加到载玻片上，然后盖上盖玻片。

在荧光显微镜下观察EGFP的表达。将3.5克硫乙醇酸盐加入100毫升蒸馏水中。使用前在高压灭菌器中灭菌。

在生物安全柜中，将巯基乙酸盐培养基吸入一支一毫升无菌注射器中。每只小鼠使用一支单独的注射器，以避免交叉感染。使用23号针头向小鼠腹腔注射1 mL 3.5%巯基乙酸盐培养基，并在接下来的三天内让小鼠自由饮水和进食。

三天后，在密闭盒中使用七氟烷快速麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。然后将小鼠放入盛有75%乙醇的培养皿中进行消毒，并迅速转移至生物安全柜中。将小鼠置于解剖板上，用针固定前肢，以稳定小鼠位置。

使用带有20号针头的5毫升注射器，将5毫升冷PBS注入小鼠腹腔，注射部位为下腹部，注意避免刺穿肠道。轻轻按摩小鼠腹部两侧，然后缓慢轻柔地抽吸腹腔液体。

将腹腔液分装至50毫升离心管中。重复上述步骤两到三次。将悬浮细胞在4至8摄氏度条件下以400 ×g离心10分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。每孔加入五百万个细胞至六孔板中用于流式细胞术检测，每孔加入50万个细胞至24孔板中用于荧光显微镜观察。将细胞置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养过夜。

3小时后可更换培养基以去除非贴壁细胞，因为这些细胞大多数为淋巴细胞。在明场显微镜下观察细胞，以评估细胞活力和细胞密度。此处显示的图像为原代细胞的正常状态。

通常，巨噬细胞的密度较低，因为腹腔细胞的大部分为淋巴细胞。移除24孔板中的培养基。加入100 µL新鲜培养基和10 µL细菌培养基。

然后将培养板置于含5%二氧化碳的培养箱中，37摄氏度孵育1小时。用每孔500 µL的冷PBS轻柔洗涤三至五次，以去除未被内化的细菌。在室温下用含4%甲醛的PBS溶液孵育细胞30分钟。

用 PBS 洗涤细胞三次。加入鬼笔环肽 633 偶联工作液以染色 F-肌动蛋白。室温下避光、湿润环境中孵育 60 分钟。

加入DAPI工作液以染色细胞核，并在室温避光条件下孵育5分钟。用PBS冲洗一次，再用等体积的蒸馏水冲洗一次。表达EGFP的E.coli呈绿色，作为吞噬作用的标记。

为尽量减少实验误差并对结果进行正确解读，按照表2列出的设置实验分组和对照管。对于将置于冰上的对照组，从六孔板中移除培养基，用PBS洗涤一次，然后向孔中加入1毫升70毫摩尔/升的冷EDTA，以解离细胞，并将细胞转移至流式细胞术管中。

向试管中加入50 µL细菌悬液，并置于冰上1小时。对于其他组，移除培养基，每孔加入1 mL新鲜培养基。根据表2中描述的分组设置，向各孔中加入50 µL细菌悬液。

然后将六孔板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。为淬灭未被内化的大肠杆菌（E.coli）的荧光，向每孔中加入200微升0.8%的结晶紫水溶液，并短暂摇晃。此步骤旨在避免因表达EGFP的大肠杆菌结合于巨噬细胞表面但未被内化而导致的假阳性结果。

用 PBS 洗涤细胞三次，以去除残留的结晶紫。然后向孔中加入 1 毫升 70 毫摩尔每升的冷 EDTA，使细胞脱落，并转移至流式细胞术管中。将试管在 2,000 转每分钟离心 5 分钟，弃去上清液。

加入 100 µL PBS 重悬细胞。根据分组设置，向各管中加入 5 µL F4/80 ATP 标记抗体或同型对照抗体。短暂涡旋混匀，置于冰上避光孵育 5 至 10 分钟。

向每支试管中加入一毫升 PBS，2,000 转/分钟离心五分钟。弃去上清液。用 200 至 300 微升 PBS 重悬细胞沉淀，用于流式细胞术分析。

对每个样品管进行检测，并至少采集10,000个F4/80阳性细胞的事件数据。以下是来自年轻组和老龄组的腹腔巨噬细胞的荧光图像，红色荧光代表F-actin。

绿色代表表达EGFP的大肠杆菌（E.coli），蓝色代表DAPI染色的细胞核。这些图像表明，来自年轻小鼠的巨噬细胞比来自年老小鼠的巨噬细胞具有更强的吞噬能力。F4/80阳性且EGFP阳性的细胞表明了巨噬细胞的吞噬能力。

这些结果与荧光显微镜结果的趋势一致。可以看出，尽管在老年小鼠中先天免疫细胞的数量可能得以维持，但其吞噬能力与年轻小鼠相比显著下降。已有多种方法被用于评估巨噬细胞的吞噬作用。

本文展示了一种改进的方法，该方法简便、快速且具有经济可行性。利用表达EGFP的大肠杆菌（E.coli），研究者可根据自身偏好，通过流式细胞仪或荧光显微镜轻松进行吞噬作用检测并定量分析。此外，该方法可直接测定细胞的吞噬能力。

与其他间接方法相比，该结果具有更高的可重复性。