Name: hiv 转录和拼接中延迟逆转剂的高通量体外评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录和剪接影响的方法。该技术使用双荧光报告基因系统，可同时检测LRA对病毒转录和剪接的作用，为清除潜伏病毒库提供研究工具。

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本研究工作得到了澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）项目资助 APP1129320 和项目计划资助 APP1052979 的支持。我们感谢 Adam Wheatley 博士、Marina Alexander 博士、Jenny L. Anderson 博士以及 Michelle Y. Lee 提供了完成本研究所需的关键载体和宝贵建议。我们还感谢 DMI 流式细胞术平台工作人员在本研究所用流式细胞仪的维护过程中提供的专业建议和大力支持。

注意：克隆、转化和测序的相关操作步骤在其他文献中有详细讨论18,19。本文所述实验方案从转染哺乳动物表达载体开始（图3）。
1. 使用双色报告基因质粒转染 HEK293T 细胞
<ol>
	<li>在含有10% (v/v) 胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2 培养箱中培养HEK293T细胞。解冻后，将HEK293T细胞传代2-3次后再用于转染实验，以使细胞有足够时间从冻存复苏过程中恢复。 
	注意：支原体污染细胞培养物仍然是一个严重问题。良好的实验室操作规范和对细胞培养物进行常规检测对于降低支原体污染风险并防止其扩散至关重要20。</li>
	<li>接种前一天以1:2比例传代细胞，并将其转移至新鲜DMEM培养基中，在37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养24小时。</li>
	<li>转染前一天，通过抽吸法移除培养瓶中的培养基，并用不含钙离子（Ca2+）和镁离子（Mg2+）的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞，以去除残留的血清。</li>
	<li>向培养容器中加入5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05% - 10 mM，溶于PBS），然后置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育2至5分钟。</li>
	<li>当细胞脱落后，加入5 mL含10% (v/v) FBS的DMEM培养基，以进一步抑制可能损伤细胞的胰蛋白酶活性。</li>
	<li>通过上下吹打轻轻重悬细胞，以打散细胞团块。</li>
	<li>用台盼蓝染液（0.4%）将细胞按1:10比例稀释。</li>
	<li>使用显微镜（10倍物镜）和血细胞计数板计数未摄取台盼蓝的活细胞。</li>
	<li>取细胞计数的平均值，乘以10,000及台盼蓝染色的稀释倍数（1:10），计算出每毫升中的活细胞数量。</li>
	<li>在96孔平底板中，每孔接种2 × 104 个细胞，加入100 μL含10% FBS但不含抗生素的DMEM培养基，培养24小时。</li>
	<li>对于每个孔，将400 ng pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed、20 ng pCMV-RevNL4.3 和100 ng pCMV-Tat101AD8-Flag DNA溶于50 μL无血清培养基中进行稀释，轻轻混匀。对于不使用Tat的实验组，使用匹配的空载体pcDNA3.1 (-)。 
	注意：强烈建议使用无内毒素DNA。为此，应使用中量或大量核酸纯化试剂盒制备无内毒素DNA，并通过测定260/280 OD比值来确定DNA纯度，该比值应在1.7至1.9之间。</li>
	<li>使用前轻轻混匀脂质试剂，然后将0.65 μL脂质试剂加入50 μL无血清培养基中稀释，轻轻混匀后室温孵育5分钟。</li>
	<li>将稀释后的DNA与稀释后的脂质试剂混合。</li>
	<li>轻轻混匀后室温孵育20分钟。溶液可能出现浑浊。 
	注意：请在30分钟内进入步骤1.15。</li>
	<li>将脂质试剂-DNA复合物以每孔100 μL的量逐滴加至细胞表面。</li>
	<li>通过前后轻轻摇动培养板使液体混匀。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2 湿润培养箱中孵育5小时。
	<ol>
		<li>每份反应混合物足以完成一个孔（96孔板）的转染。根据拟测试的药物及组合数量调整各组分的用量和体积，并考虑移液误差。所有条件通常均设三个重复。</li>
		<li>为补偿目的，额外转染若干孔，每孔加入100 ng由CMV启动子驱动的EGFP和DsRed-Express质粒DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用潜伏期逆转剂处理转染的 HEK293T 细胞
注意：每次实验前，需通过细胞增殖实验测定细胞在高剂量和低剂量药物处理后的存活率，以评估每种LRA的生理状态。
<ol>
	<li>用生长培养基将每种LRA稀释至适当的工作浓度（例如, 1 μM（用于JQ1(+)） 
	注意： 将冻干药物用适当的溶剂重悬至10 mM的浓度。所有储存液应分装为单次使用量（每份5 μL），于-80 °C保存，以避免反复冻融。</li>
	<li>小心使用多通道移液器吸除转染培养基，并替换为含有适当LRA的100 μL新鲜培养基（表1）。添加培养基时应沿孔壁非常轻柔地加入，以避免脱落已转染的HEK293T细胞，此类细胞已知容易从培养板表面脱落。</li>
	<li>将培养板在5% CO₂条件下孵育48 h2 37 °C 恒温培养箱中加湿培养。</li>
</ol>
3. 用于流式细胞术分析的转染细胞可固定活力染料染色
注意：去除死细胞和碎片对于消除假阳性结果并获得最高质量的数据至关重要。
<ol>
	<li>使用每孔100 μL磷酸盐缓冲液（PBS）通过多通道移液器轻柔吹打约5次，使细胞脱离并悬浮于培养基中，注意避免产生气泡。如需要，可使用每孔35 µL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05% - 10 mM，溶于PBS）处理，在37 °C孵育5分钟，随后用含血清的培养基中和。</li>
	<li>将细胞转移至96孔V型底板。</li>
	<li>在4 °C、500 x g条件下离心5分钟，然后小心吸除上清培养基/PBS，避免接触细胞沉淀。</li>
	<li>用200 μL无蛋白/无血清的PBS至少洗涤细胞1次。</li>
	<li>在4 °C、500 x g条件下离心5分钟，然后倾斜板子，弃去上清液，移除洗涤缓冲液时避免接触细胞。</li>
	<li>通过将活死染料以1:1000比例稀释于无蛋白/无血清的PBS中，配制可固定的活死染料工作液。每孔准备50 µL稀释后的染料。 
	注意：活死染料有多种颜色可供选择，适用于蓝色、红色和紫色激光。通过将一管冻干染料（组分A）用50 μL无水DMSO（组分B）重悬，配制活死染料储存液。分装为单次使用量（每份1 μL），避光保存于-20 °C。</li>
	<li>向每孔加入50 μL稀释后的活死染料，使用多通道移液器上下吹打混匀细胞。</li>
	<li>在4 °C避光孵育10–15分钟。</li>
	<li>用150 μL洗涤缓冲液（含1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA的PBS）洗涤1–2次。</li>
	<li>在4 °C、500 x&#160;g&#160;条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在避光条件下，用100 μL新鲜配制的含1%甲醛的洗涤缓冲液于4 °C固定细胞10–15分钟。 
	注意：甲醛具有高毒性。配制1%甲醛溶液时应在通风橱内操作，并佩戴手套和护目镜，避免吸入。</li>
	<li>用100 μL洗涤缓冲液洗涤细胞1–2次。</li>
	<li>在4 °C、500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于70 μL洗涤缓冲液中。 
	注意：此处可暂停实验流程。固定后的细胞可在避光条件下于4 °C保存，次日进行流式细胞仪分析。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术进行EGFP和DsRed测量及数据分析
注意：使用流式细胞仪分析 HIV 转录（% EGFP）和剪接（% DsRed）。上机前使用 70 μm 细胞筛或 100 μm 尼龙网过滤样品，以避免堵塞喷嘴。
<ol>
	<li>使用前至少提前10分钟启动流式细胞仪和计算机，以确保激光器充分预热。</li>
	<li>在运行样品和开始数据采集之前，向鞘液箱中加入0.9%的生理盐水溶液，并确保在废液箱中加入一片次氯酸钠片剂。</li>
	<li>检查流动池中是否存在气泡。</li>
	<li>确认检测器和滤光片设置适用于本实验。 
	注意：对于EGFP，应使用蓝色激光（488 nm）和530/30带通滤光片；而DsRed Express的最佳检测条件为黄色激光（561 nm）和610/20带通滤光片。也可使用蓝色激光（488 nm）配合610/20带通滤光片检测DsRed的表达。</li>
	<li>通过运行校准微球检查各检测器的仪器性能和灵敏度。</li>
	<li>使用未染色样本调节前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）的电压，使主要细胞群位于屏幕可视范围内并清晰可辨。 
	注意：FSC（前向散射光）测量的是小角度光衍射，反映细胞体积（细胞表面积或大小）；SSC（侧向散射光）测量的是直角方向的光衍射，与细胞颗粒度及内部复杂性成正比。</li>
	<li>使用单染样本进行手动或自动补偿调节，确保EGFP阳性群体在DsRed检测通道中的溢出信号最小，反之亦然。 
	注意：进行补偿时，应使用分别表达单一荧光蛋白的细胞样本，以及仅用可固定活力染料单染的细胞样本。由于光谱特性不同，不得使用FITC和PE补偿微球对EGFP和DsRed荧光蛋白进行补偿。补偿对照样本的荧光强度应足够高，以明确区分阳性和阴性细胞群。</li>
	<li>利用荧光减一（FMO）对照创建图谱并设定门控。</li>
	<li>每份样本至少采集并记录10,000个活细胞事件。以中低流速运行样本，避免双联体（doublets）通过激光检测点。使用脉冲几何门控（如SSC-A对SSC-H）排除双联体。通过绘制时间对SSC-A的图谱检查运行稳定性，以评估进样过程中的流速均匀性。</li>
	<li>运行结束后，依次使用浓缩清洗剂和水各清洗流式细胞仪流路系统5分钟。</li>
	<li>实验结束后关闭系统，倾倒废液，并重新填充鞘液箱。</li>
	<li>使用流式细胞术数据分析软件进行数据分析。根据前向散射和侧向散射排除细胞碎片和聚集体（双联体），然后利用活力染料染色排除死细胞（阴性群体为活细胞）。鉴定表达EGFP和DsRed的细胞（图4），并计算剪接产物DsRed/(DsRed + EGFP)的百分比（图5）。</li>
	<li>通过比较未处理细胞与单独或联合暴露于潜伏期逆转剂（LRA）的细胞，评估LRA对HIV转录和剪接的影响（图5）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于在体外测量病毒再激活存在困难，长期以来已开发出多种体外模型用于研究HIV潜伏感染，包括潜伏感染的T细胞系（J-Lats、ACH2、U1）以及静息态（O'Doherty、Lewin、Greene和Spina模型）或预激活CD4+ T细胞（Sahu、Marini、Planelles、Siliciano、Karn模型）的原代潜伏感染模型，这些模型使用单周期或具有复制能力的报告病毒22。为了模拟HIV在静息CD4+ T细胞中潜伏的生理条件，相继开发了双荧光报告系统，例如Ivan Sadowski研究组开发的RGH（Red-Green-HIV）报告系统，该系统包含由LTR驱动的Gag-eGFP标记物以及由CMV启动子驱动、取代Nef的mCherry23。E. Verdin实验室开发了类似的双色报告病毒Duo-Fluo，其包含由LTR驱动的EGFP表达和由EF1α启动子驱动的mCherry荧光标记24。在该系统中，EGFP被插入前病毒3'端以取代Nef。这两个系统中包膜蛋白的缺失可防止多轮感染。此外，两...

尽管长期抗逆转录病毒治疗有效，HIV仍以整合前病毒的形式在记忆性CD4+ T细胞中处于潜伏状态1。HIV-1 5'长末端重复序列（LTR）启动子的染色质结构以及DNA甲基转移酶（DNMT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）介导的组蛋白甲基化和去乙酰化等表观遗传修饰，是导致转录抑制和整合后潜伏的重要机制2,3。已有大量潜伏逆转剂（LRAs）被研究用于评估其在体外和体内诱导潜伏感染的静息CD4+ T细胞产生病毒的能力4,5,6,7,8。在已测试的LRAs中，HDAC抑制剂（HDACi）和BET溴结构域抑制剂（BETis）分别通过诱导染色质去凝集和释放正性转录延伸因子b（P-TEFb），从而缓解5'LTR处的转录抑制并激活HIV表达9,10,11,12,13。然而，这些LRAs诱导的再激活程度有限，仅在体外观察到细胞相关未剪接HIV mRNA（US RNA）——即病毒转录的标志——出现轻微增加14,15。更重要的是，这些LRAs也未能减少潜伏感染细胞的频率。
HIV的表达可能进一步受到剪接效率低下16以及完全剪接的HIV RNA（MS RNA）核输出缺陷17的限制。因此，需要鉴定出效力更强、并能影响整合后病毒产生不同环节的新型潜伏期逆转激活剂（LRAs）。此外，还需要开发新型检测方法，以帮助确定能够高效逆转潜伏状态的最佳化合物。
本文介绍了一种高通量方法的实验方案，用于功能性评估干预措施对HIV LTR驱动的转录及剪接的影响。简言之，本研究建立了一种新型LTR驱动的双色报告系统pLTR.gp140/EGFP.RevΔ38/DsRed（图1用于通过流式细胞术评估HIV再激活。在此荧光报告系统中，未剪接HIV mRNA（4 kb）的表达会驱动增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，而剪接mRNA（2 kb）的表达则会导致 Discosoma sp. 红色&#160;(DsRed)&#160;荧光蛋白表达。简言之，我们使用了一种荧光Env-EGFP融合蛋白gp140unc.EGFP，其中EGFP的编码序列与一种未切割且截短的包膜蛋白（Env）序列保持读框一致。通过引入突变消除切割位点，阻止Env蛋白裂解为gp120和gp41-EGFP；同时在跨膜区之前对gp160蛋白进行截短，从而产生一种可溶性的Env类似物，有助于EGFP的正确折叠与表达。当在细胞内表达时，Rev蛋白定位于细胞核，在此介导4 kb 环境 mRNA通过与rev应答元件（RRE）的相互作用进行表达。Env的截短并不影响位于gp120与gp41之间以及A7 3'剪接位点的RRE。在此系统中，HIV-1剪接供体4（SD4）与剪接受体7（SA7）的剪接导致产生一条2 kb的mRNA，编码一种在第38位氨基酸处截短的无功能Rev蛋白，并与DsRed荧光蛋白融合，即RevΔ38-DsRed。简而言之，DsRed被插入到2nd Rev基因第38位氨基酸的外显子通过重叠延伸法18为促进未剪接mRNA的核输出，使用编码Rev的哺乳动物表达载体（pCMV-Rev）NL4.3) 与荧光报告基因质粒（图2该文所描述的这种独特报告基因载体可用于高效评估HIV转录与剪接，且无需使用病毒载体。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞（人胚胎肾细胞）</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>可复制携带 SV40 复制区的载体。</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM 1x + GlutaMAX-I）</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>含 4.5 g/L D-葡萄糖 + 110 mg/L 丙酮酸钠</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>来源：澳大利亚</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙、无镁</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>脂质转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM I（1x）低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>无血清培养基</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 质粒</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>在哺乳动物细胞中表达 EGFP，由 CMV&lt;sub&gt;IE&lt;/sub&gt; 启动子驱动。</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>632429</td><td>在哺乳动物细胞中表达 DsRed-Express，由 CMV&lt;sub&gt;IE&lt;/sub&gt; 启动子驱动。</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Rev&lt;sup&gt;NL4.3&lt;/sup&gt;</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101&lt;sup&gt;AD8&lt;/sup&gt;-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11232</td><td>以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>以 DMSO 配制为 100 &amp;mu;g/mL 储存液；工作浓度为 10 nM</td></tr><tr><td>植物血凝素（PHA）</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>以 PBS 配制为 1 &amp;mu;g/&amp;mu;L 储存液；工作浓度为 10 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>伏立诺他（VOR）</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009929</td><td>以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 0.5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>帕比司他（PAN）</td><td>TRC</td><td>P180500</td><td>以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>支原体检测试剂盒，基于 PCR 方法</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;流式细胞术试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪（4 激光器：蓝色、红色、紫色和黄色）</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪（3 激光器：蓝色、红色和紫色）</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>活力染料：适用于 633 或 635 nm 激发，共 400 次检测。试剂盒内含组分 A 和 B。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液 37/10（37%）</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS&amp;T 研究用微球</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>校准微球</td></tr><tr><td>Sphero 彩虹校准微粒（8 峰）</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3.0 - 3.4 mm</td></tr><tr><td>鞘液</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>10 L 水中含 90 g NaCl</td></tr><tr><td>HAZ-Tabs</td><td>Guest Medical</td><td>H8801</td><td>释放氯的消毒片剂</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N/A</td><td>流式细胞仪专用浓缩清洗剂。工作液为 5% Decon 90。</td></tr><tr><td>次氯酸钠（12-13% 溶液）</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>流式细胞仪专用浓缩清洗剂。工作液为 1% 漂白液。</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>流式细胞仪专用浓缩清洗剂。工作液为 1% 7x。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶（75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，斜颈，带透气盖）</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板（96 孔平底，带盖）</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板（96 孔 V 形底，无盖）</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>离心管（10 mL）</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（25 mL），无菌</td><td>Corning</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（10 mL），无菌</td><td>Corning</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（5 mL），无菌</td><td>Corning</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽（50 mL），无菌</td><td>Corning</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网盖</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm 规格，70 mm</td></tr><tr><td>尼龙筛网</td><td>SEFAR</td><td>03-100/32</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Titertube 微量测试管，散装</td><td>BIO-RAD</td><td>2239391</td><td>微流式细胞管</td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯试管，无盖</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>12x75 mm 规格</td></tr><tr><td>12x75 mm 试管密封盖</td><td>Corning</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>计数室，改进型 Neubauer 双网格刻度，亮线（血球计数板，LO-Laboroptik）</td><td>ProSciTech</td><td>SVZ4NIOU</td><td>3x3 个大格，每格 1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;；深度 0.100 mm；体积 0.1 mL；最小面积 0.0025 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>盖玻片（Menzel-Gl&amp;auml;ser）</td><td>Grale Scientific</td><td>HCS2026</td><td>20 x 26 mm</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>5810R 冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5811000487</td><td>配备 A-4-81 转子，含适用于 15/50 mL 锥形管的适配器</td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 微孔板读板仪</td><td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>用于细胞增殖检测的微孔板读板仪。滤光片：490 nm。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;流式细胞仪数据采集与分析软件，版本 8.0.1&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>&lt;em&gt;流式细胞仪数据分析软件，FlowJo Engine v3.05481&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>&lt;em&gt;FLUOstar 多用户读板仪控制软件，版本 5.11&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Omega - 数据分析</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><td>&lt;em&gt;FLUOstar 数据分析软件，版本 3.20R2&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Excel:mac 2011</td><td>&lt;em&gt;版本 14.0.0&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>&lt;em&gt;版本 7.0c&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

高通量体外评估潜伏逆转剂对hiv转录与剪接的影响

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

由于存在一类细胞库，其内藏有稳定且潜伏形式的病毒，这些病毒对免疫系统不可见，也无法被当前的抗逆转录病毒疗法（cART）所清除，因此艾滋病至今无法治愈。研究表明，转录与剪接过程在静息CD4+ T细胞中可加剧HIV-1的潜伏状态。通过使用潜伏逆转剂（LRAs）逆转潜伏状态，是实现“激活并清除”策略的关键步骤 &#34;休克与清除&#34; 该方法已被广泛研究，旨在清除这一潜伏库，但由于缺乏能够有效干扰该潜伏库的合适小分子，迄今为止在临床试验中尚未取得成功。本文所述方案提供了一种可靠且高效评估潜伏逆转剂（LRAs）对HIV转录和剪接作用的方法。该方法基于使用由LTR驱动的双色报告系统，可通过流式细胞术同时检测潜伏逆转剂对转录和剪接的影响。本方案适用于贴壁细胞和悬浮细胞，可用于高通量系统中大量药物的筛选。该方法技术操作简便且成本效益高。此外，结合流式细胞术的应用，可同时评估细胞活力，从而判断药物毒性。

代表性结果如图所示 图5 用于检测溴结构域抑制剂JQ1处理后HIV-1未剪接（EGFP）和剪接（DsRed）产物的表达。JQ1(+)和Tat均显著增加了表达EGFP的细胞比例（相对于DMSO分别为2.18倍和4.13倍；n = 3），提示未剪接转录本的增加。此外，JQ1(+)还显著提高了表达DsRed的细胞比例（相对于DMSO为46.6倍）以及剪接产物的比例（相对于DMSO为7.37倍），其水平与Tat处理组相当（分别为DMSO的59.6倍和5.83倍），证实JQ1(+)具有激活HIV转录和剪接的能力。另一方面，使用立体异构体对照JQ1(-)处理则消除了JQ1(+)对HIV转录和剪接的影响，验证了本实验方案的成功。
在最近的一项研究中，我们通过RNA分析发现，在使用JQ1(+)处理后，HIV剪接转录本出现累积21。事实上，我们的数据显示，未剪接和...

本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

由于存在一类细胞库，其中藏有稳定且潜伏形式的病毒，能够逃避免疫系统的识别，因此艾滋病至今无法治愈……

本实验的总体目标是体外评估潜伏期逆转剂对 HIV mRNA 加工过程的影响。该方案提供了一种简单、高效且可靠的方法，可同时检测潜伏期逆转剂对 HIV 转录和剪接的影响。该技术有助于深入了解潜伏期逆转剂诱导病毒重新激活以及清除潜伏病毒库的能力。培养细胞后，取20,000个细胞加入含10% FBS、不含抗生素的100微升DMEM培养基中，接种于96孔平底板的孔内，培养24小时。次日，将双色报告基因质粒Tat和Rev DNA溶于50微升无血清培养基中，轻轻混匀。轻轻混匀脂质试剂，然后将每反应0.65 µL该试剂加入50 µL无血清培养基中稀释。轻轻混匀后，室温孵育5分钟。将稀释后的脂质试剂与稀释后的DNA混合，并轻轻混匀。室温孵育20分钟。然后，将100 µL该脂质试剂-DNA复合物逐滴加入每孔细胞表面。轻轻前后摇动培养板以混匀。将培养板置于加湿的培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5小时。孵育结束后，为补偿目的，用100纳克由CMV启动子驱动的EGFP和DsRed表达质粒转染额外的孔。首先，用生长培养基将每种潜伏期逆转剂稀释至适当的工作浓度。使用多通道移液头小心吸除转染培养基，并替换为含有适当潜伏期逆转剂的 100 微升培养基。在 37°C、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 48 小时。开始对细胞进行染色时，使用多通道移液头向每孔加入 100 微升 PBS。轻轻吹打液体，上下约5次，注意避免产生气泡，以使细胞脱离并悬浮于培养基中。随后，将细胞转移至96孔V型底培养板的孔中。在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。吸除上清液和PBS，注意不要触碰细胞。用200微升不含蛋白质和血清的PBS至少洗涤细胞一次。在4°C条件下以500 × g离心5分钟。倾斜培养板以弃去上清液，在不接触细胞的情况下移除洗涤缓冲液。随后，将固定的活力染料按1:1000的比例溶于无蛋白和无血清的PBS中，配制工作液。向每个孔中加入 50 µL 稀释后的染料，上下吹打混匀。在 4 °C 避光孵育 10 至 15 分钟，孵育时用铝箔包裹以避光。随后用150微升洗涤缓冲液洗涤细胞一至两次。然后在4摄氏度、500 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。固定细胞时，加入100微升 freshly prepared 1%甲醛和洗涤缓冲液。在避光条件下于 4°C 孵育 10 至 15 分钟。随后，用 100 µL 洗涤缓冲液洗涤细胞一次或两次。在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 70 µL 洗涤缓冲液中。通过运行校准微珠检测流式细胞仪的设置性能和灵敏度后，使用未染色样本调整前向散射和侧向散射电压，使主细胞群位于屏幕内且清晰可辨。使用单染样本进行手动或自动补偿，确保 EGFP 阳性群体在 DsRed 检测通道中的溢出最小，反之亦然。利用荧光减一对照创建图谱并设定门控。接着，使用未染色样本调整前向散射和侧向散射电压，使主要细胞群位于屏幕可视范围内且清晰可辨。每份样本至少采集并记录 10,000 个活细胞事件。此后，使用流式细胞术数据分析软件，按照文本方案中所述分析数据。在使用溴结构域抑制剂 JQ1 处理后，HIV-1 未剪接和剪接产物表达的代表性结果表明，JQ1 阳性组和 Tat 组均显著增加了表达 EGFP 的细胞百分比，这提示未剪接转录本的表达增加。JQ1阳性也被发现能显著增加表达DsRed的细胞百分比，并使剪接产物的比例提升至与Tat相似的水平。这证实了JQ1阳性具有激活HIV转录和剪接的能力。然而，使用立体异构体对照物 JQ1 负性处理，则会消除 JQ1 对 HIV 转录和剪接的阳性作用。一旦掌握该方法，即可单独或联合使用药物进行实验，并检测其协同作用的效率。这将导致药物剂量和毒性的降低。每次技术进步之后，该方法为在患者离体样本的原代潜伏模型中测试高效的药物组合铺平了道路。

high-throughput-vitro-assessment-latency-reversing-agents-on-hiv

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

hiv 转录和拼接中延迟逆转剂的高通量体外评价

脱壳是HIV-1生命周期早期阶段的关键步骤，定义为衣壳壳体的解离以及病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的释放。本文展示了从HIV-1病毒颗粒中分离完整核心以及定量其脱壳过程的技术 体外.

体外 HIV-1 核心颗粒的脱壳

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp.

逆转录酶活性作为类病毒颗粒产生的标志物

本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1...

快速筛选HIV逆转录酶和整合酶抑制剂

HIV-1 发病机制由病毒特性与宿主遗传因素共同决定。本文介绍一种可靠的方法，可实现可重复的测量，用于评估 gag 基因序列变异在 体外...

一种基于限制性内切酶的克隆方法用于评估 体外 HIV-1 C亚型Gag-MJ4嵌合病毒的复制能力

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。...

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

本报告描述了一种 体外 用于测定急性感染细胞胞质提取物中人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）前整合复合物（PIC）相关整合活性的检测方法。通过巢式实时定量聚合酶链式反应策略，定量分析PIC相关HIV-1 DNA整合至异源靶DNA的过程。...

测量 体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本方案提供了一种通过向经辐射处理的新生NSG小鼠肝内注射人源造血干细胞来建立人源化小鼠（hu-NSG）的方法。hu-NSG小鼠可感染HIV，并对联合抗逆转录病毒治疗（cART）具有响应，是研究HIV复制与潜伏的理想病理生理模型。...

人源化 NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 小鼠模型在 HIV 复制与潜伏研究中的应用

本文介绍一种深度测序方法，可无偏倚地确定新生3'末端以及单链DNA分子的突变谱型。该方法的主要应用是表征新生逆转录病毒互补DNA（cDNA），即逆转录病毒逆转录过程中产生的中间产物。...

确定感染细胞中HIV-1逆转录过程中新生单链病毒DNA的3'-末端及其序列

本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。...

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

了解高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录和剪接影响的方法。该技术使用双荧光报告基因系统，可同时检测LRA对病毒转录和剪接的作用，为清除潜伏病毒库提供研究工具。

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

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