单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化
2019年1月7日
该协议描述了用低温电子显微镜测定离子通道结构的技术, 包括用于以最小的努力和毒性在哺乳动物细胞中有效表达基因的杆菌病毒系统, 蛋白质提取、纯化、和质量检查, 样品网格的制备和筛选, 以及数据的收集和处理。
该协议使我们能够解决人类TRPC3的结构，一个重要但研究不足的离子通道家族的成员。该技术的主要优点是，在结构和功能研究中，可以应用高效来表达和纯化各种蛋白质。该方法可提供有效的蛋白质表达和纯化系统，用于研究蛋白质生物化学和生物物理，并可应用于多种离子通道和其他膜蛋白。
首先，通过查看病毒生成培养的样本中的病毒的 GFP 荧光来检查相对病毒表达。在一个困惑的底部 Erlenmeyer 培养瓶足够大小， 准备一个 HEK293 哺乳动物细胞悬浮培养物的理想的体积， 浓度为 350 万至 380 万细胞每毫升在表达介质中， 辅以 1% 无菌 FBS.加入8%的P2病毒库存溶液，并在37摄氏度和135 RPM的轨道摇床中孵育。
感染后12至18小时加入10毫摩尔钠，在30摄氏度下孵育，达到最佳蛋白质表达所需的时间。在此之后，离心机在2，880倍重力20分钟收获细胞。每升收获的细胞中大约100毫升TBS中清洗和重新暂停细胞。
在重力2，880倍下再次离心20分钟，并收集细胞颗粒。还要收集小，一毫升细胞颗粒收获在不同的时间点，溶解两个小时在四摄氏度与搅拌在不同的洗涤剂和/或添加剂的存在。通过超离心在23.5万倍重力下和在4摄氏度下10分钟，通过超离心来澄清这些小全细胞溶解样品。
然后，将它们作为 30 微升样品运行在 SEC 色谱柱上，以确定表达式的最佳时间和最佳溶解条件。每升收获的细胞中，将颗粒解冻100毫升缓冲液。一旦细胞解冻，移液器或搅拌它们，以确保溶液是均匀的。
让细胞在摄氏四度时在烧杯中溶解，在冰中浸入两个小时，同时被搅拌棒搅拌。接下来，在重力23.5万倍和摄氏4度的超中心离，清除任何细胞碎片，一小时。HPLC 在 SCC 列上运行 30 微升的上清液样本，以验证蛋白质数量，并通过 GFB 信号输出可视化目标蛋白质。
将含有溶解蛋白的钴亲和树脂结合上清液应用到重力柱上，并收集流经。在 SCC 柱上运行流经的 30 微升样本，以验证蛋白质与树脂是否结合。然后，用10列缓冲液清洗树脂。
在 SCC 柱上运行 30 微升洗涤样本，以检查蛋白质损失。使用缓冲液，对树脂结合的人类TRPC3进行成型。运行在 SSC 柱上稀释 1 到 100 的洗液的 90 微升样品，以检查蛋白质是否已被洗洗，并验证与目标蛋白质大小对应的位置是否存在 GFP 信号。
以 1 到 20 摩尔的比例添加血栓，并将 EDTA 的 10 毫摩尔添加到洗洗样品中。在四摄氏度下孵育三小时。在此之后，将 Eluant 转移到 15 毫升离心过滤管。
在重力2，800倍和4摄氏度的增量下旋转管，将水液浓缩到500微升或更少。在旋转之间上下移液蛋白质溶液，以重新暂停蛋白质，防止过度浓缩。将浓缩物加载到缓冲区中的 SSC 列上。
运行快速蛋白质液相色谱，收集300微升分数。然后，将包含 TRPC3 四面体的峰值分数组合为 UV 吸光信号可视化。并再次浓缩到每毫升至少5毫克的最终浓度。
人类TRPC3是全细胞溶解在各种洗涤剂中，临界微摩尔浓度为0.01至20微摩尔，并在含有缓冲液的DDM/CHS中运行。虽然 DDM/CHS 显示人类 TRPC3 的最高溶解度，但峰值位置看起来太大，不能成为四元人类 TRPC3。整个细胞溶解后，细胞溶解碎片被去除，溶解蛋白被加载到SSC柱上，在含有缓冲液的DDM/CHS洗涤剂中运行在HPLC上，以比较与TRPM4控制相比的不同条件下人类TRPC3的绝对溶解度和峰值体积。
所有不同的洗涤剂溶解TRPC3样品都显示峰值位置在11.9毫升左右，这很可能是太大的，因为人类TRPC3的四元形式分子量小于阳性人体控制TRPM4。然后测试两种不同的溶解和运行包含 DDM/CHS 和 digitonin 的缓冲区。蛋白质在含有数字素的缓冲液中运行，相对于正对照，在合理位置产生最高峰值。
虽然使用25毫升细胞进行小规模纯化，显示了几个宽阔的峰值，但蛋白质通过负染色显示单四边形人类TRPC3通道在2D分类中的特征。然后根据人类TRPC3的生理特性对添加剂进行筛选。EDTA 对将人类 TRPC3 稳定在完整的四元峰值位置具有显著影响，显著增加了低温-EM 显微图中的粒子数量，并降低了背景中的噪声。
最终结果的质量取决于对 HPLC 上的 FSCC 配置文件进行良好的故障排除。在快速完成所有净化步骤时，理想情况下，在一天。结构测定、抗体生成和功能研究，如结合测定或电生理学，可以在此过程后进行。
该技术可以而且已经用于研究其他离子通道和蛋白质系列，并生产纯化蛋白质，用于结构测定以外的应用。应采取适当的预防措施，管理细胞培养生物危害，如在层流罩中工作，穿着防护服，以及妥善处理废物。
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概述
本协议描述了通过冷冻电子显微镜确定离子通道结构的技术，重点关注哺乳动物细胞中基因的高效表达。它包括蛋白质提取、纯化和质量检查的方法，以及样品网格的准备和数据收集。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 结构生物学
- 生物物理学
背景
- 离子通道对各种细胞功能至关重要。
- TRPC3是离子通道家族中研究较少的成员。
- 冷冻电子显微镜是一种用于结构测定的强大工具。
- 高效的蛋白质表达系统对于研究膜蛋白至关重要。
研究目的
- 解决人类TRPC3的结构。
- 开发蛋白质表达和纯化的高效方法。
- 促进蛋白质生物化学和生物物理学研究。
使用的方法
- 使用杆状病毒系统在哺乳动物细胞中进行基因表达。
- 蛋白质提取和纯化技术。
- 为冷冻电子显微镜准备样品网格。
- 进行结构分析的数据收集和处理。
主要结果
- 成功表达和纯化了TRPC3蛋白。
- 为冷冻电子显微镜准备了高质量样品。
- 获得了TRPC3离子通道的结构洞察。
- 证明了该协议对各种膜蛋白的效率。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来研究离子通道。
- 它增强了对TRPC3和类似蛋白质的理解。
- 在膜蛋白的结构和功能研究中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Determining the structure of ion channels like TRPC3 enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in cardiovascular, neurodegenerative, and neurologic diseases. This protocol provides a scalable expression and purification system for mammalian membrane proteins, supporting target validation and lead identification efforts. By facilitating high-resolution structural insights, it improves predictive confidence in early discovery decisions for ion channel modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TRPC3 gating mechanisms and functional target validation in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides purified protein for biochemical and biophysical assays to support hypothesis testing.
- Predictive Value: Structural data informs rational design of modulators and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified TRPC3 supports development of binding assays and functional readouts for compound screening.
- Operational Value: Standardized purification yields homogeneous protein suitable for assay reproducibility and scalability.
- Platform Utility: The baculovirus-HEK293 system can be adapted to other ion channels, enabling reusable infrastructure for membrane protein studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Structural insights link TRPC3 biology to disease phenotypes in cardiovascular and neurologic disorders.
- Operational Value: Purified protein enables preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
- Risk Mitigation: Early structural data supports go/no-go decisions by clarifying target druggability and safety risks.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for ion channel-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via structural and functional analysis of TRPC3.
- Screening: Purified protein enables assay development for high-throughput or secondary screening of ion channel modulators.
- Analytics: Cryo-EM and purification outputs provide quantitative structural and biophysical measurements for lead optimization.
- Translational Research: Structural data connects target biology to disease mechanisms, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: The expression and purification platform is adaptable across ion channel families, reducing redundant development efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution structure enables mechanistic understanding of TRPC3 function and modulation.
- Operational Value: Scalable expression and purification ensure reproducibility and material supply for downstream studies.
- Strategic Value: Informs early go/no-go decisions by reducing biological risk in ion channel target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TRPC3 and related ion channel targets in discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, baculovirus systems, and membrane protein biochemistry.
- Dependent on access to ultracentrifugation, affinity chromatography, HPLC, and cryo-EM instrumentation.
- Needs standardization across teams for detergent selection, solubilization conditions, and purification timing.
- Must account for protein stability challenges in different lipid environments and additive screening (e.g., EDTA).
- Practical limitations include time-sensitive purification steps and the need for rapid processing to maintain sample integrity.
