Name: 单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习利用杆状病毒系统在HEK293细胞中高效表达和纯化人源TRPC3离子通道蛋白的方法，通过冷冻电镜技术解析其高分辨率三维结构，为膜蛋白结构生物学研究提供可靠的实验方案。

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我们感谢G. Zhao和X. Meng在David Van Andel高级冷冻电子显微镜平台进行数据收集时提供的支持。感谢VARI高性能计算团队在计算方面提供的支持。我们衷心感谢N. Clemente、D. Dues、J. Floramo、Y. Huang、Y. Kim、C. Mueller、B. Roth和Z. Ruan对本手稿提出的宝贵意见，这些意见极大地改进了本文。我们感谢D. Nadziejka为本手稿提供的编辑支持。本工作由VARI内部经费资助。

1. 转化DH10α感受态细胞以制备Bacmid DNA
<ol>
	<li>合成目标基因，并将其亚克隆至一种改良版 pEG 载体中，该载体包含一个双链霉亲和素标签（twin strep-tag）、一个 His8 标签以及带有凝血酶切割位点的绿色荧光蛋白（GFP），位于 N 末端（pFastBacI）20。</li>
	<li>取 5 ng 含有所需基因的 pFastBacI 质粒加入到 1.5 mL 离心管中的 50 μL DH10α 感受态细胞中，冰上孵育 10 分钟；随后在 42 °C 热激 45 秒；加入 200 μL 含分解抑制物的超优肉汤（SOC）培养基，于 37 °C、225 rpm 摇床中孵育 4–8 小时。</li>
	<li>取 5 μL 菌液涂布于含 bacmid 的 LB 琼脂平板（含 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 妥布霉素、10 μg/mL 四环素、100 μg/mL Bluo-gal 和 40 μg/mL 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 [IPTG]）上。</li>
	<li>将平板于 37 °C 培养 48 小时。 
	注意：Bluo-gal 指示剂可使仍表达 lacZ 的菌落显色（表明载体插入失败），从而便于筛选出白色菌落（转化成功）。</li>
	<li>仔细挑选一个孤立的白色菌落，避免选择与蓝色菌落接触的白色菌落，将菌液接种于 6 mL bacmid LB 培养基（含 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 妥布霉素、10 μg/mL 四环素）中，于 37 °C、225 rpm 摇床中过夜培养。</li>
</ol>
2. 杆菌DNA分离用细菌的制备
<ol>
	<li>为分离杆状病毒DNA，将大肠杆菌（Escherichia coli）细胞在2880 × g 条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用移液器将沉淀重悬于200 µL质粒小提试剂盒中的细胞重悬液（见材料表）中。确保沉淀完全且均匀地悬浮。随后将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>加入200 µL质粒小提试剂盒中的细胞裂解液，通过反复倒置离心管数次进行混匀。室温（RT）孵育最多5分钟以裂解细胞。然后加入200 µL质粒小提试剂盒中的中和液，再次通过倒置离心管数次混匀，以终止裂解反应。</li>
	<li>在台式离心机中以21,130 × g 离心10分钟。收集600 μL上清液至2 mL离心管中。加入600 μL酚:氯仿:异戊醇溶液（见材料表），充分混匀，以从剩余的细胞裂解产物中提取DNA。 
	警告：酚:氯仿:异戊醇溶液吸入、皮肤接触或吞咽后具有毒性，可导致化学灼伤，可能具有致癌性。操作时需佩戴手套和扣好纽扣的实验服，在通风橱内进行，并妥善处理此类危险废弃物。</li>
	<li>在台式离心机中以21,130 × g 离心10分钟。此时可见两个分离的液相。小心吸取300 μL上层水相转移至新离心管中。加入600 μL 100%乙醇以洗涤DNA，轻轻倒置混匀。 
	注意：切勿涡旋振荡，以免剪切杆状病毒DNA。</li>
	<li>将离心管置于-20 °C冰箱中冷却10分钟。在台式离心机中以21,130 × g 离心10分钟。弃去上清液，保留DNA沉淀。</li>
	<li>加入1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，轻轻倒置混匀。在台式离心机中以21,130 × g 离心10分钟。弃去上清液，将沉淀在空气中晾干约5分钟，或直至管内无可见液体，DNA沉淀变为半透明。</li>
	<li>将干燥的沉淀重悬于50 µL无菌、无DNase、去离子水中。测定DNA浓度。 
	注意：切勿冷冻保存杆状病毒DNA，可在4 °C保存数天。</li>
</ol>
3. 用杆状病毒质粒转染Sf9昆虫细胞以产生P1杆状病毒
<ol>
	<li>种子 0.9 × 106 Sf9细胞/孔，每孔加入2 mL适宜培养基（参见 材料表在6孔组织培养板的每个孔中加入。在27 °C孵育20分钟，以促进细胞贴壁。 
	警告：细胞培养物具有潜在生物危害。实验前，请在经认证的层流罩内使用无菌技术操作，并查阅机构及政府指南，确认推荐的防护服穿着要求以及废弃物的正确处理方式。</li>
	<li>贴壁后，加入 8 µL 转染试剂（参见 材料表将每孔100 µL培养基加入无菌管中，用于转染6孔板的每个孔。另取一无菌管，加入6 μg杆状病毒DNA至100 µL培养基中。室温孵育5分钟。将两种溶液混合，室温孵育45分钟。</li>
	<li>在6个孔中更换为2 mL新鲜培养基。将上一步的混合液逐滴加入每孔（每孔200 µL）。轻轻摇动培养板，确保转染溶液与培养基充分混匀。 
	注意：不要晃动或振荡培养板，因为这会导致细胞脱落。</li>
	<li>在27 °C的湿润培养箱中孵育细胞5天（120小时）。收获前检查GFP荧光，以确认大部分细胞正在产生病毒；如果阳性细胞比例较低，可根据需要延长孵育时间（参见 图1C).</li>
	<li>收集含有P1病毒的上清液（每孔约2 mL）。使用3 mL注射器和小型0.2 µm滤器将含有P1病毒的培养基过滤至2 mL离心管中。加入无菌胎牛血清（FBS），使其终浓度为1%。 
	注意：P1 病毒储备液应保存在 4 °C，避光。</li>
</ol>
4. 用 P1 杆状病毒转染 Sf9 昆虫细胞以产生 P2 杆状病毒
<ol>
	<li>在适当培养基（参见材料表）中，于足够大小的平底锥形培养瓶中制备200 mL（或所需体积）Sf9细胞，细胞浓度为0.8 - 0.9 × 106 个细胞/mL。 
	注意：进行悬浮培养时，所用液体体积不应超过培养瓶总容量的40%。</li>
	<li>将3.5步骤中获得的P1病毒原液按1:2500（v/v）比例加入Sf9细胞悬浮培养物中。在27 °C、115 rpm条件下于摇床中孵育，孵育时间根据目标蛋白构建体而定，通常为48 - 120小时，以达到最佳病毒表达水平。 
	注意：可通过观察培养样品中病毒的GFP荧光来判断相对病毒表达水平。</li>
	<li>将细胞悬浮液在11,520 × g 条件下离心40分钟，收集含有P2病毒的上清液。使用一次性0.2 µm滤器过滤上清液，并加入FBS至终浓度为0.5%。 
	注意：此P2病毒原液应保存于4 °C，并避免光照。</li>
	<li>使用Sf9easy细胞或病毒计数仪测定P2病毒的滴度。</li>
</ol>
5. 利用P2杆状病毒感染HEK293哺乳动物细胞进行大规模蛋白表达
<ol>
	<li>在足够大小的带挡板底锥形培养瓶中，使用表达培养基（见材料表）配制所需体积的HEK293哺乳动物细胞悬浮培养液（建议用于制备冷冻网格的体积为4–6 L），细胞浓度为3.5–3.8 × 106 个细胞/mL，并添加1%（v/v）无菌胎牛血清（FBS）。 
	注意：进行悬浮培养时，所用液体体积不应超过培养瓶总容积的40%。</li>
	<li>将步骤4.3中获得的P2病毒储存液按8%（v/v）比例加入HEK293细胞悬浮液中，于37 °C、135 rpm的摇床中孵育。</li>
	<li>感染后12–18小时，加入10 mM丁酸钠，在30 °C继续孵育至蛋白表达达到最佳时间（通常为36–72小时）。</li>
	<li>以2,880 × g离心20分钟收集细胞。每升收获的细胞用约100 mL的Tris缓冲盐水（TBS）重悬洗涤一次，再以2,880 × g离心20分钟，收集细胞沉淀。 
	注意：本步骤可暂停。细胞沉淀可迅速在液氮中冷冻，并于-80 °C保存，直至进行纯化。 
	警告：液氮可能导致低温灼伤或损伤，可能引起冻伤，也可能置换氧气导致迅速窒息。操作时应佩戴防寒隔热手套和面罩。</li>
	<li>在不同时间点分别收集1 mL小量样品，在4 °C条件下加入不同去垢剂和/或添加剂，通过振荡或搅拌溶解2小时。这些全细胞溶解的小样品可在4 °C下以235,000 × g超速离心10分钟澄清后，取30 μL上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱（见材料表），以确定最佳表达时间和最优溶解条件。 
	注意：以hTRPC3为例，该筛选包括pH值范围为4.0–9.5的不同缓冲液，盐浓度为50–500 mM；不同离子组成（如MgCl2或NaCl）；临界胶束浓度（CMC）为0.1–20 mM的不同去垢剂；还原性添加剂如二硫苏糖醇（DTT）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）和β-巯基乙醇；以及钙螯合添加剂乙二胺四乙酸（EDTA）。</li>
</ol>
6. 从冻存细胞沉淀中纯化hTRPC3蛋白
<ol>
	<li>在含有 20&#8201;mM Tris（pH 8.0）、500&#8201;mM NaCl、1&#8201;mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.8 μM 抑肽酶、2 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、2&#8201;mM 胃蛋白酶抑制剂 A 和 1% 洁沙丁的缓冲液中解冻沉淀，每升收获的细胞使用 100 mL 缓冲液。解冻后，通过移液或搅拌确保溶液均匀。将溶液置于冰浴中的烧杯内，加入搅拌子，在 4 °C 下溶解 2 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下以 235,000 × g 超速离心 1&#8201;小时，去除细胞碎片。取 30 μL 样品通过高效液相色谱法（HPLC）在尺寸排阻色谱柱（见材料表）上运行，检测蛋白含量，并通过 GFP 信号输出观察目标蛋白。</li>
	<li>将溶解后的蛋白（上清液）与钴亲和树脂在 4 °C 下孵育 1–2 小时。取 30 μL 样品在尺寸排阻色谱柱上运行，验证蛋白是否结合至树脂。 
	注意：若蛋白已结合，则 GFP 标记的目标蛋白将保留在色谱柱上，不会出现在流穿液中。因此，当流穿液进行 HPLC 分析时，在对应目标蛋白大小的位置不应出现 GFP 信号。</li>
	<li>用 10 倍柱体积的缓冲液（20&#8201;mM Tris，pH 8.0，500&#8201;mM NaCl，15&#8201;mM 咪唑，0.1% 洁沙丁）洗涤树脂。取 30 μL 样品在尺寸排阻色谱柱上运行，检测是否有蛋白流失。 
	注意：若发生蛋白流失，GFP 标记的目标蛋白将出现在流经树脂的洗涤液中。因此，当洗涤液进行 HPLC 分析时，在对应目标蛋白大小的位置会出现 GFP 信号。若发生蛋白流失，可能需要降低洗涤缓冲液中的咪唑浓度，以防止破坏 His 标签与亲和柱的结合。</li>
	<li>用洗脱缓冲液（20&#8201;mM Tris，pH 8.0，500&#8201;mM NaCl，250&#8201;mM 咪唑，0.1% 洁沙丁）洗脱树脂结合的 hTRPC3。按 1:20 的摩尔比加入凝血酶（用于切割 GFP 标签），并向洗脱样品中加入 10 mM EDTA（hTRPC3 稳定剂），在 4 °C 下孵育 3 小时。取稀释 1:100 的 90 μL 样品在尺寸排阻色谱柱上运行，检测目标蛋白是否被成功洗脱，并确认在对应目标蛋白大小的位置存在 GFP 信号。 
	注意：此时也可观察洗脱液中总蛋白的色氨酸信号。只有目标亲和纯化的蛋白会保留在洗脱液中，且 GFP 信号与色氨酸信号的谱图应高度一致。若在洗脱液中未观察到大量目标蛋白，但其未在流穿液或洗涤液中丢失，则蛋白可能仍结合在柱上，可尝试使用更高浓度咪唑的缓冲液进行洗脱。</li>
	<li>将洗脱液在 15 mL 100K 离心过滤管（见材料表）中于 4 °C 下以 2,880 × g 离心浓缩至 500 μL 或更少，每次离心 5 分钟。在离心间隔间通过移液上下吹打溶液重悬蛋白，避免过度浓缩。 
	注意：当体积接近目标终体积时，可缩短离心时间。</li>
	<li>将浓缩后的样品加载至尺寸排阻色谱柱中，使用缓冲液（20&#8201;mM Tris，pH 8.0，500&#8201;mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% 洁沙丁）进行洗脱。运行。</li>
	<li>根据紫外吸收信号确定含有完整 TRPC3 四聚体的峰组分，合并这些组分，并再次浓缩至终浓度至少为 5&#8201;mg/mL。</li>
</ol>
7. 通过负染电子显微镜筛选蛋白质
<ol>
	<li>开启辉光放电仪，设置程序使用氩气和氧气对碳支持膜铜网进行30秒的放电处理。在加入蛋白溶液之前，通过该程序使400目铜网上的碳膜表面变为亲水性。</li>
	<li>在实验室用膜、蜡纸或类似表面上设置五个40 μL的无菌水液滴和两个40 μL的1%甲酸铀酰溶液液滴（参见材料表）。取步骤7.1中的铜网，将2.5 μL浓度为5 mg/mL（50–200 μM）的蛋白样品加至碳膜较暗的一面，静置1分钟。</li>
	<li>静置1分钟后，用滤纸吸干铜网表面液体。切勿将滤纸直接接触铜网表面，而应将滤纸靠近液滴边缘，利用毛细作用将液体从铜网吸入滤纸中。</li>
	<li>将铜网依次浸入第一个水滴中，用滤纸吸干，随后重复此操作完成剩余水滴以及第一个甲酸铀酰溶液滴的漂洗。将铜网浸入第二个甲酸铀酰溶液滴后静置1分钟，再用滤纸吸干。之后让铜网在空气中完全干燥（约1分钟），然后储存。 
	注意：该染色方案可能不适用于所有蛋白-去垢剂组合。若上述步骤未能获得对比度良好的染色效果，应尝试不同浓度的甲酸铀酰染色液或调整染色时间。</li>
	<li>将铜网置于透射电子显微镜（参见材料表）下成像，以评估蛋白颗粒的质量。应确保显微照片中存在大量颗粒，且颗粒在整体形貌和分布上均一，具有良好的对比度，并与目标蛋白的预期尺寸相符。</li>
	<li>利用50–100张显微照片生成初步的低分辨率二维（2D）分类图像（见数据处理步骤10），以确认这些颗粒代表了单一一致结构的不同视角。 
	注意：如上所述，若显微照片和初步2D分类图像质量足够高，则表明蛋白纯化流程已得到充分优化。此时可进行冷冻电镜样品铜网的制备与筛选。</li>
</ol>
8. 透射电镜样品制备
<ol>
	<li>按照步骤 7.1 所述方法对金质载有孔碳膜的载网（见材料表）进行辉光放电处理。</li>
	<li>将 2.5 μL 浓缩的 hTRPC3 蛋白样品（5&#8201;mg/mL）滴加到载网上。在 100% 湿度和 4 °C 条件下，使用 1 的 blot 力度 blot 1.5 秒，等待时间为 5 秒，然后使用玻璃化仪器将载网迅速浸入由液氮冷却的液态乙烷中。 
	注意：此处列出的湿度、温度、blot 力度、blot 时间和等待时间是作者在 hTRPC3 研究中所采用的条件19。对于其他蛋白质和去垢剂，可能需要调整这些参数以获得最佳的玻璃态冰层。</li>
	<li>使用冷冻电镜（见材料表）对冷冻载网进行筛选，手动观察厚冰区域（网格方格显得更小且更暗）、薄冰区域（网格方格显得更大且更亮）以及中等厚度冰层的区域。 
	注意：较厚的冰层通常含有更多的颗粒，而较薄的冰层通常能提供更好的对比度和分辨率。通过手动筛查图像，确定哪种冰层条件能够产生大量单一分散、具有良好对比度和分辨率的颗粒。一旦确认了理想条件，即可在 300 kV 冷冻电镜上进行图像采集。</li>
</ol>
9. 电镜数据采集
<ol>
	<li>使用自动采集程序，在电子显微镜上以300&#8201;kV工作电压、标称放大倍数130,000倍、直接电子探测器及1.074 Å的像素合并尺寸下，以超分辨率计数模式记录图像堆栈。</li>
	<li>将每幅图像按剂量分帧为40帧，总曝光时间为8&#8201;s，每帧0.2&#8201;s，剂量率为6.76 e− Å−2&#8201;s−1（在作者的实验中，标称离焦值范围为1.0至2.5 μm）。</li>
</ol>
10. 电子显微镜数据处理
<ol>
	<li>使用数据处理软件（见材料表）22对累加的电影堆栈进行运动校正23，并估算离焦值24。</li>
	<li>从显微照片中选取颗粒。利用这些选取的颗粒，使用该软件构建初始的无参考2D分类24。选择理想的2D类别平均图作为模板，用于对整个数据集进行自动颗粒选取。</li>
	<li>手动检查自动选取颗粒的质量，并剔除质量差的颗粒。通过多轮2D分类对选取的颗粒进行清洗。</li>
	<li>生成初始模型25。将2D选取的颗粒基于C1对称性进行三维（3D）分类（约5个类别），并以60 Å低通滤波的初始重构模型作为参考。确定哪些类别具有高分辨率特征，并合并此类别中的颗粒。</li>
	<li>进一步使用局部精细化处理，施加C4对称性（针对hTRPC3情况），并将颗粒对齐的高分辨率极限设为4.5 Å26。</li>
</ol>
11. 模型构建
<ol>
	<li>构建模型（所用软件见材料表）。对于hTRPC3，以瞬时受体电位香草酸亚型4（TRPM4）跨膜结构域（TMD）的蛋白质数据库（PDB）结构5wp6作为参考27，利用大体积残基和二级结构预测指导从头建模（de novo building）。</li>
	<li>对初始模型进行实空间精修，并施加二级结构限制28。手动检查精修后的模型，并根据需要进行修正（所用软件见材料表）。</li>
	<li>应用傅里叶壳层相关（Fourier shell correlation, FSC）曲线计算最终模型与电镜图谱之间的差异，以验证精修后的结构。评估原子模型的几何特性（所用软件见材料表）29,30。</li>
</ol>

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<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Green, E. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization%2C+Expression%2C+Purification%2C+and+Crystallization+of+the+Human+Serotonin+Transporter+Bound+to+S-citalopram%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54792(2016).</li>
<li>Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+from+the+source%3A+endogenous+preparations+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).</li>
<li>Bayburt, T. H., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Protein+Assembly+into+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Membrane Protein Assembly into Nanodiscs.</a> FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).</li>
<li>Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-microscopy+structure+of+a+human+TRPM4+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel.</a> Nature. 552, 200-204 (2017).</li>
<li>Autzen, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359 (6372), 228-232 (2017).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).</li>
<li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).</li>
<li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-free+purification+of+ABC+%28ATP-binding-cassette%29+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters.</a> Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，得益于新型相机和算法的发展，冷冻电镜（cryo-EM）在蛋白质结构解析方面彻底改变了结构生物学领域，显著加快了难以结晶的蛋白质（尤其是膜蛋白）的结构解析进程。尽管冷冻电镜技术取得了诸多最新进展，但制备出足够质量和数量的高纯度蛋白质以支持高质量成像，往往仍耗时、昂贵且具有挑战性。如上述方案所述，能够在多种纯化条件下快速表达并筛选多个基因构建体的能力，提高了这一过程的效率，使得高质量纯化蛋白质的快速、低成本生产成为可能，从而可用于冷冻电镜研究。
尽管本文所述方法在成本上低于直接转染、在时间上快于构建稳定转染细胞系，从而实现大量纯化哺乳动物膜蛋白的目的，但该方法包含多个步骤，每个步骤均需优化以获得高质量的蛋白产量。在hTRPC3蛋白的表达与纯化所涉及的生化技术中，存在若干关键步骤和检查点。第一个关键检查点是杆状病毒DNA（bacmid DNA）的制备。如结果部分所述，理想的菌落筛选是获得高质量病毒用于蛋白表达的第一步。此外，若从所选菌落中提取的bacmid DNA浓度低于1 μg/μL，则所得病毒将不足以支持高效的蛋白表达。第二个关键检查点是P1和P2代杆状病毒的制备。病毒滴度可...

钙参与了大多数细胞过程，包括信号级联、转录调控、神经递质释放以及激素分子的合成1,2,3。细胞质游离&#160;钙的稳态维持对细胞的健康与功能至关重要。细胞内钙稳态的主要机制之一是库操纵性钙内流（SOCE），该过程是指内质网（ER）中储存的钙耗竭后，触发细胞膜上的离子通道开放，从而促进内质网钙的再充盈，以供后续信号传导使用4,5,6。瞬时受体电位通道（TRPCs）是一类属于TRP通道超家族的钙通透性通道，已被确认为SOCE中的主要参与者7,8,9。
在TRPC家族的七个成员中，TRPC3、TRPC6和TRPC7构成一个同源亚组，其独特之处在于可被脂质第二信使二酰甘油（DAG）激活，而DAG是信号脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）的降解产物10,11。TRPC3在平滑肌以及大脑和小脑区域高度表达，在这些部位参与调控钙信号传导，进而影响&#160;神经传递和神经发生12,13。TRPC3功能异常已被证实与中枢神经系统疾病、心血管疾病以及某些癌症（如卵巢腺癌）相关14,15,16。因此，TRPC3有望成为治疗这些疾病的药物靶点。然而，由于对TRPC3的分子激活机制（包括脂质结合位点）尚缺乏了解，针对TRPC3的特异性药物研发受到限制17,18。我们已报道了人源TRPC3通道（hTRPC3）及其两个脂质结合位点在闭合状态下的首个原子分辨率结构，为理解这些机制提供了重要线索19。
确定膜蛋白高分辨率结构的关键因素是获得高质量的蛋白质。为获得高质量蛋白而进行相应的表达与纯化条件筛选，可能耗时且成本高昂。本文详细描述了一种实验方案，用于确定人源TRPC3（hTRPC3）蛋白的最佳表达与纯化条件，该蛋白在初始筛选中表现不佳。我们提出了若干关键策略，用于排查问题并优化蛋白行为，为后续的冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究奠定了坚实基础。本研究采用由Gouaux及其同事开发的改良型杆状病毒生成载体（pEG），该载体专为筛选实验设计，并可在哺乳动物细胞中高效产生杆状病毒。20该表达方法适用于在哺乳动物细胞膜中快速且经济高效地过表达蛋白质。我们将该载体的使用与基于荧光检测的尺寸排阻色谱（FSEC）预筛选方法相结合。21. 该方法利用与目标构建体融合的绿色荧光蛋白（GFP）标签，可增强在少量全细胞溶解样品中对目标蛋白的可视化效果。这使得能够在不同去垢剂和添加剂存在条件下、结合热稳定突变，对蛋白稳定性进行筛选，并可利用小规模瞬时转染所得的少量细胞进行实验。通过该方法，可在开展大规模蛋白纯化前快速筛选大量不同条件。在完成表达、筛选和纯化后，我们提供了一套获取和处理冷冻电镜（cryo-EM）图像以生成三维结构的方案 从头合成 蛋白质的结构解析。我们相信，本文所述的方法可作为TRP通道受体及其他膜蛋白结构研究的通用实验方案。

<table><tbody><tr><td>pEG BacMam 载体 (pFastBacI)</td><td>addgene</td><td>31488</td><td></td></tr><tr><td>DH10&amp;alpha; 细胞</td><td>Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 培养基</td><td>Corning</td><td>46003CR</td><td>用于 DH10&amp;alpha; 细胞的 Bacmid 转化</td></tr><tr><td>Bacmam 培养平板</td><td>Teknova</td><td>L5919</td><td>用于转化后 DH10&amp;alpha; 细胞的培养</td></tr><tr><td>细菌培养用摇床</td><td>Infors HT</td><td>Multitron standard</td><td></td></tr><tr><td>昆虫细胞用轨道摇床</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物细胞用 CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>台式轨道摇床</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE416HP</td><td>用于哺乳动物细胞 CO2 培养箱内</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR</td><td>1535</td><td>用于细菌平板培养</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>用于质粒提取与纯化</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>Life Technologies</td><td>12659017</td><td>用于病毒生产的昆虫细胞</td></tr><tr><td>Sf-900 培养基</td><td>Gibco</td><td>12658-027</td><td>昆虫细胞培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Gibco</td><td>10362100</td><td>用于昆虫细胞转染</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>用于哺乳动物细胞转染</td></tr><tr><td>0.2 mm 注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>用于过滤 P1 病毒</td></tr><tr><td>0.2 mm 滤膜瓶（500 ml 储液瓶）</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>用于过滤 P2 病毒</td></tr><tr><td>锥形培养瓶（平底 2L）</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000</td><td>用于昆虫细胞培养</td></tr><tr><td>锥形培养瓶（带挡板 2L）</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000B</td><td>用于哺乳动物细胞培养</td></tr><tr><td>nanodrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>用于测定 DNA 和蛋白质浓度</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td>用于蛋白质表达的哺乳动物细胞</td></tr><tr><td>Freestyle 293 表达培养基</td><td>Gibco</td><td>1238-018</td><td>用于蛋白质表达的哺乳动物细胞培养基</td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Acros</td><td>263195000</td><td>用于增强蛋白质表达</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Acros</td><td>215740500</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>牛肺来源抑肽酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-100MG</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24125-16-4</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂 A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2671-250</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>EMD Millipore</td><td>300410</td><td>去垢剂 — 用于从膜中溶解蛋白质</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>792527</td><td>用于从树脂柱中洗脱蛋白质</td></tr><tr><td>TALON 树脂</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>用于 His 标签亲和纯化</td></tr><tr><td>superose6 increase 柱</td><td>GE</td><td>29091596; 29091597</td><td>用于 HPLC 和 FPLC</td></tr><tr><td>Prominence 模块化 HPLC 系统</td><td>Shimadzu</td><td>见下文</td><td></td></tr><tr><td>控制器模块</td><td>&quot;</td><td>CBM20A</td><td></td></tr><tr><td>溶剂输送系统</td><td>&quot;</td><td>LC30AD</td><td></td></tr><tr><td>荧光检测器</td><td>&quot;</td><td>RF20AXS</td><td></td></tr><tr><td>带冷却功能的自动进样器</td><td>&quot;</td><td>SIL20ACHT</td><td></td></tr><tr><td>Pure FPLC 系统（含组分收集器）</td><td>Akta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝血酶（α）</td><td>Haematologic Technologies Incorporated</td><td>HCT-0020 Human alpha</td><td>用于切割 GFP 标签</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL 100K 离心滤管</td><td>Millipore</td><td>UFC910008</td><td>用于浓缩蛋白质</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>E478500</td><td>用于稳定蛋白质</td></tr><tr><td>400 目碳膜铜网</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>01754-F</td><td>负染用载网</td></tr><tr><td>Quantifoil 载金载网（金，1.2/1.3&amp;thinsp;&amp;mu;m 孔径/孔间距，300 目）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q3100AR1.3</td><td>冷冻电镜用载网</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI</td><td></td><td>用于通过液态乙烷冷冻制备样品载网</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Dura-Cyl</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>乙烷气体</td><td>Airgas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Solarus 等离子体系统</td><td>Gatan</td><td>Model 950</td><td>用于样品冷冻前的载网清洁</td></tr><tr><td>Tecnai Spirit 电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td>用于负染电镜成像</td></tr><tr><td>Talos Arctica 电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td>用于冷冻电镜载网的筛选和低分辨率成像</td></tr><tr><td>Titan Krios 电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td>用于高分辨率冷冻电镜成像</td></tr><tr><td>软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gautomatch 软件</td><td>http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td><td></td><td>用于从显微图像中挑选颗粒</td></tr><tr><td>Relion 2.1 软件</td><td>https://github.com/3dem/relion</td><td></td><td>用于构建二维和三维分类</td></tr><tr><td>CryoSPARC 软件</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td><td>用于生成初始结构模型</td></tr><tr><td>Frealign 软件</td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td><td></td><td>用于颗粒精细化</td></tr><tr><td>Coot 软件</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td></td><td>用于构建模型</td></tr><tr><td>MolProbity 软件</td><td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td><td></td><td>用于评估原子模型的几何结构</td></tr><tr><td>SerialEM 软件</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td><td></td><td>用于自动化连续图像堆栈采集</td></tr><tr><td>MotionCor2 软件</td><td>http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html</td><td></td><td>用于对累加电影堆栈进行运动校正</td></tr><tr><td>GCTF 软件</td><td>https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td><td>用于测量电影堆栈中的离焦值</td></tr><tr><td>Phenix.real_space_refine 软件</td><td>https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html</td><td></td><td>用于对初始三维模型进行实空间精细化</td></tr></tbody></table>

人源脂质敏感型阳离子通道trpc3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

经典瞬时受体电位通道亚家族（TRPCs）属于非选择性阳离子通道，在钙稳态中发挥关键作用，特别是对维持突触囊泡释放和细胞内信号通路正常功能至关重要的库操作性钙内流过程。因此，TRPC通道已被证实与多种人类疾病相关，包括心脏肥厚等心血管疾病、帕金森病等神经退行性疾病以及脊髓小脑性共济失调等神经系统疾病。正因如此，TRPC通道被认为是治疗人类疾病的潜在药理学靶点。然而，这些通道的门控分子机制仍不明确。获取大量稳定、均一且纯化的蛋白一直是结构解析研究中的限制因素，尤其是对于TRPC离子通道这类哺乳动物膜蛋白而言。本文介绍了一种利用改良型杆状病毒基因转移系统进行哺乳动物离子通道膜蛋白大规模表达的实验方案，并通过亲和层析和尺寸排阻层析对这些蛋白进行纯化。此外，我们还提供了从纯化蛋白样品中采集单颗粒冷冻电子显微镜图像，并利用这些图像解析蛋白结构的实验流程。结构解析是深入理解离子通道门控行为与功能机制的有力手段。

人TRPC3蛋白表达与纯化方案的示意图见图1A。显示了含有理想白色菌落的人TRPC3 bacmid平板图像，该平板与用于bacmid DNA纯化的菌落选择相似，如图1B所示。我们发现，48小时是实现清晰Bluo-gal染色同时保持单菌落分离的最佳时间。在Sf9昆虫细胞中感染4天后，通过GFP荧光观察到hTRPC3的P2病毒产量达到峰值（图1C）。
P2 baulovirus 从培养基中收获后，添加 1% FBS，并用于感染 HEK293 哺乳动物细胞悬液。病毒感染后 12–18 小时，向细胞中加入丁酸钠以增强蛋白表达20。随后，细胞在 30 °C 下继续孵育 36 小时。收集细胞，并通过荧光偶联 SEC（FSEC）进行溶解度和稳...

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

瞬时受体电位通道（TRPCs）属于经典的瞬时受体电位（TRP）亚家族，是一类非选择性阳离子通道，在钙信号传导中发挥着关键作用……

本方案使我们能够解析人源TRPC3的结构，TRPC3属于一类重要但研究尚不充分的离子通道家族。该技术的主要优势在于其高效性，可广泛应用于多种蛋白质的表达与纯化，适用于结构与功能研究。该方法可提供高效的蛋白质表达与纯化系统，用于蛋白质生物化学与生物物理学研究，并可推广至多种离子通道及其他膜蛋白的研究。首先，通过观察病毒生产培养物样品中病毒的GFP荧光来检测相对病毒表达水平。在足够大小的带挡板底部的锥形培养瓶中，制备适量体积的HEK293哺乳动物细胞悬浮培养液，细胞浓度为每毫升350万至380万个细胞，培养基为添加了1%无菌FBS的表达培养基。加入体积比为8%的P2代病毒原液，并在37°C、135 RPM条件下于摇床中孵育。感染后12至18小时，加入10毫摩尔的丁酸钠，于30摄氏度孵育至蛋白表达达到最佳所需时间。随后，在2,880 × g离心20分钟以收集细胞。每升收获的细胞用约100毫升TBS洗涤并重悬。再次在2,880 × g下离心20分钟，并收集细胞沉淀。同时在不同时间点收集少量（1毫升）的细胞沉淀样品，在4°C条件下加入不同的去垢剂和/或添加剂，振荡溶解2小时。将这些少量全细胞溶解样品在4°C下以235,000 × g超速离心10分钟，以澄清溶液。然后，将样品以30微升为一份在尺寸排阻色谱柱上进行分析，以确定最佳表达时间和最佳溶解条件。每升收获的细胞用100毫升缓冲液重悬沉淀并解冻。细胞解冻后，用移液器吹打或搅拌，以确保溶液均匀。将细胞置于冰浴中的烧杯内，在4°C条件下搅拌溶解2小时。随后，在4°C下以235,000 ×g超速离心1小时，去除细胞碎片。取30 µL上清液样品，通过HPLC在SCC柱上进样，以测定蛋白含量，并通过GFB信号输出观察目标蛋白。将含有可溶性蛋白的钴亲和树脂结合上清液上样至重力柱中，并收集穿流组分。取30微升穿流组分样品在SCC柱上进行检测，以确认蛋白是否结合到树脂上。随后，用10个柱体积的缓冲液洗涤树脂。取30微升洗涤液样品在SCC柱上运行，以检测是否存在蛋白损失。用缓冲液洗脱树脂结合的人TRPC3蛋白。取90微升洗脱液样品，按1:100稀释后在SSC柱上运行，以确认蛋白已被洗脱，并验证在与目标蛋白大小相应的位置是否存在GFP信号。按1:20的摩尔比加入凝血酶，并向洗脱样品中加入10毫摩尔的EDTA。在4摄氏度下孵育三小时。孵育结束后，将洗脱液转移至15毫升离心过滤管中。在4°C条件下，以2,800 × g离心5分钟，逐步将洗脱液浓缩至500微升或更少。每次离心间用移液器轻轻吹打蛋白溶液，重新悬浮蛋白，防止过度浓缩。将浓缩后的样品加入SSC柱中，并用缓冲液洗脱。进行快速蛋白质液相色谱，收集每份300微升的组分。随后，根据紫外吸收信号所显示的结果，合并含有TRPC3四聚体的峰组分。再次浓缩至最终浓度至少为5毫克/毫升。人源TRPC3在临界胶束浓度为0.01至20微摩尔的一系列去垢剂中进行全细胞增溶，并在含有DDM/CHS的缓冲液中进行检测。尽管DDM/CHS对人源TRPC3的增溶效果最佳，但其洗脱峰位置过大，无法对应四聚体形式的人源TRPC3。全细胞增溶后，去除细胞裂解碎片，将增溶后的蛋白上样至SSC柱，并在含DDM/CHS去垢剂的缓冲液中进行HPLC分析，以在不同条件下比较人源TRPC3相对于TRPM4对照的绝对增溶度和洗脱峰体积。所有不同去垢剂溶解的TRPC3样品均在约11.9毫升处出现洗脱峰，该位置可能过大，因为人源TRPC3的四聚体形式分子量小于阳性人源对照TRPM4。随后测试了两种含有DDM/CHS和皂苷的不同溶解与运行缓冲液。在含有皂苷的缓冲液中跑胶的蛋白样品，其洗脱峰位置相对于阳性对照更为合理，且峰高最高。尽管使用25毫升细胞进行的小规模纯化显示出多个宽峰，但负染二维分类结果显示该蛋白具有单一人源TRPC3通道四聚体的特征。随后根据人源TRPC3的生理特性筛选添加剂。EDTA在稳定人源TRPC3处于完整四聚体峰位置方面表现出显著作用，显著增加了冷冻电镜显微照片中颗粒的数量，并降低了背景噪声。最终结果的质量取决于在HPLC上对FSCC谱图进行良好的故障排查，以及快速完成所有纯化步骤，最好在一天内完成。在此过程完成后，可进行结构测定、抗体生成以及功能研究，如结合实验或电生理学分析。该技术已被并可进一步适用于研究其他离子通道和蛋白质家族，以及制备可用于结构解析以外应用的纯化蛋白质。应采取适当的预防措施以管理细胞培养相关的生物危害，例如在超净工作台内操作、穿戴防护服，并妥善处理废弃物。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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