Name: 闪速纳米沉淀法包聚物纳米粒子中疏水亲水化合物的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习闪速纳米沉淀法（FNP）制备聚合物纳米粒子，用于包封疏水性和亲水性化合物。本方法提供可扩展的药物递送平台，适用于生物制剂封装，帮助研究人员掌握核心操作技术与后处理关键步骤。

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本工作获得了Optimeos Life Sciences、美国国家科学基金会（CBET 1605816）、比尔及梅琳达·盖茨基金会（BMGF, OPP1150755）以及授予K.D.R.的美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1656466）的资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

在方案的第1步中，已对维生素E等疏水性化合物的包封进行了广泛描述9,14,28。由于混合的时间尺度短于颗粒聚集和生长的时间尺度，因此可生成相对单一分散的颗粒。具体而言，混合溶剂/非溶剂体系迅速达到均一状态，从而使成核过程均匀发生。随后，嵌段共聚物在颗粒表面组装，提供空间位阻稳定作用，从而终止颗粒的进一步生长5。由于混合室内的混合时间（湍流）取决于CIJ或MIVM的进样流速，因此在进入湍流混合状态后，存在某一进样速率可使颗粒尺寸基本保持恒定13。这使得该工艺具有更强的稳健性，因为即使进样流速存在一定的批间差异（即，注射器推进速度），对最终纳米颗粒（NP）尺寸的影响也不显著，如图3所示。较慢或不均匀的进样速度可能导致颗粒尺寸增大或粒径分布更宽，如“点火失败”示例所示。FNP技术还通过反向闪速纳米沉淀法（inverse Flash NanoPrecipitation）被拓展用于将亲水性化合物包封于纳米颗粒中。这些反向纳米颗粒随后可用于制备微粒，或通过PEG包覆形成可在水中分散的纳米颗粒25。其基本组装原理保持不变，但需额外对颗粒核心进行交联，以在水性环境中稳定颗粒结构。通常，交联剂与聚酸嵌段的电荷比为1:1即可满足要求，但通过加入碱调节pH值可促进离子相互作用19。在本方案中，仅描述了形成反向纳米颗粒的第一步工艺过程。
除了快速混合外，FNP 或 iFNP 方法成功制备纳米颗粒还受限于多个条件的同时满足9,14。首先，所有进样流必须互溶。尽管乳液已被用于纳米颗粒的制备，但 FNP 要求在混合器中形成均匀的溶液相。其次，核心组分在混合器内的溶剂条件下（对于 CIJ 为体积比 50/50 的混合液）必须几乎不溶，以驱动快速成核。否则，大量物质将保持未包封状态，或在进一步用反溶剂稀释后发生沉淀。MIVM 可在混合腔内实现更高的反溶剂含量，从而缓解核心材料溶解度的限制。通常可通过溶解度数据绘制溶剂组成函数的过饱和曲线，以指导工艺设计9。图6展示了两种化合物的代表性曲线。若混合腔条件下的过饱和度较低，则建议在不同组成条件下运行，通常采用 MIVM。较高的过饱和度有利于核心组分的成核而非颗粒生长，但若核心材料与稳定剂的组装时间不匹配，则可能导致治疗剂形成大尺寸聚集体。D'Addio 和 Prud'homme 已对这类过饱和曲线的应用进行了详细综述9。最后，嵌段共聚物（BCP）必须在溶剂流中以分子状态完全溶解，且反溶剂必须对其中一个嵌段具有选择性。BCP 必须具备足够的两亲性，一方面通过塌缩嵌段产生溶剂疏性驱动力，使稳定剂锚定在颗粒表面，另一方面通过溶剂化嵌段赋予颗粒空间位阻稳定性。只要满足上述条件，也可使用本方案中未提及的其他溶剂。
手动操作注射器的练习可提高筛选过程的成功率。如上所述，当操作处于从层流到均匀湍流混合条件的转变之上时，流速的微小变化在过程中是可容忍的28。扩大至由泵驱动、计算机控制的流动系统，可因入口流速的可重复性而进一步提高一致性。在颗粒后续处理的任何阶段，通过目视检查或动态光散射（DLS）分析可能发现存在大尺寸聚集体，这可能是由于偶然引入的灰尘或颗粒不稳定所致。必要时，可使用适当孔径的滤膜对流体进行过滤。在无聚集体的情况下，我们发现，若滤膜的标称孔径大于颗粒尺寸分布，过滤聚乙二醇（PEG）包覆的纳米颗粒时通常损失的质量低于5%。当过滤聚集体时，则需通过实验确定该过程中损失的质量。质量损失的定量可通过以下两种方法之一进行。可通过热重分析测定特定体积下的总固含量在过滤前后的变化，以确定改变程度（参见补充信息第2节）。或者，可将颗粒回收（例如，&#160;通过冷冻干燥），并溶解于良溶剂中，随后采用合适的技术（如紫外-可见分光光度法或色谱法）直接测定核心材料的浓度。
对于FNP，残留的10 vol%有机溶剂（例如，四氢呋喃（THF）必须从水相分散液中去除。可通过蒸发蒸馏实现。14,29透析30或切向流过滤31,32每个处理步骤的实际注意事项详见所提供的参考文献。对于透析，常用的膜截留分子量为3.5 kDa或6–8 kDa，尽管也有更大截留值的膜可供选择。当透析时间达到24 h并多次更换透析液时，该分子量截留值足以实现溶剂的去除。使用切向流过滤时需进行一定的工艺开发，必须注意避免因膜表面浓差极化而引发聚集。我们发现，将有机溶剂的体积分数降低至依赖于体系的某一特定值以下（通常为2–10 vol%），可消除膜表面的聚集现象。处理完成后，可通过热重分析（见 补充信息 第2节）。通常希望以高度稳定的形式运输或储存颗粒。水相分散液可直接使用干冰/丙酮混合物快速冷冻，随后于-80 °C保存。或者，可通过冷冻干燥获得干燥粉末。33,34 或喷雾干燥24通常需要添加冷冻保护剂以减少纳米颗粒在冷冻或干燥过程中的聚集。糖类（蔗糖、海藻糖、 等等。），聚乙二醇或环糊精可在不同浓度下通过动态光散射（DLS）监测粒径，以筛选其有效性35,36,37,38常见的纳米颗粒在加工过程中的稳定性问题通常与核心的溶解性或相分离有关，这些因素会导致在流动性增加的条件下，颗粒重排至更低能量状态。使用共核心材料、替代性稳定剂或改性外部溶液组成有助于提高稳定性。14,16,17,39,40,41.
如上所述，当需要实现高过饱和度时，MIVM 能够在混合室中容纳更高的反溶剂含量。当反应性或溶解度限制要求将不同组分物理分离时，该装置还可将物质分隔到两个以上的流路中。一个实例是抗生素氯法齐明（clofazimine）由玉米醇溶蛋白（zein）稳定化的纳米颗粒的制备24。疏水性氯法齐明通过丙酮流引入；zein 通过含60%乙醇的水溶液流引入；与 zein 形成复合物的酪蛋白（casein）通过缓冲水溶液流引入；第四个流路为额外的缓冲液，用于提高水相对于丙酮和乙醇的比例。由于氯法齐明与 zein 无法溶于同一种溶剂，因此需要两个溶剂流。该过程无法在双射流 CIJ 混合器中完成。这种由蛋白质稳定的制剂还表明，FNP 技术并不局限于使用嵌段共聚物（BCP）作为稳定剂。已有研究在无稳定剂条件下制备出 Janus 颗粒42，并展示了多种低成本稳定剂在口服给药中的应用24。值得注意的是，诸如羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methylcellulose）等共聚物可替代嵌段共聚物使用24。可通过多种技术进一步增强核心材料的疏水性。疏水离子配对法已被用于包载一系列具有中等溶解度的化合物43,44,45。研究人员还设计出极疏水的前药并成功实现包封46。核酸可通过与阳离子脂质形成复合物的方式被包封47。重要的是，这些研究表明，FNP 能够制备出具有多种表面化学性质的纳米颗粒。此外，还可使用含有部分经靶向配体修饰链端的 BCP 的混合稳定剂体系。由于颗粒组成反映了进料流的组成，因此可精确调控颗粒表面的配体含量23,48。类似地，也可将多种核心组分共同引入，包括染料和无机纳米颗粒3,8。
Flash NanoPrecipitation（快速纳米沉淀法）是一种可放大的制备聚合物纳米颗粒的方法，所得颗粒具有疏水性或亲水性核心。只要满足上述各项条件，通常可将超过95%的核心材料以高质量分数包封于颗粒中。本文展示的三个示例均在实验室规模下进行，每种进料流仅需数毫克材料和约0.5 mL体积。这使得能够快速筛选颗粒制备条件，以优化配方。将优选配方放大至更大批次，只需延长工艺运行时间，通过使用注射泵或流量控制器即可轻松实现。相比之下，传统批量添加纳米沉淀法在放大过程中面临众所周知的挑战，即在添加点维持充分的微混合，并需考虑反应容器几何形状变化带来的影响49。这是一个重大障碍，因为按照美国食品药品监督管理局（FDA）的要求，必须以一致的方式生产颗粒50。微流控技术也可制备均一且可重复的纳米颗粒，但其产量通常仅限于毫克级别。例如，Karnik et al. 在一项药物释放研究中报道的产量为0.25 mg/min51。进一步放大通常需要高成本的并行化设备12。而采用FNP方法，仅需一台注射泵及若干连接混合器入口的接头，即可以600 mg/min的速率轻松生产1克纳米颗粒。因此，FNP既是一种易于实现的实验室规模筛选工具，也是一种适用于转化研究的纳米颗粒可放大生产工艺。

自20世纪90年代末以来，采用纳米材料的临床试验数量稳步增加1,2。这一增长趋势反映了纳米材料在提高疏水性药物生物利用度以及实现体内靶向递送方面的巨大潜力3。聚合物纳米颗粒（本文中简称纳米颗粒或NPs）在这一类材料中所占比例日益增加2。纳米颗粒备受关注，因其具有高度可调控的特性，如粒径、组成和表面功能化4。在用于难溶性药物递送时，纳米颗粒通常具有核-壳结构，其中治疗药物被包封于疏水性内核，而外壳则由亲水性聚合物刷构成。一种简单的构建方法是使用两亲性二嵌段共聚物（BCP），该共聚物包含一个可降解的疏水嵌段（构成颗粒内核的一部分）和一个亲水性聚乙二醇（PEG）嵌段（形成聚合物刷并提供空间稳定性）4,5。
纳米沉淀法是一种常见的聚合物纳米颗粒制备技术，因其操作简单且能耗较低而被广泛应用6。在最简单的形式中，该方法通过移液将含有纳米颗粒组分的有机溶剂（如丙酮）加入到大量搅拌的水中。当溶剂环境转变为稀释的水相时，不溶性核心组分随即发生沉淀。稳定剂则通过疏水链段的吸附作用，在不断生长的颗粒表面自组装成结构7,8,9,10。当有机溶剂与水快速混合形成均一溶液时，可获得粒径分布均匀的纳米颗粒。若混合速度慢于组分的成核与自组装过程，则会导致颗粒尺寸更大且多分散性更高。尽管传统的搅拌批量法易于进行初步测试，但由于混合不一致，所得结果变异较大，且难以实现放大生产6,11。微流控技术作为另一种纳米颗粒制备途径，可实现连续化生产，该生产方式最近已被Ding et al.11。 所综述。一种常用的方法是利用层流聚焦，将溶剂的特征长度缩小至亚微米级别。反溶剂的混合依赖于扩散作用，因此微小的流道尺寸对于获得均一颗粒至关重要11,12。然而，为实现规模化生产而并行多个微流控腔室时，在大体积生产方面仍存在实际困难。
有利于微流控中均匀纳米沉淀的快速混合条件，也可在受限的湍流流动中实现。闪速纳米沉淀法（Flash NanoPrecipitation, FNP）采用特殊的混合几何结构，可在比微流控更高的体积流速下实现此类条件。在湍流条件下，进样流体进入混合腔室，产生涡旋，从而使溶剂与反溶剂的层状结构在扩散长度尺度上形成11,13。因此，可在短于治疗剂成核与生长的时间尺度内实现均匀混合。混合器的受限几何结构可防止流体绕过湍流能量耗散区域，使整个系统经历相同的工艺历程13。成核在混合腔室内均匀发生，颗粒生长持续进行，直至嵌段共聚物（BCP）在颗粒表面组装而终止生长9,14。随后，含有稳定颗粒的混合流可进一步用额外的反溶剂稀释，以抑制颗粒的奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald ripening）15,16,17。
受限撞击射流（CIJ）混合器是FNP中最简单的混合器设计，可实现两股流体的可扩展且连续的混合，如图1A13所示。多入口涡流混合器（MIVM）被开发用于支持最多四股不同的进样流，同时仍能实现均匀颗粒形成所需的快速微混合，如图1B18所示。FNP能够简化制剂筛选过程，并可轻松转化为商业化规模生产。由于该工艺具有连续性，增大批次规模无需更换新的容器，而只需延长运行时间，从而可在同一设备系统中简便地实现千克级规模的生产。
诸如多肽和蛋白质（“生物制剂”）等亲水性化合物也可通过一种称为反向快速纳米沉淀（inverse Flash NanoPrecipitation, iFNP）的过程进行包封。该技术需要一种两亲性嵌段共聚物（BCP），其中一段为疏水性，另一段为聚酸19。第一步是将含有生物制剂和BCP的二甲基亚砜（DMSO）溶液流与一种脂溶性溶剂（如二氯甲烷或氯仿）迅速混合。这会导致形成由疏水性嵌段刷稳定的颗粒。此类结构在此被称为“反向”纳米颗粒（NP）。其核心含有聚酸，随后通过多价阳离子进行离子交联。该步骤可使颗粒在后续加工中稳定存在于水相环境中，可制备成微粒或聚乙二醇（PEG）包覆的纳米颗粒，相关技术已在文献中报道19,20,21。
本方案可用于实验室规模制备包载疏水性或亲水性化合物的聚合物核壳纳米颗粒。方案的各个小节介绍了两种混合器——CIJ 和 MIVM 的使用方法。读者应能够根据流体输入选择合适的混合器，将本方案适配于新的核组分，并可重复地制备出目标粒径的纳米颗粒。下文展示了使用 FNP 和 iFNP 的三个示例配方。其中两个采用 CIJ 混合器，一个需要使用 MIVM15,22。第一个配方演示了通过 FNP 封装模型 疏水性 化合物。第二个配方演示了在 CIJ 混合器中通过 iFNP 封装模型 亲水性 化合物。最后一个配方提供了使用 MIVM 通过 iFNP 封装蛋白质的实例。该第三种配方的方案描述了一种小型手持式 MIVM，称为“μMIVM”的使用方法。该混合器设计尺寸更小，便于简化配方筛选，但其放大行为已被充分理解，且该混合器并非微流控装置22。方案的最后一部分包含有关筛选出的优选配方放大生产的若干说明。这些配方旨在为学习该工艺提供切入点，因此采用了不可降解的聚苯乙烯类聚合物。文献中已报道了多种替代性稳定剂，并有多种生物相容性的商业化选择可供使用14,23,24。

<table><tbody><tr><td>受限撞击射流混合器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>工程图纸请参见补充信息。有关新型混合器的验证，请查阅正文</td></tr><tr><td>鲁尔接头</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-604</td><td>与CIJ或MIVM混合器入口处的对应螺纹组装</td></tr><tr><td>堵头接头</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-309</td><td>安装于CIJ混合器侧面（密封钻孔后的通路）</td></tr><tr><td>出口接头 - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-205</td><td>与卡套和管路一起安装在CIJ腔体出口</td></tr><tr><td>出口卡套 - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-200</td><td>与出口接头配合使用（大端与管路齐平）</td></tr><tr><td>出口管路 - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>1517</td><td>使用管路切割器以获得平整端面。确保多余管路不会伸入混合腔内</td></tr><tr><td>四氢呋喃（THF）</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-4</td><td>使用无稳定剂的THF，以避免BHT的溶解度限制。过氧化物可能在某些应用中产生干扰。</td></tr><tr><td>诺姆注射器（3 ml）</td><td>VWR</td><td>53548-017</td><td></td></tr><tr><td>维生素E（&amp;alpha;-生育酚）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90669-50G-F</td><td>低温保存</td></tr><tr><td>聚（苯乙烯-b-乙二醇），PS&lt;sub&gt;1.6k&lt;/sub&gt;-b-PEG&lt;sub&gt;5k&lt;/sub&gt;</td><td>Polymer Source</td><td>P13141-SEO</td><td>根据具体应用，其他嵌段尺寸亦可接受</td></tr><tr><td>聚（苯乙烯）&lt;sub&gt;1.8k&lt;/sub&gt;</td><td>Polymer Source</td><td>P2275-S</td><td>示例疏水性核材料</td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔滑动塑料注射器，1ml（100支装）</td><td>National</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糊精DE 4-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>419672-100G</td><td></td></tr><tr><td>聚（苯乙烯-b-丙烯酸），PS&lt;sub&gt;5k&lt;/sub&gt;-b-PAA&lt;sub&gt;4.8k&lt;/sub&gt;</td><td>Polymer Source</td><td>P5917-SAA</td><td>根据具体应用，其他嵌段尺寸亦可接受</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-25G</td><td>具有吸湿性。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋清白蛋白（卵白蛋白，OVA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-1G</td><td></td></tr><tr><td>多入口涡流混合器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>工程图纸请参见补充信息。有关新型混合器的验证，请查阅正文</td></tr><tr><td>出口接头 - MIVM</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-942</td><td>与卡套组合使用</td></tr><tr><td>出口管路 - MIVM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适配卡套内径</td></tr><tr><td>O型圈（MIVM）</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>批量订购——消耗性部件。若使用其他来源，请确保其与溶剂兼容。</td></tr><tr><td>混合器支架</td><td>NA</td><td>NA</td><td>设计请参见Markwalter &amp; Prud'homme的研究&lt;sup class=&quot;xref">17&lt;/sup&gt;</td></tr></tbody></table>

用于在聚合物纳米颗粒中包载疏水性和亲水性化合物的闪速纳米沉淀法

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

将治疗性化合物制备成纳米颗粒（NPs）可赋予其独特的性质。对于水溶性差的药物，纳米颗粒制剂可提高其生物利用度，并改变药物在体内的分布。对于肽类或蛋白质等亲水性药物，包封于纳米颗粒中还可使其免受体内自然清除机制的降解。目前可用于制备可规模化生产的聚合物纳米颗粒的技术较少。闪速纳米沉淀法（FNP）是一种利用工程化混合结构来制备纳米颗粒的技术，所得颗粒具有较窄的粒径分布，并可在30至400 nm范围内调节粒径。本实验方案详细说明了在实验室规模下，利用FNP技术制备目标粒径的核-壳结构聚合物纳米颗粒的方法。该方案只需稍作修改，即可用于包封亲水性或疏水性化合物。该技术可在实验室中以毫克级规模进行制剂筛选，筛选出的优选配方可直接放大至克级甚至千克级。作为一种连续化工艺，放大过程仅需延长混合过程的运行时间，而无需更换新的反应容器。通过FNP制备的纳米颗粒具有高载药量、致密的稳定聚合物刷结构，且粒径重现性可达±6%。

使用FNP对纳米颗粒（NP）制剂进行筛选快速且所需材料量少（约为1-10 mg）。通过FNP方案包载疏水性化合物（如维生素E）（步骤1）可形成稳定、澄清或轻微乳光的纳米颗粒分散液。动态光散射（DLS）是一种可靠的粒径表征方法。如图3所示，该工艺可重复地制备出低多分散性的纳米颗粒。典型的多分散系数（PDI）小于0.20，表明颗粒群体相对均一。PDI由自相关函数计算获得，通常由仪器软件自动提供。它是二阶矩与一阶矩的比值，对于单分散颗粒，其值通常约为0.126。在所报道的四组维生素E/PS-b-PEG制剂重复实验中，PDI为0.12 ± 0.02，平均粒径为107 ± 7 nm。一种典型的“失效”情况（由注射器推压不均或推压速度过慢引起）也在图3中进行了报道。该情况下多分散性未受影响，但粒径略大（135 nm）。若包含此样本，粒径的新统计结果为113 ± 14 nm。发生“失效”时，混合腔内会出现仅有一种流体单独存在的时段。确保整个流体经历相同的加工历史以及在混合器内有机相与水相的相对体积一致至关重要。若无稳定剂存在，则会形成含有可见聚集体的不透明溶液。该样品的DLS自相关函数呈非单调性，且衰减不平滑，如图3插图所示。
通过FNP控制粒子尺寸的效果如图4所示，在此实验中，通过改变核心材料（此处为聚苯乙烯1.8k）与PS-b-PEG稳定剂的相对用量，所得粒子尺寸在49–152 nm范围内变化。这些粒子由含有核心材料和稳定剂总质量浓度为20 mg/mL的THF流体制备而成，其中聚苯乙烯核心材料占总质量的25%、50%或75%。所制备纳米粒子的多分散性始终低于0.15。关于FNP过程中参数对粒子尺寸影响的详细讨论可参见文献10。通过保持溶剂体积恒定，并调节核心材料与稳定剂储备液的相对体积，可调节载药量。同样，通过配制浓度不同于10 mg/mL的储备液，也可调节总质量浓度。在某些条件下，可通过动态光散射（DLS）观察到空 micelle 的群体27，这除了导致测得的粒子尺寸分布变宽外，并无其他不利影响。当两类粒子尺寸相近时，该现象可能表现为单一的宽峰，而非两个分离的峰。
相同的CIJ混合器也可用于通过iFNP封装亲水性化合物，如方案步骤2所示。在所报道的配方中制备的颗粒粒径约为65 nm，多分散系数为0.08。粒径分布如图5A（虚线）所示。通过DLS分析在强溶剂（如DMSO）中交联PAA羧酸残基对颗粒稳定性的影响，如图5B所示。充分交联颗粒的自相关函数应起始于接近1的值，并在与颗粒尺寸相关的特征时间迅速下降至0（实线）。发生显著溶胀或溶解的颗粒未充分交联，其自相关信号极弱（点线）。iFNP实验失败的表现与上述FNP类似，可能观察到可见的聚集体或DLS自相关函数曲线形状不佳。当由于溶解度或化学不相容性等系统限制需要超过两个进样流路时，可使用MIVM进行FNP或iFNP。带有混合器支架的小型MIVM（即μMIVM）如图2所示。与CIJ类似，该混合器也可用于封装疏水性或亲水性化合物22。在步骤3中，描述了通过iFNP封装亲水性蛋白OVA的实验方案。颗粒粒径分布如图5A（实线）所示，粒径约为125 nm，PDI为0.16。步骤4提供了在更大规模下使用注射泵操作的一般性方案。
<img alt="溶剂-反溶剂淬灭装置；示意图、实验装置、纳米颗粒形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：混合器组件及内部流型示意图。（A）受限撞击射流（CIJ）混合器连接注射器后置于淬灭浴上方。图中未显示淬灭浴小瓶中的搅拌子和搅拌板。放大图展示了混合结构，显示两股流体入口在腔室中心对撞。（B）多入口涡旋混合器（μMIVM）配有玻璃注射器，并安装在支架上，位于淬灭浴上方。图中已裁剪掉移动板和机械限位装置。放大图示意性地展示了涡旋腔室和入口通道。（C）通过FNP法制备的核-壳纳米颗粒的示意图。红色球体代表治疗剂，与蓝色的塌缩聚合物链段共同构成纳米颗粒的核心。黄色聚合物链段形成刷状层，为纳米颗粒提供空间稳定作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="压缩测试装置示意图，标注了可移动板、机械止挡、支撑板等组件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：μMIVM的术语说明及组装组件。 μMIVM需要使用混合支架，以实现对四个注射器的均匀按压。在此情况下，必须确保所有注射器推杆的高度一致，以保证混合的均一性。该装置也可选择使用注射泵进行操作。图中左侧展示了带有标注组件的混合支架。右侧为已拆解的混合装置，其中O型圈已安装在混合几何盘上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="归一化强度图显示纳米颗粒尺寸分布，内嵌图为相关时间与强度关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：由维生素E核心及PS-b-PEG稳定的聚合物纳米颗粒的粒径分布。 动态光散射（DLS）提供基于强度加权的粒径分布，反映纳米颗粒（NP）直径分布情况。曲线为每次实验三次重复分析的平均值，并已重新调整比例以使各峰值最大高度一致。四次重复实验（实线）表明该方法具有高度可重复性（标准偏差 = 7 nm）。图中还包含一次代表性异常结果（虚线），由注射器推进速度过慢或两个注射器按压不均所致，导致颗粒直径增大。若计入异常结果，纳米颗粒尺寸的标准偏差为14 nm。（内嵌图） 在无PS-b-PEG稳定剂的情况下，会形成较大的微米级聚集体（或对于维生素E等油类而言为液滴）。图中显示了未加稳定剂实验组的DLS自相关函数（虚线），以及一次纳米颗粒重复实验的代表性自相关曲线（实线）。自相关函数显示出对照样品存在多个特征时间尺度，表明其为多分散体系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒尺寸分布图；不同核心百分比，归一化强度与直径的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过调节核心材料与稳定剂的相对比例，利用 FNP 控制颗粒尺寸。 图中显示了三种以聚苯乙烯为核、PS-b-PEG 为稳定剂的配方的强度加权尺寸分布。THF 中的总质量浓度为 20 mg/mL，反溶剂为水。配方在 CIJ 混合器中制备。图例中列出了核心材料所占的质量分数。例如，25% 核心样品含有 5 mg/mL 聚苯乙烯和 15 mg/mL PS-b-PEG。25%（实线）、50%（虚线）和 75%（点划线）核心含量样品的平均粒径分别为 49 nm、96 nm 和 152 nm。所有样品的 PDI 值均小于 0.15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒尺寸分布与相关函数图；动态光散射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：在 CIJ 混合器或 μMIVM 中制备的倒置纳米颗粒的表征。 (A) DLS 曲线为每种配方三次重复分析的平均值。虚线表示在 CIJ 混合器中制备的 3k MD 颗粒的尺寸分布，实线表示在 μMIVM 中制备的 OVA 颗粒的尺寸分布。(B) 可使用 DMSO 作为稀释剂，通过 DLS 评估交联强度。DLS 自相关函数通过初始自相关值以及观察到向零值的清晰转变来反映交联强度。虚线描绘了无交联剂颗粒的自相关函数，显示初始信号较弱且衰减时间较宽。实线描绘了添加强交联剂（本例中为四乙烯五胺）后的自相关函数，显示初始信号较强且衰减时间尺度明确。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="过饱和度与有机溶剂；比较肽B和啶酰菌胺溶解度水平的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：过饱和度 S 随有机溶剂与水相对混合比例的变化关系。（A）对（○）啶酰菌胺（一种农药）和（■）肽B（一种七残基模型肽）所能达到的最高过饱和度的比较。有机相中啶酰菌胺的浓度为 230 mg/mL，肽B为 200 mg/mL，均为其饱和浓度。每种活性药物成分（API）/溶剂体系均存在一个最大过饱和度。（B）当有机相中啶酰菌胺的浓度降低20倍时，实现过饱和和纳米沉淀的条件范围将受到限制。本图经Elsevier许可转载9。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/Supplemental_Files.zip" target="_blank">请点击此处下载文件。</a>

闪速纳米沉淀法（FNP）是一种可放大的制备聚合物核-壳纳米颗粒的方法。本文描述了用于包载疏水性或亲水性治疗药物的实验室规模配方。

将治疗性化合物制备成纳米颗粒（NPs）可赋予其独特的性质。对于水溶性差的药物，纳米颗粒制剂可以……

此处展示的闪速纳米沉淀（FNP）技术为将疏水性或亲水性化合物包封于聚合物纳米颗粒内部提供了一种可扩展且简便的平台。为便于说明，用于包封生物大分子的技术称为逆向闪速纳米沉淀（IFNP）。其基本原理保持不变，但所得纳米颗粒的结构有所不同。通常，新用户在手动制备少量纳米颗粒时，需要经过练习才能熟练掌握进样注射器的操作。使用计算机控制的注射泵可以制备更大体积的样品。本方案还提供了关于纳米颗粒溶液后续处理的详细信息，这对于制剂的成功应用往往至关重要。开始操作前，检查CIJ混合器接头，并确保出口管路未被压扁。然后，用两到三毫升丙酮或其他清洗溶剂填充两个五毫升聚丙烯无橡胶鲁尔锁紧注射器。将注射器锁入入口接头中，并将整个装置置于废液容器上方。在数秒内缓慢按压推杆，使溶剂流经混合室。然后取下注射器，并用氮气流干燥混合物。接下来，开始准备溶剂进样流：将0.25毫升浓度为10毫克/毫升的维生素E溶液（溶于不含稳定剂的四氢呋喃中）移入1.5毫升的微量离心管中。然后，用移液器将0.25毫升浓度为10毫克/毫升的嵌段共聚物稳定剂THF溶液加入同一离心管中。涡旋混合5至10秒，随后在1,000 ×g条件下离心5至10秒，以回收附着在管盖上的液体。另准备一个含有0.525毫升去离子水的1.5毫升离心管，作为反溶剂。然后，用移液器将四毫升去离子水加入一个 20 毫升的闪烁瓶中，以制备淬灭浴。在瓶中放入一个小的搅拌子。将洁净的 CIJ 混合器置于淬灭浴上方，并放置在搅拌器上的试管架或试管块中。将淬灭浴以最大可能速度的75%左右开始搅拌。然后，将一个平头针头安装到一支1毫升聚丙烯无橡胶活塞的注射器上，并吸取反溶剂。小心地从注射器中排出气泡，随后取下并妥善处理针头。调节活塞，使液体刚好到达注射器末端。然后将注射器连接至其中一个CIJ入口。以相同方式将溶剂混合物吸入第二个注射器，并将其连接至另一个入口。为制备纳米颗粒，需在不到0.5秒的时间内以平稳均匀的动作同时下压两个推进杆。快速、均匀且平稳地下压注射器至关重要。操作时不应突然撞击注射器，而应在开始动作前就已与注射器顶部保持接触，并由此连续推动。随后，将 CIJ 混合器置于废液容器上方，不要取下注射器，以确保滞留体积不会流入分散液中。从闪烁瓶中取出搅拌子，并盖上瓶盖。然后，取下并丢弃溶剂和反溶剂注射器。在下一次闪蒸纳米沉淀实验前清洁混合器。为进行动态光散射分析，将100 µL分散液用移液器加入比色皿中。加入900 µL淬灭浴溶剂，在开始样品分析前通过移液充分混合。开始组装微型MIVM时，先将O形圈放入混合结构圆盘中。将混合圆盘上的孔与上部圆盘上的定位柱对齐，并小心地将其组装在一起，注意不要使O形圈移位。松开底部接收器上的出口管路接头，然后将已连接的圆盘旋入接收器中。将扳手安装到上部圆盘的销钉上并拧紧组件。拧紧出口管路接头，使其紧贴混合结构圆盘的底面。确保上部圆盘上的注射器接头紧密贴合。将混匀仪支架上的移动板升起，使其远离工作区域，然后将组装好的混匀仪放置在支架上，并将出口管路穿过支撑板。接着，将一个含有5.25毫升氯仿的15毫升离心管作为淬灭浴置于出口管路下方，该氯仿用于终止反应。随后，用一支1毫升气密性鲁尔锁接头平头针头注射器吸取0.75毫升溶液A，溶液A为5毫克/毫升的卵清蛋白在二甲基亚砜中含10%体积水的溶液。小心排出气泡，取下针头，并将溶液推至鲁尔接头末端进行预润。将注射器连接到混合器入口。用0.75毫升的溶液B和0.75毫升的溶液C重复此操作，其中溶液B为含6毫克/毫升嵌段共聚物稳定剂的DMSO溶液，溶液C为四氢呋喃（THF）。按顺时针方向、以字母顺序将注射器连接到混合器的入口。准备一支2.5毫升的气密注射器，其中装有1.85毫升溶液D（即氯仿），并将其连接到第四个入口。确认各注射器的高度无明显差异。然后，小心地握住移动板两侧的轴承座，缓慢降低该板，直至其刚好均匀地轻轻接触注射器顶部。为生成纳米颗粒，以稳定且平滑的动作在约0.5至1秒内下压该板。随后，取下淬灭浴管并盖上盖子。使用完毕后，拆卸并清洗混合器。若需处理较大体积的溶液，可将溶液装入气密性注射器中，并使用鲁尔接头将聚四氟乙烯管路连接至注射器，然后将溶液预充至管路末端。将注射器固定在注射泵中，并将管路连接至相应的混合器入口。在出口管路下方放置一个小的废液管，用于收集启动时的废液体积。准备好淬灭浴并置于附近。同时启动泵，使约五毫升的流出液流入废液瓶中。然后，照常开始在淬灭浴中收集纳米颗粒。如有需要，可使用搅拌器搅拌淬灭浴。在CIJ混合器中制备的具有疏水性内核的聚合物纳米颗粒FNP样品，四个重复实验显示出高度可重复性，且粒径相对均一，平均直径为107纳米。一次因注射器推进过慢或不均匀导致的异常操作产生了略大的颗粒，而在此例中多分散性未受影响，但异常操作也可能导致更宽的粒径分布。代表性聚合物纳米颗粒样品的动态光散射（DLS）自相关函数衰减曲线平滑。当尝试在没有嵌段共聚物稳定剂的情况下进行制剂时，未观察到这种平滑衰减现象，而是形成了微米级的油滴。核心材料与稳定剂的相对比例控制了粒子尺寸，如本实验中以聚苯乙烯为核的纳米粒子所示。每种制剂的PDI均低于0.15。通过IFNP方法制备了具有亲水性核心的纳米颗粒。在CIJ混合器中制备的麦芽糊精核心颗粒直径约为65纳米，多分散系数（PDI）为0.08。在微流控MIVM中制备的卵白蛋白核心颗粒直径约为125纳米，PDI为0.16。FNP 和 IFNP 是用于处理分子和纳米颗粒的有力工具。在实施任一技术之前，务必要考虑各组分在所有溶剂或溶剂混合物中的溶解度，以确保混合过程中产生高度过饱和。该基本技术操作简单，但掌握注射器推注步骤需要一定练习。如果在此过程中遇到困难，可考虑使用如本视频所示的注射泵装置，以提高实验的一致性。对于带电的亲水性分子或具有中等溶解度的分子，可将FNP与疏水性离子配对技术结合，以实现高效的包封。FNP还可用于在同一纳米颗粒核心中包封多种化合物。请查阅本文及其他文献资源，了解如何在您所需的应用中最佳地从纳米颗粒分散液中去除有机溶剂。此外，还有一系列技术可用于在储存期间稳定纳米颗粒。

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