利用哺乳动物双杂交实验检测雌激素受体α配体结合结构域的二聚化活性

因此，该方法有助于解答关于雌激素样配体调控雌激素受体α的能力以及选择性雌激素受体调节剂作用机制的关键问题。该技术的主要优势在于其操作简便，可在细胞内展示配体依赖性的雌激素受体α配体结合域二聚化活性。

本实验操作将由本课题组的博士后学生 Tanner Jefferson 演示。该方法利用三种不同的质粒在细胞内检测雌激素受体配体结合域的二聚化活性。pG5-Luc 是用于检测二聚化活性效能的荧光素酶报告质粒。

pBIND 小鼠雌激素受体α EF 是一种半乳糖响应型转录因子 GAL4 DNA 结合域，与小鼠雌激素受体α 配体结合域融合表达的质粒，可结合至 pG5-Luc 报告质粒上的 GAL4 响应元件。pACT 小鼠雌激素受体α EF 是一种单纯疱疹病毒转录激活蛋白 VP16 激活域与小鼠雌激素受体α 配体结合域融合表达的质粒，不能直接结合 pG5-Luc 报告质粒。当存在适当的配体时，由 pBIND 小鼠雌激素受体α EF 和 pACT 小鼠雌激素受体α EF 质粒表达的蛋白质可通过雌激素受体α 配体结合域相互结合。

二聚化的效率由荧光素酶活性决定。最关键的步骤是控制pBIND小鼠雌激素受体α EF衍生蛋白的活性。在分析配体依赖性雌激素受体配体结合域二聚化活性之前，必须评估在不含pACT雌激素受体α EF质粒的情况下，每种配体中pBIND衍生的雌激素受体α配体结合结构域的活性。

每种质粒组合取两个1.5毫升微量离心管，分别加入相应的质粒组合。准备两种DNA混合物组合。第一管包含pG5-Luc、pBIND-雌激素受体α EF和空载体pACT质粒。

第二个管中含有 pG5-Luc、pBIND-雌激素受体α EF 和 pACT-雌激素受体α EF 质粒。为沉淀 DNA，向每管 DNA 混合物中加入 DNA 混合物体积的 1/9 的 3 M 醋酸钠以及 20 倍体积的 100% 乙醇，然后涡旋振荡各管。将混合物于 20 摄氏度下孵育过夜，次日早晨以最高速度离心。

弃去上清液，每管中用120微升75%乙醇重悬不可见的沉淀，注意冲洗管壁内侧粘附的DNA。在相同条件下再次离心后，弃去上清液，并将DNA在真空浓缩仪中干燥30分钟。进行转染时，用0.5毫升室温PBS每洗一次，共洗涤两次已准备好的人肝细胞癌细胞，然后每孔加入0.5毫升新鲜的37摄氏度、不含酚红的MEM培养基，培养基中添加10%去炭处理的热灭活胎牛血清和2毫摩尔L-谷氨酰胺。

接下来，根据孔数，在多个1.5毫升微量离心管中，用适当体积的DMEM悬浮干燥的质粒DNA混合物和转染试剂。向每管含有DMEM悬浮质粒DNA的混合物中加入等体积的转染试剂培养基。室温孵育5至10分钟后，取25微升DNA混合物加入至24孔人肝细胞癌细胞培养板的相应实验孔中，在细胞培养箱中进行6小时的转染。

孵育结束后，将转染培养基更换为每孔 0.5 毫升新鲜的 37 °C 酚红-free MEM，该培养基添加有 10% 去炭处理并经热灭活的 FBS、2 毫摩尔 L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素，并按每孔加入配体，然后将细胞放回细胞培养箱中继续孵育 16 至 18 小时。次日早晨，用每孔 1 毫升 PBS 洗涤细胞，并用每孔 100 微升被动裂解缓冲液将各孔细胞刮下，随后使用涡旋振荡器剧烈震荡混匀。然后将细胞裂解液在液氮中速冻。

在进行双荧光素酶检测当天，将裂解液置于摇床上振荡，直至培养板达到室温，然后将10微升裂解液转移至96孔白色塑料板的各个孔中。随后使用酶标仪检测每份细胞裂解液样品的荧光素酶活性。用10纳摩尔雌二醇处理转染了pBIND小鼠雌激素受体α EF和pACT质粒的细胞，可刺激荧光素酶活性，因为雌激素受体α的配体结合结构域含有配体依赖性转录激活功能域AF-2。

然而，1 和 10 纳摩尔浓度的处理可诱导转染了 pBIND 与 pACT 小鼠雌激素受体 α EF 质粒组合的细胞中荧光素酶活性，表明该方法可用于评估在高达 1 纳摩尔雌二醇处理条件下雌激素受体 α 配体结合域的二聚化活性。使用 4-羟基他莫昔芬处理时，在转染了 pBIND 小鼠雌激素受体 α EF 和 pACT 质粒的细胞中未引发荧光素酶活性，表明该配体不能激活雌激素受体 α 的 AF-2 功能。然而，高达 10 纳摩尔浓度的 4-羟基他莫昔芬可诱导转染了 pBIND 与 pACT 小鼠雌激素受体 α EF 质粒组合的细胞中荧光素酶活性，提示该方法适用于评估在高达 10 纳摩尔 4-羟基他莫昔芬处理条件下雌激素受体 α 配体结合域的二聚化活性。

pBIND 与 pACT 小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域表达质粒联用 4-羟基他莫昔芬时的活性显著高于 pBIND 与 pACT 人源雌激素受体 α 配体结合结构域表达质粒的组合。这表明，小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域的 4-羟基他莫昔芬依赖性同源二聚化活性强于人源雌激素受体 α 配体结合结构域。此外，含有 人源 F 结构域的小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域的 4-羟基他莫昔芬依赖性同源二聚化活性显著低于野生型小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域。

相比之下，含有小鼠F结构域的人雌激素受体α配体结合结构域的4-羟基他莫昔芬依赖性同源二聚化活性显著高于野生型人雌激素受体α配体结合结构域。这表明F结构域对物种特异性的4-羟基他莫昔芬依赖性雌激素受体α配体结合结构域同源二聚化活性具有影响。在进行该实验操作时，重要的是要记得检测GAL4 DNA结合结构域与雌激素受体α配体结合结构域融合蛋白在所用配体条件下的基础活性。

该活性应与载体处理相同。