Name: 利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α的配联域二维化活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α配联域的二维化活性，该方法使用三种质粒和荧光素酶报告基因，可在细胞水平评估配体依赖性受体二聚化，为选择性雌激素受体调节剂研究提供简便可靠的技术手段。

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作者感谢美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）的Sueyoshi博士和Wang博士对稿件的审阅，以及Tanner Jefferson完成视频中的操作步骤。&#160;本研究由NIEHS所内研究部资助，获美国国立卫生研究院资助项目1ZIAES070065（授予K.S.K.）支持。&#160;

1. 哺乳动物双杂交实验质粒的制备
<ol>
	<li>使用以下质粒：pG5-Luc、pBIND-ER&#945;EF和pACT-ER&#945;EF 
	注意：质粒可应作者要求获取，将以滤纸形式寄送。pG5-Luc 是报告质粒，包含五个重复的 GAL4 应答元件与荧光素酶表达单元的融合序列图1A). pBIND-ER&#945;EF 是编码 GAL4DBD 融合 ER 蛋白的表达质粒&#945; LBD 蛋白。pBIND-ER&#945;EF 包含一个用于标准化转染效率的 Renilla 荧光素酶表达单元（图1B). pACT-ER&#945;EF 是编码 VP16AD 融合 ER 蛋白的表达质粒&#945; 配体结合域蛋白（LBD）图1C）。质粒表达的蛋白质结构示意图如下所示 图2.</li>
	<li>制备质粒DNA。
	<ol>
		<li>使用干净的剪刀从纸片上剪下含有质粒的区域，并将其放入1.5 mL离心管中。佩戴手套，用洁净的镊子夹取含质粒的纸片。加入100 &#181;Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH 8.0）L，充分涡旋混匀。</li>
		<li>加入1 &#181;来自步骤 1.2.1 的质粒 DNA 溶液 L 至感受态 大肠杆菌 细胞（参见 材料表）并将离心管置于冰上15分钟。</li>
		<li>将加入质粒的感受态细胞进行热激；将离心管置于42℃水浴中孵育 &#176;在37°C水浴中孵育30秒，然后置于冰上2分钟。</li>
		<li>加入250 &#181;向离心管中加入适量体积的含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤（SOC）培养基（室温），并在37℃振荡培养 &#176;30 分钟，37°C</li>
		<li>铺板 100 &#181;培养液中的 L E. coli 到预热的含100的Luria肉汤（LB）平板上 &#181;g/mL 氨苄青霉素（10 cm 直径培养皿），并在 37℃ 培养 &#176;C 过夜。</li>
		<li>从平板上挑取一个菌落，加入含有2 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的优质肉汤（TB）的14 mL离心管中 &#181;g/mL 氨苄青霉素。37℃振荡培养 &#176;C，直至培养基轻微浑浊。</li>
		<li>将1.2.6步骤中培养的培养基1 mL加入含有50 mL TB和100的灭菌250 mL玻璃烧瓶中 &#181;g/mL 氨苄青霉素。37℃振荡培养 &#176;C，20 - 24 小时。</li>
		<li>转移培养的 E. coli 加入50 mL锥形管中，3,450 × g离心 g 在室温下使用摆桶转子离心30分钟。弃去上清液，保留沉淀 E. coli -80℃下离心收集沉淀 &#176;C.</li>
		<li>加入3 mL细胞重悬液（参见 材料表) 到 E. coli 沉淀并充分悬浮。加入3 mL细胞裂解液（参见 材料表），轻轻翻转离心管10次混匀，冰上静置5分钟（准确计时）。加入6 mL中和液（见 材料表），轻轻敲击混匀，然后冰上静置10分钟。</li>
		<li>将管子在 3,450 x g 在4时 &#730;C，使用摆桶转子离心30分钟。将含有DNA的溶液转移至新的50 mL锥形管中，并加入10 mL DNA纯化树脂（参见 材料表轻轻悬浮树脂。</li>
		<li>以 625 × g 离心试管 g 使用摆桶转子离心1分钟。弃去上清液，保留底部的树脂。</li>
		<li>加入15 mL柱洗涤液（80 mM醋酸钾，8.5 mM Tris-HCl [pH 7.5]，40 &#181;将 M EDTA 和 55% 乙醇加入 50 mL 锥形管中，轻轻振荡以悬浮树脂。重复步骤 1.2.11。 
		注意：必须使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水或无核酸酶水配制柱洗涤液。</li>
		<li>向50 mL离心管中加入5 mL柱洗涤液，用5 mL移液器重悬树脂。将树脂上样至层析柱（见 材料表）设置在真空 manifold 上。抽真空至柱内树脂干燥。向柱中加入 6 mL 柱洗涤液，然后抽真空。</li>
		<li>树脂在视觉上干燥后，将储液槽从层析柱上拆下。将层析柱的底部（含树脂）转移至1.5 mL离心管中。使用微量离心机以最大转速离心2分钟，彻底干燥树脂。</li>
		<li>将柱子的下部（树脂）转移至新的1.5 mL离心管中。加入300 &#181;将 L 无核酸酶水加入柱中，静置直至整个树脂完全浸润。</li>
		<li>以最大转速离心柱子1分钟，收集含有质粒DNA的溶液（200 - 250 μL） &#181;L).</li>
		<li>用酚-氯仿（1:1）处理含DNA的溶液，随后用氯仿处理如下。
		<ol>
			<li>向含有 DNA 的溶液（200 - 250）中加入等体积的苯酚-氯仿（1:1） &#181;L），充分混匀，使用微量离心机以最大速度离心2分钟。收集上层液体（含DNA的溶液），转移至新的1.5 mL离心管中。重复此步骤1次。</li>
			<li>向含有 DNA 的溶液中加入等体积的氯仿（200 - 250） &#181;L），充分混匀，最大转速离心1分钟。收集上层液体（含DNA的溶液），转移至1.5 mL离心管中。 
			注意：内毒素（脂多糖）可在某些细胞中诱导细胞信号转导。为避免此类不可预知的影响，建议执行步骤 1.2.17，该步骤可减少内毒素污染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用乙醇沉淀法沉淀质粒DNA，步骤如下。
		<ol>
			<li>加入 DNA 混合物体积的 1/9&#160;3 M 醋酸钠（pH 5.5）和 3 M 醋酸钠体积的 20 倍&#160;向含DNA的溶液中加入100%乙醇。例如，加入27.8 &#181;3 M 醋酸钠的 L 和 278 &#181;250 微升 100% 乙醇 &#181;DNA 溶液的 L（最终体积为 555.8） &#181;L).</li>
			<li>将溶液保存在 -80 &#176;4℃下以最大速度离心20分钟，至少20分钟。 &#730;C. 弃去上清液，保留沉淀。加入 200 &#181;75% 乙醇洗涤管内壁，4 ℃ 离心 20 分钟 &#176;C，弃去溶液，保留沉淀。使用真空浓缩仪将DNA沉淀干燥。</li>
			<li>加入 100 - 250 &#181;加入适量 TE 缓冲液（pH 8.0）至离心管中，溶解 DNA 沉淀，并在 260 nm 波长下使用分光光度计测定 DNA 浓度。将 DNA 浓度调整至约 0.5 mg/mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 哺乳动物双杂交实验
<ol>
	<li>维持细胞。
	<ol>
		<li>在750 mL、175 cm2的组织培养瓶中，使用不含酚红的最低必需培养基（MEM），并添加10%胎牛血清（FBS；热灭活）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素溶液（抗生素）来培养人肝细胞癌HepG2细胞，以维持细胞生长。</li>
		<li>将细胞在含5% CO2、37 °C的培养箱中培养，直至细胞融合度达到约90%。 
		注意：为减少雌激素背景活性，所有M2H实验均应使用不含酚红的培养基。此步骤应在洁净台/生物安全柜内进行。细胞培养应遵循通用的哺乳动物细胞培养方案7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备细胞用于转染。 
	注意：以下操作步骤均应在洁净台/生物安全柜内进行。本步骤中，细胞每次均在含5% CO2、37 °C的培养箱中培养/孵育。
	<ol>
		<li>将融合度约为90%的细胞重新接种至24孔板中；用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞1次。</li>
		<li>向培养瓶中加入7 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温下静置1–2分钟，期间将培养瓶置于洁净台中。吸除部分胰蛋白酶-EDTA溶液，保留1–2 mL于瓶内，随后将培养瓶放入培养箱中孵育1–2分钟。</li>
		<li>轻拍培养瓶底部使细胞脱落，并在显微镜下观察细胞状态。 
		注意：若细胞仍附着于瓶壁，继续孵育1–2分钟，然后重复步骤2.2.3。</li>
		<li>将细胞重悬于含10%活性炭处理FBS（热灭活）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素溶液的不含酚红MEM培养基中。 
		注意：必须使用活性炭处理的FBS，以降低血清来源内源性雌激素的影响。</li>
		<li>计数细胞数量，并以每孔1.2 × 105个细胞的密度接种至24孔板中。每个数据点设三个重复孔（三复孔）。</li>
		<li>将细胞培养过夜。继续进行步骤2.4.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于转染的DNA混合物。 
	注意：以下质粒DNA在单个孔中共转染：100 ng pG5-Luc报告质粒、50 ng GAL4DBD融合蛋白表达质粒（pBIND）和50 ng VP16AD融合蛋白表达质粒（pACT）。
	<ol>
		<li>为分析配体依赖性ERα LBD二聚化活性，准备以下组合（图3）。组合（i）：pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT，以及pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT。组合（ii）：pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT-hERαEF，以及pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF。组合（iii）：pG5-Luc + pBIND + pACT-hERαEF，以及pG5-Luc + pBIND + pACT-mERαEF。 
		注意：组合（i）分别代表人ERα LBD和小鼠ERα LBD的基础实验水平。如果结果显示仅配体处理组活性显著升高，则该方法不适用于该配体（例如，二乙基己烯雌酚[DES]）。组合（ii）分别代表二聚化的人ERα LBD和小鼠ERα LBD的水平。组合（iii）为阴性对照；仅在首次进行实验时使用，以评估系统的背景水平。</li>
		<li>混合前，根据转染孔数计算所需总DNA量。对于三复孔、五个数据点的实验，在两个1.5 µL离心管中分别配制组合（i）和（ii）所需的质粒DNA：pG5-Luc，5（数据点）× 3（孔）× 100 ng = 1,500 ng（15 µL）；pBIND-mERαEF，5 × 3 × 50 ng = 750 ng（7.5 µL）；pACT（组合i）或pACT-mERαEF（组合ii），5 × 3 × 50 ng = 750 ng（7.5 µL）。 
		注意：各质粒DNA溶液浓度为0.1 µg/µL。</li>
		<li>采用乙醇沉淀法沉淀DNA混合物。向DNA混合物中加入相当于其体积1/9的3 M醋酸钠（pH 5.5）和相当于3 M醋酸钠体积20倍的100%乙醇，然后涡旋混匀。 
		注意：例如，向步骤2.3.2中示例的30 µL质粒DNA混合物中加入3.4 µL 3 M醋酸钠和34 µL 100%乙醇。此步骤有助于保持转染条件的一致性，无需在生物安全柜中进行。</li>
		<li>将混合物在-20 °C下保存过夜。在4 °C下以最大转速离心20分钟。弃去上清液（沉淀不可见）。向管中加入120 µL 75%乙醇，冲洗管内壁，再次在4 °C下离心20分钟。弃去上清液，并使用真空浓缩仪干燥DNA沉淀30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行转染。 
	注意：以下步骤应在洁净台或生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>次日早晨，用0.5 mL PBS（室温）将接种于24孔板中的细胞（来自步骤2.2.6）冲洗2次。</li>
		<li>向每孔加入预热（37 °C）的新鲜不含酚红MEM培养基，该培养基含10%活性炭处理FBS（热灭活）和2 mM L-谷氨酰胺，但不含抗生素（每孔0.5 mL培养基）。将细胞置于含5% CO2、37 °C的培养箱中孵育。</li>
		<li>将干燥的质粒DNA混合物（来自步骤2.3.4）溶于无血清、不含酚红、不含谷氨酰胺的DMEM培养基中（每孔13 µL）。根据转染孔数计算所需DMEM体积。 
		注意：组合（i）15孔 × 13 µL = 195 µL，组合（ii）15孔 × 13 µL = 195 µL。</li>
		<li>在另一支1.5 mL离心管中，将转染试剂（见材料表；每孔1.5 µL）溶于DMEM（每孔12.5 µL）。根据转染孔数计算所需转染试剂和DMEM的体积。 
		注意：30孔（组合i 15孔 + 组合ii 15孔）× 1.5 µL转染试剂 + 30 × 12.5 µL DMEM = 420 µL。</li>
		<li>将等体积的转染试剂-DMEM混合液（来自步骤2.4.4）加入各DNA混合管（来自步骤2.4.3）中。室温孵育5–10分钟。 
		注意：200 µL转染试剂混合液 + 195 µL组合（i）DNA混合物 = 395 µL，200 µL转染试剂混合液 + 195 µL组合（ii）DNA混合物 = 395 µL。必须向组合（i）和（ii）的管中加入等体积的转染试剂混合液。此步骤无需用尽全部混合液。</li>
		<li>将混合后的转染液（来自步骤2.4.5）加入24孔板各孔中（每孔25 µL）（来自步骤2.4.2），并在含5% CO2、37 °C的培养箱中孵育6小时。</li>
		<li>移除转染培养基。向每孔加入预热（37 °C）的新鲜不含酚红MEM培养基，该培养基含10%活性炭处理FBS（热灭活）、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素溶液以及溶解于乙醇中的配体（每孔0.5 mL培养基）。在含5% CO2、37 °C的培养箱中继续培养16–18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集样品。
	<ol>
		<li>用1 mL PBS冲洗细胞，然后加入100 µL 1×被动裂解缓冲液（见材料表）。</li>
		<li>使用涡旋振荡器剧烈震荡24孔板，使细胞充分脱落。</li>
		<li>使用液氮速冻一次（或保存于-80 °C）24孔板（细胞裂解物），分析前立即从-80 °C取出，在摇床上剧烈震荡至恢复室温。 
		注意：此步骤可防止荧光素酶活性出现异常波动值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行双荧光素酶检测。
	<ol>
		<li>准备双荧光素酶检测系统试剂（见材料表）。
		<ol>
			<li>配制荧光素酶检测底物（LAS）缓冲液：将全部荧光素酶检测缓冲液加入装于棕色玻璃瓶中的荧光素酶检测底物中。将LAS缓冲液保存于-20 °C。 
			注意：使用前应将LAS缓冲液恢复至室温。</li>
			<li>配制海肾荧光素酶底物（RLS）缓冲液：按1:50比例混合海肾荧光素酶底物与海肾荧光素酶缓冲液。每次检测均需新鲜配制RLS缓冲液，并使用黑色管或锡箔纸包裹避光。根据需要计算RLS缓冲液配制量。 
			注意：使用前应将RLS缓冲液恢复至室温。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置微孔板读数仪的试剂通道。
		<ol>
			<li>用70%乙醇冲洗进样管路2次，再用水冲洗2次。 
			注意：此步骤对防止干扰检测结果至关重要。</li>
			<li>将LAS缓冲液设置为P进样通道（第一次注射），RLS缓冲液设置为M进样通道（第二次注射）。切勿混合两种缓冲液。RLS缓冲液会抑制荧光素酶活性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将10 µL收集的样品（来自步骤2.5.3）加入96孔白色塑料板中。</li>
		<li>设置微孔板读数仪参数：P进样通道设置为50 µL体积、2秒延迟、50 µL/s速度；M进样通道设置为50 µL体积、2秒延迟、50 µL/s速度。积分时间为15秒，温度设为25 °C。</li>
		<li>运行微孔板读数仪。</li>
		<li>使用数据采集程序（见材料表）记录荧光素酶活性值（IPValue）和海肾荧光素酶活性值（IMValue）。</li>
		<li>数据采集完成后清洗进样管路（参见步骤2.6.2.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行数据分析。
	<ol>
		<li>使用归一化值（IPValue/IMValue）进行数据分析。</li>
		<li>将组合（i）[pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pACT]在溶剂处理组（0 nM配体）下的归一化值设为1，用于计算基础水平和ERα LBD同源二聚体水平。结果以“相对活性”表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何声明。

本文中，我们描述了哺乳动物双杂交（M2H）实验的方案，以检测ERα LBD同源二聚化活性为例，重点介绍该实验的检测条件。通常情况下，M2H实验并不常用于评估配体依赖性的ERα LBD二聚化活性，原因是ERα LBD本身具有转录激活功能，该功能在某些情况下会干扰M2H实验的结果。然而，正如本文所示，M2H实验可用于分析那些不激活LBD的AF-2转录激活功能的特定物质的LBD二聚化活性。例如，4OHT，SERMs）。为了降低LBD的本底活性（背景活性），我们从生产批次中筛选出雌二醇（E2）含量最低的活性炭剥离胎牛血清（FBS），并使用经热灭活处理的活性炭剥离FBS。这些因素对于利用野生型ERα LBD成功开展M2H实验以及检测微弱的相互作用活性至关重要。此外，我们利用mERα-I362D突变体检测了激动剂（E2和DES）诱导的ERα LBD二聚化活性，该突变体可破坏AF-2结构域介导的激动剂依赖性共激活因子募集功能。这些结果表明，M2H实验在评估配体依赖性ERα LBD二聚化活性方面具有更高的应用价值。
在核受体（NR）研究领域，M2H实验已被用于评估核受体配体结合结...

雌激素受体α（ERα）是一种依赖雌激素配体的转录调控因子。ERα的氨基酸序列在不同物种间高度保守。由于人和小鼠ERα具有较高的同源性，通常认为这两种受体功能相同，而雌激素类物质（例如，他莫昔芬）在这两个物种中的活性差异主要源于物种间化学代谢的不同，而非ERα结构的差异。ERα具有高度保守的结构域，这些结构域在核受体（NR）超家族中普遍存在，被命名为A至F结构域。其中E结构域即配体结合结构域（LBD），包含配体结合口袋以及称为激活功能2（AF-2）的转录激活区域。F结构域紧邻E结构域，是核受体家族中变异程度最高的区域。即使在人和小鼠ERα之间，F结构域的同源性也显著低于其他结构域1。配体结合后的ERα LBD可促进ERα蛋白形成同源二聚体，直接结合特定的雌激素反应性DNA元件，从而调控配体依赖性的基因转录（ERα的经典作用机制）。晶体结构研究表明，当LBD二聚体分别结合雌二醇（E2）或4-羟基他莫昔芬（4OHT）时，螺旋12（AF-2核心结构域）的空间位置存在差异2,3。ERα的F结构域（45个氨基酸）直接连接螺旋12，但目前尚无关于这一从螺旋12延伸出的45个氨基酸（F结构域）对ERα LBD二聚化影响的研究报道。本研究利用哺乳动物双杂交（M2H）实验，揭示了F结构域在物种特异性的4OHT依赖性ERα LBD同源二聚化过程中的作用。
M2H检测是一种用于在哺乳动物细胞中证明蛋白质-蛋白质相互作用的方法，需引入三种不同的质粒DNA：两个蛋白表达质粒，分别表达GAL4 DNA结合域（DBD）融合的ERα LBD和VP16激活域（AD）融合的ERα LBD，以及一个带有GAL4反应元件（GAL4RE）的荧光素酶表达报告质粒。当GAL4DBD融合的ERα LBD与VP16AD融合的ERα LBD在细胞内发生相互作用（形成二聚体）时，该蛋白复合物会结合到GAL4RE上，并通过VP16AD依赖的转激活功能启动荧光素酶基因的表达。LBD同源二聚化的水平可通过荧光素酶活性进行评估。
酵母双杂交（Y2H）实验是一种基于相同原理的替代方法，以酵母作为宿主环境。先前使用Y2H系统的研究报道显示，F结构域截短的人类ERα LBD会增强E2依赖的共激活因子招募，由此得出结论：F结构域可抑制E2介导的转录4该结果与其他研究报道不一致，后者表明在哺乳动物细胞中，F区截短的人源ERα转录活性减弱。5,6最近，我们的研究利用M2H系统证明，在哺乳动物细胞中，人ERα LBD的E2依赖性共激活因子募集活性因F结构域截短而降低，并且与转录活性一致1这些观察结果表明，蛋白质-蛋白质相互作用的生理功能在不同细胞类型及特定环境下存在差异。M2H检测可在与测定转录活性相同的细胞环境中展示蛋白质-蛋白质相互作用活性，这使得M2H检测相较于Y2H或其他方法具有优势 体外 蛋白质-蛋白质相互作用分析
关于选择性雌激素受体调节剂（SERMs）部分激动活性的分子机制仍存在一些问题例如，4OHT）来调控ERα介导的转录。基于ERα配体结合域（LBD）的M2H检测方法可用于研究选择性雌激素受体调节剂（SERMs）在多种哺乳动物细胞类型中部分激动活性的作用机制。

<table><tbody><tr><td>pG5-Luc</td><td>Promega</td><td>E249A</td><td>CheckMate 哺乳动物双杂交系统组分</td></tr><tr><td>pBIND</td><td>Promega</td><td>E245A</td><td>CheckMate 哺乳动物双杂交系统组分</td></tr><tr><td>pACT</td><td>Promega</td><td>E246A</td><td>CheckMate 哺乳动物双杂交系统组分</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 化学感受态 E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>离心机转子</td><td>SORVALL</td><td>75006445</td><td></td></tr><tr><td>摆动桶</td><td>SORVALL</td><td>75006441</td><td></td></tr><tr><td>细胞重悬液（CRA）</td><td>Promega</td><td>A7112</td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解液（CLA）</td><td>Promega</td><td>A7122</td><td></td></tr><tr><td>中和液（NSA）</td><td>Promega</td><td>A7131</td><td></td></tr><tr><td>柱洗涤液（CWB）</td><td>Promega</td><td>A8102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midipreps DNA 纯化树脂</td><td>Promega</td><td>A7701</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midicolumns</td><td>Promega</td><td>A7651</td><td></td></tr><tr><td>MEM，无谷氨酰胺，无酚红</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100倍浓缩液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 胎牛血清（FBS）</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>炭吸附-葡聚糖处理胎牛血清</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-119</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，无谷氨酰胺，无酚红</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>5倍被动裂解缓冲液</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega</td><td>E1980</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax L 微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用哺乳动物双杂交实验检测雌激素受体α配体结合结构域的二聚化活性

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

雌激素受体α（ERα）是一种依赖雌激素配体的转录调控因子。ERα蛋白序列在不同物种间高度保守。人们普遍认为人和小鼠ERα的功能是相同的。我们利用哺乳动物双杂交（M2H）实验，展示了4-羟基他莫昔芬（4OHT）对小鼠与人ERα配体结合结构域（LBD）二聚化活性的不同影响。M2H实验可通过转染两种蛋白表达质粒（GAL4 DNA结合结构域[DBD]融合LBD和VP16转录激活结构域[VP16AD]融合LBD）以及一个含有GAL4应答元件（GAL4RE）的荧光素酶报告质粒，来检测哺乳动物细胞中LBD同源二聚化活性的效率。当GAL4DBD融合LBD与VP16AD融合LBD在细胞内形成二聚体时，该蛋白复合物会结合到GAL4RE上，并通过VP16AD依赖的转录活性启动荧光素酶基因的表达。在转染了小鼠ERα LBD融合蛋白表达质粒的HepG2细胞中，4OHT介导的荧光素酶激活水平高于转染人ERα LBD融合蛋白表达质粒的细胞。该结果表明，4OHT依赖的小鼠ERα LBD同源二聚化活性强于人ERα LBD。通常情况下，M2H实验并不适合用于评估核受体LBD的二聚化活性，因为激动性配体会增强LBD的基础活性，从而干扰对二聚化活性的检测。我们发现4OHT不会增强ERα LBD的基础活性，这是能够利用M2H实验成功检测4OHT依赖性LBD二聚化活性的关键因素。基于ERα LBD的M2H实验可应用于研究选择性雌激素受体调节剂（例如，4OHT）在多种哺乳动物细胞类型中的部分激动活性。

图3展示了组合(i)和组合(ii)质粒转染细胞中可能的反应示意图。实验结果如图4所示。组合(i)（pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT）在10 nM E2处理下显示出激活作用（图4A），因为ERα LBD包含配体依赖性转录激活功能域AF-2。激动剂（例如，E2）与ERα LBD结合后，会招募转录共激活因子至AF-2结构域。该事件可导致转录激活，而无需与VP16AD融合的LBD相互作用，从而因非特异性背景信号而难以评估LBD同源二聚化活性（图3C）。组合(ii)（pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF）在1 nM和10 nM E2处理下均检测到活性（图4</...

我们介绍了一种利用哺乳动物双杂交检测法分析4-羟基他莫昔芬依赖性雌激素受体α配体结合域二聚化活性的方法。

雌激素受体α（ERα）是一种依赖雌激素配体的转录调控因子。ERα蛋白序列在……之间高度保守。

因此，该方法有助于解答关于雌激素样配体调控雌激素受体α的能力以及选择性雌激素受体调节剂作用机制的关键问题。该技术的主要优势在于其操作简便，可在细胞内展示配体依赖性的雌激素受体α配体结合域二聚化活性。本实验操作将由本课题组的博士后学生 Tanner Jefferson 演示。该方法利用三种不同的质粒在细胞内检测雌激素受体配体结合域的二聚化活性。pG5-Luc 是用于检测二聚化活性效能的荧光素酶报告质粒。pBIND 小鼠雌激素受体α EF 是一种半乳糖响应型转录因子 GAL4 DNA 结合域，与小鼠雌激素受体α 配体结合域融合表达的质粒，可结合至 pG5-Luc 报告质粒上的 GAL4 响应元件。pACT 小鼠雌激素受体α EF 是一种单纯疱疹病毒转录激活蛋白 VP16 激活域与小鼠雌激素受体α 配体结合域融合表达的质粒，不能直接结合 pG5-Luc 报告质粒。当存在适当的配体时，由 pBIND 小鼠雌激素受体α EF 和 pACT 小鼠雌激素受体α EF 质粒表达的蛋白质可通过雌激素受体α 配体结合域相互结合。二聚化的效率由荧光素酶活性决定。最关键的步骤是控制pBIND小鼠雌激素受体α EF衍生蛋白的活性。在分析配体依赖性雌激素受体配体结合域二聚化活性之前，必须评估在不含pACT雌激素受体α EF质粒的情况下，每种配体中pBIND衍生的雌激素受体α配体结合结构域的活性。每种质粒组合取两个1.5毫升微量离心管，分别加入相应的质粒组合。准备两种DNA混合物组合。第一管包含pG5-Luc、pBIND-雌激素受体α EF和空载体pACT质粒。第二个管中含有 pG5-Luc、pBIND-雌激素受体α EF 和 pACT-雌激素受体α EF 质粒。为沉淀 DNA，向每管 DNA 混合物中加入 DNA 混合物体积的 1/9 的 3 M 醋酸钠以及 20 倍体积的 100% 乙醇，然后涡旋振荡各管。将混合物于 20 摄氏度下孵育过夜，次日早晨以最高速度离心。弃去上清液，每管中用120微升75%乙醇重悬不可见的沉淀，注意冲洗管壁内侧粘附的DNA。在相同条件下再次离心后，弃去上清液，并将DNA在真空浓缩仪中干燥30分钟。进行转染时，用0.5毫升室温PBS每洗一次，共洗涤两次已准备好的人肝细胞癌细胞，然后每孔加入0.5毫升新鲜的37摄氏度、不含酚红的MEM培养基，培养基中添加10%去炭处理的热灭活胎牛血清和2毫摩尔L-谷氨酰胺。接下来，根据孔数，在多个1.5毫升微量离心管中，用适当体积的DMEM悬浮干燥的质粒DNA混合物和转染试剂。向每管含有DMEM悬浮质粒DNA的混合物中加入等体积的转染试剂培养基。室温孵育5至10分钟后，取25微升DNA混合物加入至24孔人肝细胞癌细胞培养板的相应实验孔中，在细胞培养箱中进行6小时的转染。孵育结束后，将转染培养基更换为每孔 0.5 毫升新鲜的 37 °C 酚红-free MEM，该培养基添加有 10% 去炭处理并经热灭活的 FBS、2 毫摩尔 L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素，并按每孔加入配体，然后将细胞放回细胞培养箱中继续孵育 16 至 18 小时。次日早晨，用每孔 1 毫升 PBS 洗涤细胞，并用每孔 100 微升被动裂解缓冲液将各孔细胞刮下，随后使用涡旋振荡器剧烈震荡混匀。然后将细胞裂解液在液氮中速冻。在进行双荧光素酶检测当天，将裂解液置于摇床上振荡，直至培养板达到室温，然后将10微升裂解液转移至96孔白色塑料板的各个孔中。随后使用酶标仪检测每份细胞裂解液样品的荧光素酶活性。用10纳摩尔雌二醇处理转染了pBIND小鼠雌激素受体α EF和pACT质粒的细胞，可刺激荧光素酶活性，因为雌激素受体α的配体结合结构域含有配体依赖性转录激活功能域AF-2。然而，1 和 10 纳摩尔浓度的处理可诱导转染了 pBIND 与 pACT 小鼠雌激素受体 α EF 质粒组合的细胞中荧光素酶活性，表明该方法可用于评估在高达 1 纳摩尔雌二醇处理条件下雌激素受体 α 配体结合域的二聚化活性。使用 4-羟基他莫昔芬处理时，在转染了 pBIND 小鼠雌激素受体 α EF 和 pACT 质粒的细胞中未引发荧光素酶活性，表明该配体不能激活雌激素受体 α 的 AF-2 功能。然而，高达 10 纳摩尔浓度的 4-羟基他莫昔芬可诱导转染了 pBIND 与 pACT 小鼠雌激素受体 α EF 质粒组合的细胞中荧光素酶活性，提示该方法适用于评估在高达 10 纳摩尔 4-羟基他莫昔芬处理条件下雌激素受体 α 配体结合域的二聚化活性。pBIND 与 pACT 小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域表达质粒联用 4-羟基他莫昔芬时的活性显著高于 pBIND 与 pACT 人源雌激素受体 α 配体结合结构域表达质粒的组合。这表明，小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域的 4-羟基他莫昔芬依赖性同源二聚化活性强于人源雌激素受体 α 配体结合结构域。此外，含有 人源 F 结构域的小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域的 4-羟基他莫昔芬依赖性同源二聚化活性显著低于野生型小鼠雌激素受体 α 配体结合结构域。相比之下，含有小鼠F结构域的人雌激素受体α配体结合结构域的4-羟基他莫昔芬依赖性同源二聚化活性显著高于野生型人雌激素受体α配体结合结构域。这表明F结构域对物种特异性的4-羟基他莫昔芬依赖性雌激素受体α配体结合结构域同源二聚化活性具有影响。在进行该实验操作时，重要的是要记得检测GAL4 DNA结合结构域与雌激素受体α配体结合结构域融合蛋白在所用配体条件下的基础活性。该活性应与载体处理相同。

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