利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α的配联域二维化活性

因此，此方法可以帮助回答有关雌激素配体调节雌激素受体α的能力和选择性雌激素受体调节剂机制的关键问题。这种技术的主要优点是，它是一个简单的方法。它演示了与配体相关的雌激素受体α配体结合域在细胞中的二化活性。

演示这个程序的将是坦纳杰斐逊，一个博士后学生从我们小组。此方法使用三种不同的质粒来检测雌激素受体配体结合域在细胞中的二化活性。pG5-Luc 是用于检测二化活性功效的荧光酶报告质粒。

pBIND小鼠雌激素受体α EF是一种半乳糖反应转录因子GAL4 DNA结合到一个主要熔融小鼠雌激素α配体结合域表达质粒，与GAL4响应元素结合在pG5-Luc记者。pACT小鼠雌激素受体α EF是一种单纯疱疹病毒转活段蛋白VP16激活域融合小鼠雌激素受体α配体结合域表达质粒，不直接绑定到pG5-Luc记者。当适当的配体存在时，从pBIND小鼠雌激素受体α EF和pACT小鼠雌激素受体α EF质粒中提取的蛋白质通过雌激素受体α配体结合域。

二化效率由荧光素酶活性决定。最重要的步骤是控制pBIND小鼠雌激素受体α EF衍生蛋白的活性。在分析配体依赖雌激素受体配体结合域活性之前，必须评估没有 pACT 雌激素受体 Alpha EF 质粒的每个配体中 pBIND 衍生雌激素受体 alpha 配体结合域的活性。

首先将适当的质粒组合添加到两个 1.5 毫升的微离心管中。准备DNA混合物的两种组合。第一管包含pG5-Luc、pBIND-雌激素受体-阿尔法EF和空pACT质粒。

第二管包含pG5-Luc、pBIND-雌激素受体-阿尔法EF和pACT-雌激素受体-αEF质粒。为了沉淀DNA，将三摩尔醋酸钠的DNA混合物体积和20X三摩尔醋酸钠的体积添加到每个管中的DNA混合物中，并涡旋管。将混合物储存在20摄氏度过夜，然后在第二天早上以最大速度离心。

丢弃超自然剂，将每管75%乙醇的120微升中隐形颗粒重新暂停，注意冲洗任何粘在管内内的DNA。在相同条件下进行第二次离心后，丢弃中继物，在真空浓缩器中干燥DNA30分钟。对于转染，每次洗净时，用0.5毫升室温PBS洗涤两次，用0.5毫升新鲜37摄氏度的酚类红M为细胞喂气，辅以10%炭脱热活化胎儿牛血清和两毫摩尔L-谷氨酰胺。

接下来，在单个1.5毫升微离群管中，将干质粒DNA混合物和转染试剂悬浮在适当体积的DMEM中。在每个DMEM悬浮质粒DNA混合物管中加入同等体积的转染试剂介质。在室温下孵育5至10分钟后，在24孔人类肝细胞细胞培养板的适当实验井中加入25微升DNA混合物，在细胞培养箱中进行6小时的转染。

孵育结束时，用0.5毫升的新鲜37摄氏度无酚类红M代替转染培养基，辅以10%木炭脱热灭活 FBS、2毫摩尔L-谷氨酰胺、1%青霉素链霉素和每井配体，将细胞再返回细胞培养箱16至18小时。第二天早上，用每井一毫升PBS清洗细胞，用每井100微升无源解液缓冲液连接细胞，用涡流搅拌机剧烈摇晃。然后在液氮中冷冻细胞。

在双荧光素酶测定的当天，摇动摇床上的落酸，直到板达到室温，并转移10微升的莱沙酸盐到96孔的白色塑料板的个别孔。然后阅读微孔板读取器上每个细胞的荧光素酶活性。pBIND小鼠雌激素受体α EF和pACT质粒转染细胞与10纳米摩尔雌二醇刺激荧光素酶活性，因为雌激素受体α配体结合域包含配体依赖性转活功能域，AF-2。

然而，1和10纳米摩尔浓度，诱导白西拉酶活性在细胞中通过pBIND和pACT小鼠雌激素受体α EF质粒的组合转染，建议这一程序的可行性，评估雌激素受体α配体结合域二化活性在高达一纳米摩尔的雌二醇治疗。4-羟基-塔莫西芬的治疗不会引起pBIND小鼠雌激素受体αEF和pACT质粒转染细胞中的荧光素酶活性，这表明雌激素受体α的AF-2功能不是由这种配体激活的。然而，高达10纳米摩尔浓度，诱导白西拉酶活性的细胞转染与pBIND和pACT小鼠雌激素受体α EF质粒的组合，表明这个程序是可行的评估雌激素受体α配体结合域二化活性在高达10纳米摩尔4羟基-塔莫西芬治疗。

pBIND和pACT小鼠雌激素受体α配体结合域表达质粒与4-羟基-塔莫西芬的组合活性明显高于pBIND和pACT人类雌激素受体α配体结合域表达质粒的组合。这表明小鼠雌激素受体α配体结合域的4-羟基-塔莫西芬依赖性同化活性比人类雌激素受体α配体结合域更有效。此外，含有人类F域的小鼠雌激素受体α配体结合域的4-羟基-塔莫西芬依赖性同化活性明显低于野生型小鼠雌激素受体α配体结合域。

相比之下，含有小鼠F域的人类雌激素受体α配体结合域的4-羟基-塔莫西芬依赖性同化活性明显高于野生型人类雌激素受体α配体结合域。这表明F域对物种特异性4-羟基-塔莫西芬依赖雌激素受体α配体结合域同质化活性有影响。在尝试此过程时，重要的是要记住测试 GAL4 DNA 结合域的基础活性熔融雌激素受体 Alpha 配体结合域活性与您的配体。

该活动应与车辆处理相同。