小鼠边缘区B细胞剪切流诱导迁移的体外分析

该方法有助于理解免疫细胞迁移领域的关键问题，例如细胞骨架如何传递剪切力，以及整合素配体和趋化因子如何影响白细胞的流动诱导迁移。该技术的主要优势在于，它是一种新型的迁移检测方法，初学者易于操作。实验仅需使用市售的设备和试剂，以及免费软件。

尽管该方法可用于研究边缘区B细胞，但也适用于其他免疫细胞，例如活化的T细胞。实验前一天，将一份ICAM-1解冻，并用PBS稀释至终浓度为每毫升5微克。然后，向流式玻片的所需通道中加入30微升ICAM-1溶液。

将载玻片放入湿盒中，并置于4°C过夜孵育。次日，通过向湿盒的一个孔中加入100微升PBS，然后从另一孔中吸出100微升来清洗湿盒。随后，向湿盒中加入100微升封闭缓冲液，并将载玻片置于湿盒中于室温孵育90分钟。

接下来，通过向一个孔中加入 100 微升 PBS，从另一个孔中吸出，清洗小室，然后向小室中加入 100 微升迁移缓冲液。此时载玻片已准备就绪，将其置于室温下的湿盒中保存，直至进行实验。

首先，插入流体泵并连接流体单元。然后，打开泵的软件。接着，用 5 至 10 毫升迁移缓冲液冲洗管路一次。

这大约需要一分钟。然后，向两个储液槽中各加入 11.7 毫升迁移缓冲液，并去除气泡。现在，将管路在距离连接件约 10 厘米处夹紧，并将流体单元放入显微镜加热孵育室中。

在软件中，将载玻片类型设置为 micro-slide VI 0.4，管路选项设置为白色。同时，将所需的剪切应力设置为约 4 达因/平方厘米，成像时间设置为 30 分钟。然后，通过在泵控软件中输入数值来设定所需的流速和剪切应力。

接下来，将显微镜培养室、流体单元和迁移缓冲液分装样品预热至 37 摄氏度。待温度达到后，测试流体泵，确保迁移缓冲液在储液池中往复流动，并且系统内无气泡。首先，分离白细胞，并按照随附的文字实验方案所述，纯化出边缘区 B 细胞。

然后，用沾有乙醇的纸巾清洁载玻片底部。将30 µL细胞悬液加入小室的一个孔中，并从另一个孔中吸出30 µL保存的迁移缓冲液。盖上盖片，于37°C孵育30分钟，使细胞贴壁。

接下来，缓慢将预热的迁移缓冲液加入载玻片的每个孔中，直至形成凸起的弯月面。用移液枪头去除任何气泡。保持影响细胞黏附因素的一致性非常重要，因此需将缓冲液和细胞保持在37摄氏度，并在将缓冲液加入腔室时避免施加过大的力。

将载玻片夹紧在显微镜载物台上，然后将流体管路无标记的一端从连接件上取下。接着，用迁移缓冲液充满管路末端，直至末端形成一个无气泡的正弯月面。将管路末端翻转，插入流动室的上部小孔中。

在保持导管夹闭的同时，对导管的标记端重复上述操作。随后，将成像系统切换至实时模式，并选择位于载玻片中央的视野。在此处，先将焦点对准细胞，然后略微散焦，以增强细胞的黑色轮廓并形成明亮的内部区域。

黑色背景和白色中心在自动追踪程序中更易于使用。设置成像序列程序，使用10倍干镜每5秒拍摄一张图像，持续30分钟。然后开始记录。

取下管路上的夹子，然后启动泵。这将使非贴壁细胞被冲洗掉，同时贴壁细胞开始迁移。在成像程序结束时，为视频添加标签并保存。

如果使用细胞迁移抑制剂或调节剂，可将其添加至加样前细胞悬液中的细胞，或添加至流体单元的迁移缓冲液中。要开始自动迁移轨迹分析，请打开 ImageJ 程序。将 MTrack2_kt Java 文件复制到 ImageJ 的 Plugins 文件夹中。

在“插件”菜单下，选择“编译并运行”。然后重新启动 ImageJ，该插件应会出现在“插件”菜单中。在 ImageJ 中打开细胞迁移视频的图像序列，并按此处所示处理图像，以将视频从彩色帧转换为高对比度图像，使细胞以黑色物体的形式显示在白色背景上。

接下来，将图像锐化两次，去除图像中的杂点，然后将图像转换为8位。在“图像”菜单中，进入“调整亮度/对比度”子菜单，将对比度滑块调至最大对比度。这样可使细胞在黑色背景上呈现为白色物体。

然后，返回“调整阈值”子菜单，确保细胞以黑色物体的形式显示在白色背景上。现在，运行自动细胞追踪插件 MTrack2 kt。在选项界面中，将粒子大小的最小值设置为 1 像素，最大值设置为 30 像素。

将速度值设为10像素，尽管边缘区B细胞在相隔五秒的连续帧中通常不会超过2像素。细胞轨迹现已可使用ibidi趋化分析工具进行分析。这两个视野显示了接种在ICAM-1包被载玻片上的边缘区B细胞的迁移路径。

使用本文所述方法，通过 MTrack2 对细胞进行自动追踪。左侧为静态条件下成像的细胞，右侧为暴露于每平方厘米四达因剪切流中的细胞。每个细胞的运动轨迹可导入 ibidi 细胞趋化分析工具，以生成每段视频的轨迹图。

此处，单个细胞轨迹以红色表示，表明其终点位于起点的下游，或以黑色表示终点位于起点的上游。图中展示了在有流动和无流动条件下，来自四个独立视频的细胞轨迹分析结果，包括两种条件下的平均定向迁移指数、细胞速度、路径直线度以及最终的直线距离。

观看本视频后，您应能充分理解如何对边缘区B细胞在剪切流作用下的定向迁移进行成像，以及如何实现细胞的自动追踪。在该实验过程中，还可结合其他方法（如全内反射荧光显微镜技术）来进一步探究其他科学问题，例如细胞骨架和整合素如何响应剪切应力？