用于扫描电子显微镜（SEM）形态学分析的原核与真核生物化学干燥制备

本方案重点介绍两种化学干燥方法——六甲基二硅氮烷和叔丁醇，并阐述其在利用扫描电镜观察原核生物和真核生物中的应用。该技术的主要优势在于无需使用临界点干燥仪等专用干燥设备即可完成样品的分析前处理。本方案描述了三种生物样品的化学脱水及扫描电镜分析方法，但该方法可广泛适用于多种生物体和组织类型的观察。

演示该实验步骤的是来自我实验室的本科生 Madison Koon。首先，对蓝细菌进行过夜固定处理。然后，将其转移至含有聚碳酸酯 25 mL 滤膜的 10 mL 过滤装置中。

用橡胶塞将过滤装置的侧臂和漏斗密封，以使培养物保留在漏斗中。取下两个橡胶塞后，通过在过滤瓶上施加轻柔的真空作用去除固定剂。为制备单细胞藻类裸藻，将培养物预先转移至10 mL过滤装置中，然后直接加入3滴4%的四氧化锇进行固定。

孵育30分钟后，取下两个塞子，通过抽滤瓶轻轻抽真空以除去固定剂。将固定的裸藻类用5 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.0）在室温下洗涤三次，每次10分钟，洗涤过程中保持烧瓶和漏斗用塞子封闭以保留洗涤液。取下两个塞子后，通过抽滤瓶轻轻抽真空除去每次的洗涤液。

为了在保持持续浸润的同时对样品进行脱水，使用5 mL体积的梯度乙醇系列在漏斗中处理十分钟，同时用塞子封闭烧瓶和漏斗，以确保乙醇保留在漏斗内。轻轻移除两个塞子后，对过滤烧瓶进行抽真空以除去乙醇。将样品转移至一次性铝制称量皿中，加入足量的100%乙醇以完全覆盖样品。

为了使用TBA对眼虫类进行化学干燥，首先将铝皿中的100%乙醇溶液替换为体积比1:1的TBA与100%乙醇混合溶液，处理20分钟。随后，将1:1混合溶液替换为100%TBA溶液，处理20分钟，并重复此步骤两次。移除TBA溶液后，加入足量的新鲜100%TBA溶液以完全覆盖样品。

将培养皿置于 4 摄氏度环境中 10 分钟，使 TBA 冻结。将样品转移至装有冷冻凝胶包的真空干燥器中，以保持 TBA 处于冻结状态。使用旋转泵抽真空并维持真空环境，使冻结的 TBA 通过真空升华作用干燥至少 3 小时。

为了在眼虫中固定蓝细菌，首先在直径25 mm的铝制载台底部做标记，以标明其上所放置的样品。然后将滤膜置于固定在载台顶部的碳导电胶带上。为了制备黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），将麻醉后的果蝇浸入1 mL固定液中，在4°C条件下固定2小时，确保果蝇完全浸没于溶液中。

使用玻璃移液管吸除固定液。将固定的黑腹果蝇样品置于1.5 mL微量离心管中，用1 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.2）在室温下洗涤三次，每次10分钟。每次洗涤后使用玻璃移液管小心吸除缓冲液，注意勿吸出样品。

然后，将样品置于微量离心管中，依次使用1 mL梯度乙醇系列溶液进行脱水，每种浓度乙醇处理10分钟。每次更换溶液时，使用玻璃移液器小心吸去上清液，注意避免吸出样品。最后将样品保留在1.5 mL微量离心管中，加入足量的100%乙醇以完全覆盖样品即可。

为了使用六甲基二硅胺（HMDS）对果蝇进行化学干燥，首先将100%乙醇溶液替换为体积比1:2的HMDS与100%乙醇混合溶液，处理20分钟。然后将溶液替换为体积比2:1的HMDS与100%乙醇混合溶液，继续处理20分钟。最后，将溶液替换为100% HMDS处理20分钟，并重复此步骤一次。

将装有样品的1.5 mL微量离心管和HMDS转移至一次性铝制称量皿中。用足量的新鲜100% HMDS替换原有的100% HMDS，以完全覆盖样品。将铝制称量皿中的样品直接置于化学通风橱内，用盒盖等松散盖子覆盖，防止灰尘落入样品，静置干燥12至24小时。

为了固定果蝇，需在铝制样品台的底部进行标记。在解剖显微镜下，使用精密镊子将干燥的果蝇放置于样品台顶部已固定的碳导电胶带上，并调整至所需位置。随后，在样品台外缘周围涂抹银导电胶。

使用牙签将银漆与果蝇连接，确保导电性，同时注意银漆不要接触到所需的成像区域。将载样台放入载样台盒中，然后将打开的载游戏副本放入干燥器中，让银漆干燥至少三小时。为准备溅射镀膜仪，用氩气进行4到5次冲洗。

根据待镀膜的样品，按照文中的描述将计时器设置为不同的参数。按照制造商的说明对载 stub 进行溅射镀膜。最后，使用配备有二次电子探测器的扫描电子显微镜对样品进行成像，具体参数设置需根据所用样品而定。

采用本方案成功制备用于扫描电镜观察的蓝细菌样品后，所获得的图像可清晰显示细胞的形态及表面纹理等细节，同时可见细胞周围的黏液鞘以及细胞表面的突起结构。来自科罗拉多州的一种丝状淡水蓝细菌的扫描电镜图像显示了明显的黏液鞘。来自俄亥俄州的一种淡水蓝细菌的扫描电镜图像则揭示了单个细胞，这些细胞有时会通过一层薄薄的黏液连接形成菌落。

丝状突起从单个细胞延伸而出。来自得克萨斯州沿海高盐度河口的未知丝状物种图像显示了单个细胞及正在分裂的细胞。采用扫描电镜（SEM）观察两种不同眼虫属物种的表膜条纹结构。

在比较单形目（Monomorphina）和疑难目（Aenigmatica）与拟梨形单形虫（Monomorphina pseudo pyrum）时，可见其表膜条带在后端螺旋排列并延伸形成尾部结构，这一特征有助于系统发育至分类终点的判定。正常果蝇眼睛的扫描电镜图像显示刚毛和晶状体呈有序排列，但与阿尔茨海默病相关的蛋白表达会导致粗糙眼表型。能够抑制或增强粗糙眼表型的基因可能在疾病进展过程中发挥生理作用。

以下是一些需要避免的潜在问题示例，包括因干燥技术不当导致的眼部结构塌陷，以及溅射镀膜不足引起的电子束充电现象，后者会在图像采集过程中显现。本文所述方案所涉及的生物体在复杂程度上差异显著，但均适用于扫描电镜分析，以获取对生物学多个分支学科的科学发现至关重要的形态学信息。请务必注意，叔丁醇、六甲基二硅氮烷和四氧化锇的使用可能存在危险，必须始终遵守适当的安全措施，以保护使用者，尤其是将接触这些化学品的学生。