利用荧光显微镜通过竞争性滴定法高灵敏度测定转录因子-DNA结合亲和力

为了加深对转录因子与DNA结合的理解，我们开发了一种大规模测定解离常数的方法，例如使用各向异性测量技术。该方法能够自动获得完整的滴定曲线，以高灵敏度确定解离常数。该技术在溶液中平衡状态下进行，具有中等通量和宽广的动态范围。

我们应用HiP-FA来精细描绘转录因子的结合亲和力图谱。然而，该方案也可用于其他类型的结合事件，例如蛋白质-蛋白质或蛋白质-药物相互作用。我建议首先使用相同的结合配对进行多次滴定实验，以评估测量结果的可重复性。

如有条件，可使用自动化系统以获得更佳的可重复性。将每种十毫摩尔的双标记正向链和未标记反向链各七微升混合于一个离心管中，以退火参考DNA的寡核苷酸。对于竞争DNA，将每种100毫摩尔的未标记链各20微升分别加入96孔PCR板的两个孔中。

然后，使用标准PCR仪将DNA溶液加热至70摄氏度，持续3分钟。接着以每秒0.1摄氏度的速率降至室温。使用微波炉将0.5克琼脂糖溶于100毫升结合缓冲液中。

加入重蒸水以调整最终体积，以补偿可能的蒸发损失。制备10毫升的储备分装液。为准备96孔板的滴定和校准孔，将两份凝胶储备分装液转移至75摄氏度的恒温振荡培养箱中。

对于每个滴定孔，加入1.4 纳摩尔的参照DNA、终浓度为20–60 纳摩尔的转录因子蛋白、0.2 毫摩尔的DTT，并加入结合缓冲液，使融化的凝胶总体积达到240 微升。通过倒置并轻轻振荡试管充分混匀。然后，将含有DNA的凝胶缓慢地每孔200 微升加入至96孔板中指定的滴定孔内。

对于每个校准孔，向 240 微升熔化的凝胶中加入 5 纳摩尔尼罗蓝染料。避免产生气泡，将含染料的凝胶溶液缓慢吸取 200 微升，加入 96 孔板中的五到六个孔内。将凝胶置于完全水平的表面上，在室温下孵育 10 分钟，再于 4 摄氏度孵育 10 分钟。

使用多孔板读数仪检测平板中不同孔内凝胶高度水平的均一性。为制备竞争性DNA溶液，首先将标记的参照DNA、蛋白质和三倍浓度结合缓冲液混合。然后，取20微升该溶液与40微升每种退火后的竞争性DNA溶液混合。

对于每个校准孔，将适当体积的其中一种退火的竞争性DNA溶液与含有15毫摩尔尼罗蓝染料溶液的三倍浓度结合缓冲液混合。最后，尽可能同时将50微升混合后的竞争性溶液加至凝胶表面。开始图像采集时，将96孔板放置在显微镜载物台上。

然后，对各孔进行Z轴层扫成像的时间序列采集，直至蛋白质完全从参照DNA上解离。按照论文所述方法进行滴定实验。随后使用HiP-FA软件为各个竞争序列生成滴定曲线。

然后，点击导出按钮以获得每次滴定孔中的解离常数和活性蛋白浓度。吸取黏稠的凝胶溶液时需特别小心。移液不准确会降低解离常数测定的准确性。

本研究中，采用HiP-FA方法确定果蝇体节形成基因网络中的B-zip转录因子Giant的DNA结合偏好性。通过手动或自动化技术制备的重复样本，其PWM结果具有高度相似性，表明HiP-FA方法具有高度的可重复性。

通过该方法及其他方法获得的PWM总体相似。然而，在核心基序的第二位和第七位上可以观察到显著差异，这些位置的突变可能导致完全丧失结合能力，或比先前测量结果强得多的结合能力。我们使用HiP-FA对数十种转录因子的结合情况进行优化，结果表明，最终获得了对数据更准确的预测。

我们认为，其高精度的测量对于更好地理解所有系统或各类相互作用中的转录因子- DNA 结合具有重要意义。