Name: 荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学习使用HiP-FA荧光各向异性方法测定转录因子与DNA的结合亲和力。该技术可在溶液平衡状态下实现高通量、高灵敏度的解离常数测量，适用于基因调控研究中的大规模结合事件分析。

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感谢 J. Müller 提供 cDNA 克隆，以及 Gaul 实验室的成员，特别是 S. Bergelt，给予的宝贵建议和富有启发性的讨论。本工作得到了 SFB 646“基因组表达与维持中的调控网络”（C.J.，P.B.）、整合蛋白质科学中心（U.G.）以及慕尼黑定量生物科学研究生院（M.S.）的资助。U.G. 还感谢德国研究基金会（SFB 646、SFB 1064、CIPSM、QBM）、德国联邦教育与研究部（BMBF：ebio - 系统生物学创新竞赛）以及洪堡基金会（Alexander von Humboldt 教授职位）的支持。

1. 偏振显微镜
<ol>
	<li>对于宽场激光照明，将连续波二极管激光器（40 mW）的638 nm谱线聚焦到多模光纤的孔径上以进行光束净化。在光纤输出端安装一个线性偏振器，以设定激光的偏振方向。</li>
	<li>使用二向色镜（640 nm截止）和带通滤光片（带通700/75）阻挡发射光中的激发成分。</li>
	<li>让荧光信号通过一个偏振分光棱镜，该棱镜将发射光分为相互垂直的偏振分量和平行偏振分量。然后，使用焦距为200 mm的消色差透镜，将非反射光束（平行分量）和反射光束（垂直分量）聚焦到背照式EM-CCD相机的芯片上（图1b 和 1c）。使用反射镜调节垂直分量光束的方向，使其对准透镜。</li>
</ol>
2. 荧光标记参考DNA寡核苷酸的设计与测试
<ol>
	<li>确定参考DNA的核心序列：该方法基于一种竞争性检测，用于测定解离常数（KD2) 在转录因子与未标记的竞争性DNA寡核苷酸之间进行，后者与荧光标记的DNA竞争结合位点，而荧光标记DNA与转录因子的结合亲和力作为参考（KD1）。来自其他来源（如DNase足迹分析或细菌单杂交）获得的共识序列可作为起点5,15. 
	注意：作为经验法则，合适的参考 DNA 与共识序列相比，其对转录因子（TF）的结合亲和力应降低 3 至 7 倍。</li>
	<li>通过 HiP-FA 测定 KD12-3 个基于上一步所得共识序列的初步单点突变。尽量选择共识序列中特异性不太强的位置进行突变，以避免完全丧失结合能力。 
	注意：参考序列必须能被目标转录因子结合（本实验方案中使用 Giant Gt），但结合不能过强，以便在高浓度时较弱的竞争序列能够将其取代。</li>
	<li>将核心基序（通常为8-12个碱基对）通过在两侧对称添加侧翼序列的方式延伸至16个碱基对或更长（添加侧链以实现正确结合）。如有必要（例如针对较长的结合区域），可使用更长的序列（在HiP-FA检测中已测试过长度达约50个碱基对的序列）。 
	注意：务必避免添加可能产生异位结合位点的碱基。可使用基于现有 PWM 预测结合位点的计算工具来辅助此过程（例如， PySite22).</li>
	<li>作为标记的参考DNA，订购在正向或反向链的3'端或5'端进行荧光标记的寡核苷酸。例如使用Cy5、Bodipy-650或任何其他合适的染料，浓度为 10 µM (100 µM 10倍浓度储存液）溶于水，并按步骤3.1所述逐步稀释。</li>
	<li>通过将33 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.0）、90 mM NaCl和0.01%非离子型去污剂溶于蒸馏水中，配制500 mL的1×结合缓冲液。同时配制3×结合缓冲液，其成分与1×结合缓冲液相同，但浓度为三倍。若将3×结合缓冲液用作1×结合缓冲液的储备液，请按需配制相应体积 &gt; 500 mL；否则，配制250 mL。 
	注意：该成分体系已优化，以维持转录因子的稳定性，并防止谷胱甘肽S-转移酶（GST）发生二聚化。</li>
	<li>使用步骤1中所述的显微镜装置测量FA 200 µL 在存在不同浓度转录因子（TF）的情况下，将含有0.8 nM标记参考DNA的结合缓冲液加入玻璃底共聚焦显微镜96孔板中（每种TF浓度设置5–6个复孔），以确定实验所用的TF浓度。通过逐步增加TF浓度进行滴定实验，选择结合曲线达到平台期时的TF浓度，该平台期表明参考DNA寡核苷酸已完全结合。 
	注意：转录因子（TF）的最佳浓度取决于 TF-DNA 解离常数的数值。通常情况下，解离常数 K 越低Ds 所需浓度较低。</li>
</ol>
3. 寡核苷酸退火
<ol>
	<li>为了退火标记参考DNA的DNA寡核苷酸（序列由前一步确定），将7 µL的10 mM染料标记的单链正向DNA溶液与7 µL的10 mM未标记反向互补单链DNA溶液在186 µL水中混合。</li>
	<li>对于竞争DNA序列，将每种待测竞争序列的20 µL 100 mM正向单链DNA溶液（由生产商提供，溶于水）与20 µL 100 mM对应的反向单链DNA溶液混合。</li>
	<li>在标准PCR仪中分别进行退火：将溶液加热至70 °C保持3分钟，然后以0.1 K/s的速率降温至室温。如果所用PCR仪不支持该降温速率，可采用分步梯度降温（已验证方案为99个循环，每循环3秒，每次降低0.4 K）。</li>
</ol>
4. 凝胶制备
注意：以下部分介绍两种不同类型凝胶的制备方法：1）滴定孔中包含含有蛋白质的凝胶，用于测定相应竞争性DNA序列的KD值；2）校准孔利用NB来确定在每个指定时间点和采集高度下的DNA浓度。重点介绍在96孔板中进行实验的制备过程，同时也提供了适用于384孔板格式的相应体积。
<ol>
	<li>将0.5% w/v低熔点琼脂糖溶于结合缓冲液中，在实验室微波炉中加热至完全溶解。完全溶解后，用ddH2O重新调整体积，以补偿可能发生的蒸发损失。 
	注意：为方便起见，可预先配制10–20份10 mL的凝胶储备液，使用时在75°C下融化即可。凝胶储备液可在室温下保存。 
	注意：微波炉加热时需小心避免凝胶溶液过热。建议采用短时间多次加热，并在加热间期进行振荡。</li>
	<li>为制备滴定孔和校准孔，首先在75°C下振荡融化两份10 mL的凝胶储备液。
	<ol>
		<li>每种竞争子（n = 竞争子序列数量）使用240 µL（含20%余量）。</li>
		<li>非结合（NB）校准孔使用相同体积的凝胶，以确保两种凝胶具有相同的温度和黏度。</li>
		<li>随后将温度调至35°C，并等待温度平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于滴定孔，加入1.4 nM（终浓度）杂交参考DNA（来自步骤3）、转录因子蛋白（终浓度CTF = 20–60 nM，由步骤2.6确定）、DTT（0.2 mM）以及结合缓冲液，总体积分别为n × 200 µL（96孔板）或n × 13 µL（384孔板）（另加余量）。通过倒置或振荡充分混匀（切勿涡旋）。</li>
	<li>在96孔板格式中，每孔缓慢加入200 µL（384孔板为每孔13 µL）上一步制备的凝胶溶液至滴定孔中。</li>
	<li>对于校准孔，首先在孔外将5 nM NB加入已融化的凝胶中（总体积取决于所用孔板格式及校准孔数量；通常每个孔板5–6个校准孔即可）。</li>
	<li>将含有NB的凝胶缓慢移取200 µL（384孔板为13 µL）至孔板的校准孔中，注意避免产生气泡。 
	注意：使用电子移液器或自动化机器人可显著提高实验重复性。</li>
	<li>在室温下静置10分钟使凝胶固化，再于4°C继续固化10分钟（如有必要，之后去除玻璃表面的冷凝水）。所有步骤均需在完全水平的表面上进行，以避免凝胶表面不均。 
	注意：含蛋白的凝胶在4°C下通常至少可稳定数小时。</li>
</ol>
5. 加入竞争性 DNA 溶液
注意：以下溶液应在开始滴定前配制，并在同时加入校准孔和滴定孔中。
<ol>
	<li>将退火标记的参照DNA和蛋白质加入3倍浓度的结合缓冲液中，其浓度为凝胶储存液分装 aliquot 的3倍。
	<ol>
		<li>混合 20 µL 所获溶液的 40 µL 步骤3中获得的每种退火竞争DNA溶液的等份</li>
		<li>对于每个校准孔，混合 20 µL 含15 mM NB溶液的3倍结合缓冲液 40 µL 退火的竞争性DNA（任何相同长度的序列均适用）。 
		注意：对于384孔板，使用 21 µL 而不是 60 µL 总共。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选地，使用多孔板读数仪在380 nm处测定吸光度，通过光谱法检测各孔中凝胶高度水平的均一性（吸光度值与凝胶高度成正比）。</li>
	<li>添加 50 µL (7 µL 将混合的竞争性DNA溶液（在步骤3中退火）以384孔板格式加样至凝胶表面。若条件允许，尽量使用电子多通道移液器或96通道移液头同时加入所有竞争性溶液。加入竞争性溶液后，立即将板置于显微镜载物台上并立即开始测量（步骤7）。</li>
</ol>
6. 图像采集
<ol>
	<li>依次获取时间序列 z-层（stacks）例如， 使用12个层面和100-300毫秒的照明时间）。避免在过于接近孔板表面的位置采集图像（&lt; ~1.4 µm 使用本实验所用的平板以排除任何偏振偏差。</li>
	<li>进行10至25轮测量循环，直至标记的参照DNA完全从转录因子（TF）上解离。终点通常在1至2小时内达到，具体取决于竞争性DNA的结合动力学及其扩散能力。</li>
</ol>
7. 从原始数据中提取 FA(z,t)
<ol>
	<li>一旦完成对孔板的成像，即从原始荧光图像中计算平行组（I）感兴趣区域的平均像素值=）以及垂直方向（I+) 偏振强度分量（图1c）。这可以通过使用 HiP-FA 软件自动完成23. 
	注意：HiP-FA 软件、使用手册及测试数据集可下载23. 或者，使用任何其他自定义编写的软件来提取 I= 我+ 并按照下文详述的方法对滴定曲线进行后续分析。</li>
	<li>计算每个孔的FA值。对于每个孔，脚本会进行如下计算 FA(z,t) 在每个 z 位置和时间点 t 根据： 
	公式 1：   <img alt="荧光各向异性方程，用于光谱数据分析的FA(z,t)函数。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	其中 G 为仪器的 G 因子，用于校正对垂直通道的任何偏向性。</li>
	<li>通过测量含有已知各向异性的荧光染料溶液的荧光各向异性（FA），确定显微镜系统的G因子。提取信号的两个偏振分量，然后使用公式1计算得到 G, 了解该溶液的脂肪酸组成（FA）G = 1.15 在此设置中）。</li>
</ol>
8. 根据FANB测定竞争DNA浓度的校准曲线
<ol>
	<li>将每种正向和反向参考寡核苷酸各120 µL（100 mM 储存浓度；可使用与竞争序列长度相同的任意随机序列）进行退火，并与含有NB（15 nM）的120 µL 3x结合缓冲液混合。</li>
	<li>在1x结合缓冲液中进行1:2系列稀释，共6个稀释梯度。将50 µL上述各稀释液与200 µL含有5 nM NB的0.5%低熔点琼脂糖（T &gt; 35 °C）凝胶在1x结合缓冲液中混合，每组设三个重复。</li>
	<li>将上一步制备的6种溶液各取200 µL加入96孔板中，于4 °C孵育1小时以确保完全凝胶化，随后在室温下放置1小时。使用HiP-FA装置测量各溶液的FANB。</li>
	<li>根据上一步提取FANB (z,t)数据，并采用Hill方程拟合数据： 
	方程2：   <img alt="DNA浓度的平衡方程；以FA(z,t)表示，用于结合分析的参数。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程2"> 
	其中CDNA为DNA寡核苷酸的浓度；k为半数结合位点被占据时的DNA寡核苷酸浓度；FAmax为归一化常数；n为Hill系数。k、FAmax和n在拟合过程中设为自由参数。</li>
	<li>将拟合过程获得的三个参数输入HiP-FA软件（位于左下方面板）。</li>
	<li>每隔几个月或在显微镜系统发生更改后，重复校准曲线的测定。</li>
</ol>
9. 竞争性DNA浓度的测定
<ol>
	<li>使用 HiP-FA 软件从 FANB(z,t) 测量结果中提取 c(z,t)（见图3）。首先按照前文所述方法获得校准曲线，并将拟合参数输入软件（详见操作手册）。</li>
	<li>使用该程序根据公式3（见图3b）自动外推 c &lt; 100 nM 时的 c(z,t)（详见操作手册），该公式描述了竞争性DNA在琼脂糖凝胶基质中的一维扩散过程，假设其为自由扩散。 
	公式3：   <img alt="热扩散方程：\( c(z,t) = C_0 \left( 1 + \text{erf}\left(\frac{-z}{\sqrt{4D(t+t_0)}} \right) \right) \)" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3"> 
	其中，C0 为竞争性DNA的初始浓度；erf 为误差函数；z 为位置；D 为竞争性DNA的扩散系数；t0 为测量起始时间。拟合所用的自由参数为 C0 和 z/<img alt="带变量 D 的平方根符号；用于教学的数学公式表示。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 4">。</li>
</ol>
10. 利用HIP-FA进行极强DNA结合的常规竞争滴定
<ol>
	<li>在96孔板（或384孔板）的各排中，将不同竞争性DNA寡核苷酸依次稀释为以下浓度：0、1.25、3.5、9、19、45、90、190、425、900、1900和4000 nM。在每孔中加入Cy5标记的参考DNA（1 nM）和转录因子（20–50 nM），保持浓度恒定，总体积为200 µL，溶于结合缓冲液中（图5a）。孵育40分钟，待达到热力学平衡后，使用HiP-FA装置采集每孔的z轴层扫图像（每孔采集多幅图像，通过平均计算得到的荧光各向异性值以降低变异性）。</li>
	<li>构建平衡结合滴定曲线，并用公式4进行拟合（图5b）。通过传统竞争滴定法测定的KD值与使用琼脂糖凝胶基质的HIP-FA方法所得结果一致20。</li>
</ol>
11. 脂肪酸滴定曲线的拟合步骤
<ol>
	<li>在 HiP-FA 软件中显示各个竞争序列的重建滴定曲线 FA(z,t) = f[c(z,t)]，并目视检查数据质量（详见使用手册）。如有需要，优化步骤 10 中用于确定竞争 DNA 浓度的参数。</li>
	<li>使用公式 4 对每条单独的滴定曲线进行自动拟合，该公式为竞争性滴定实验提供了分析解24。 
	公式 4：   <img alt="静态平衡方程，FA=A×(2√(d²−3e)cos(θ/3)−d)/(3Kd₁+2√(d²−3e)cos(θ/3)−d)+B。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"> 
	其中：    <img alt="距离计算公式，包含变量 K、L、R 的科学分析公式。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 6"> 
	<img alt="化学方程，平衡公式，e=(LT-RT)KD1+(LST-RT)KD2+K'D1K'D2，物理概念。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 7"> 
	<img alt="静态平衡公式图示：f = -KD1 KD2 RT，力分析方程。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 8"> 
	<img alt="Theta 方程，arccos 公式，三角计算，数学表达式。" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 9"> 
	其中 RT 为蛋白质浓度；LT 为未标记 DNA 浓度，LST 为标记 DNA 浓度；KD2 为待测定的解离常数；RT 为活性蛋白质浓度；A 和 B 为归一化参数。 
	 
	首先确定 KD1，其作为测定不同 KD2 值的参考。可通过将染料参考 DNA 序列选为未标记竞争 DNA 序列，在实验中直接测定 KD1（见使用手册）。</li>
	<li>在软件中输入测得的 KD1 值，并计算板上所有竞争 DNA 的 KD2 值。 
	注意：拟合过程中的自由参数为 KD2、RT、A 和 B。</li>
	<li>在软件中点击“导出”按钮，导出该板上所有单独滴定孔的解离常数 KD2 和活性蛋白质浓度 RT。</li>
</ol>
12. PWM 构建、蛋白质- DNA 相互作用的特异性及伪计数
使用在线工具 WebLogo 3.0（http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）按照先前所述方法20为不同的 PWM 生成序列标志图。

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作者声明无利益冲突。

HiP-FA 是一种全新的综合性方法，用于确定转录因子- DNA 相互作用的结合偏好图谱。该方法直接测量突变 DNA 模体变体的结合亲和力，避免了依赖“高于阈值的结合子中核苷酸出现频率反映结合偏好”这一潜在假设。测量在溶液中进行，无需固定化，也无机械或化学因素干扰结合反应，尽可能接近平衡状态。通过受控递送系统，可在单个孔中完成完整的滴定曲线测量，在节省蛋白用量的同时，提高了通量和可靠性。采用高数值孔径物镜和高光收集效率的 EM-CCD 相机，可实现高灵敏度的荧光信号检测。因此，在该系统下，低至 10–15 mP 的微小荧光各向异性（FA）变化也能被准确检测；实际应用中，这意味着只要结合后质量增加极小（质量比低至 2）的结合反应均可被轻松检测。而商用系统（如微孔板读数仪）通常难以实现这一点。由于其高灵敏度，HiP-FA 可将解离常数的可靠测量范围扩展至皮摩尔（picomolar）级别，能够在多个数量级范围内准确测定结合能。
为了评估修订后的PWMs的质量，我们进行了两种类型的分析20。我们针对体节基因网络中的五个因子，检验了不同PWMs在21个体节基因的基因组区域中预测实验性ChIP-seq谱图的能力。作为第二种检验，我们使用了一种基于序列到表达的模型4，该模型根据参与的转录因子（TFs）的结合偏好及其蛋白浓度来预测体节增强子的表达模式。在这两项分析中，我们发现特异性较低的HiP-FA PWMs显著优于特异性较高的足迹法（footprinting）和B1H PWMs20。
与……不同 从头合成 方法方面，HiP-FA 需要预先了解特定转录因子（TF）的结合偏好。然而，许多转录因子的共识序列已被明确，且现有多种方法可提供此类信息13,14,15如有需要，可通过迭代法找到真正的最优结合序列。
我们使用了用 Cy5 和 Bodipy-650 荧光标记的 DNA 参考寡核苷酸。这些染料在荧光各向异性（FA）测量中表现良好，因为与其他测试过的染料相比，标记后的参考 DNA 在结合态与游离态之间的各向异性差异最大，从而确保了 FA 值具有最大的动态范围。通常，任何荧光寿命 ≥ 1 ns 的荧光染料都可能适用，但需预先进行测试。如果条件允许，建议使用在近红外区域发光的染料，以尽量减少蛋白质的自发荧光干扰。
实验步骤中最关键的环节是将凝胶移液至孔板中。为了获得良好的重复性，凝胶体积应尽可能均匀。凝胶高度的变化会转化为竞争性DNA寡核苷酸扩散系数的变化，从而在数据分析时表现为表观亲和力的变化。这是技术重复实验中变异性的主要来源。使用电子移液器或自动化技术可提高重复性。通过缓慢而小心地移液可避免凝胶中产生气泡。此外，应尽快将所有竞争溶液加至滴定孔的上方。为了获得最佳重复性，整个过程可使用配备加热孵育器的移液机器人实现自动化。将该方案转移至自动化操作时，关键在于对孵育器温度和孵育时间进行必要的优化。务必在凝胶黏度（即，不太冷）以及蛋白质的稳定性（即， 不太热）。这取决于将凝胶加入孔板的速度以及所用蛋白质的稳定性。
HiP-FA 采用一种受控递送系统来传递竞争性 DNA 寡核苷酸。为了构建滴定曲线，必须确定凝胶基质中每个给定 z 位置和时间点 t 对应的竞争性 DNA 浓度 c(z,t)。这是另一个关键步骤，因为 KDs 的确定直接依赖于 c(z,t)。为此目的，使用含有 NB 染料的校准孔作为 DNA 浓度的传感器（图 1d，图 2a）。通常，每块板上含有 NB 的校准孔设置 3 至 5 个即足够。在分析任何 HiP-FA 实验之前，应通过在琼脂糖凝胶中对任意序列的竞争性 DNA 进行一系列常规浓度梯度滴定，建立 NB 校准曲线（图 3a），具体操作详见步骤 8。对于结合能力极强的情况（KD &#60; 500 pM），用于推断低浓度竞争性 DNA 的外推法会成为限制因素，因其准确性低于直接测量。然而，对于具有如此低 KD 值的转录因子，可利用 HiP-FA 装置在结合缓冲液中进行常规竞争性滴定，而无需使用琼脂糖凝胶基质（图 5）。例如，可在一块 96 孔板的单一行中完成包含 12 个不同竞争性 DNA 浓度的完整滴定实验。
该可控递送系统还要求转录因子与DNA具有快速的结合动力学特性以及稳定的蛋白质，因为其在琼脂糖凝胶中的扩散是动态的（尽管速度较慢）。这两种特性均可通过HiP-FA装置直接检测，方法是随时间追踪目标转录因子与其各自荧光标记的参考DNA结合后的荧光各向异性（FA）。我们测定了所研究因子的KON和KOFF速率，发现其数量级为毫秒至秒20，与其他研究结果一致30。这一速率足够快，可确保测量在平衡状态下进行。对于动力学较慢的其他结合反应，可通过降低竞争物浓度或减小凝胶孔径来调节其扩散性。对于本实验中测试的所有转录因子（其TOFF均较快，约为数秒），每次测量约需1–2小时的总测量时间即可确保达到热力学平衡。
与该蛋白质相关的另一个潜在问题是蛋白质聚集体的形成，这可能会改变脂肪酸（FA）的测量结果。如有必要，可使用含有不同添加剂（如表面活性剂）的其他缓冲条件来防止聚集体的形成。
我们是在PWM的线性假设下进行工作的；然而，HIP-FA可以扩展以涵盖共识序列的所有可能的二核苷酸突变。最后，HiP-FA还可被改造用于测量其他类型的结合相互作用。其前提是拥有可被蛋白质结合并能够进行荧光标记的合适参考分子。借助可控递送系统，可为任何类型的配体生成浓度梯度；因此，蛋白-蛋白相互作用和药物-蛋白相互作用均可实现同样高保真度和高通量的测量。

鉴于转录因子（TFs）在基因调控中的核心作用，以定量方式确定其DNA结合偏好至关重要。von Hippel 的开创性研究提出，调控性转录因子能够快速识别DNA，其结合行为可用热力学平衡良好描述，而后续招募RNA聚合酶至启动子的过程则由较慢的动力学控制。1. 近期 体内 结合研究提示，这一图景可能更为复杂2,3然而，这些一般性假设作为近似方法是有效的，并已支持了许多通过序列寻找顺式调控元件和预测基因表达的计算方法4,5,6尽管平衡结合已被成功地作为一个概念加以应用，但目前测定转录因子- DNA 相互作用的方法主要关注结合特异性，通常并不直接测量平衡状态下的结合亲和力。系统性测量转录因子-DNA 结合具有较大的技术挑战性，现有方法存在多种不同的局限性。
染色质免疫沉淀结合深度测序（ChIP-seq）7，最常见的 体内 技术，无法测量结合亲和力，也无法精确定位基因组片段内的结合位点。多个 体外 方法，包括DNase足迹分析8电泳迁移率变动（EMSA）9，表面等离子共振（SPR）10，以及微尺度热泳动11 能够测量结合亲和力，但通量相对较低。相比之下，高通量技术包括蛋白质结合微阵列12，高通量系统进化指数富集技术13,14，以及细菌单杂交（B1H）15 无法测量结合亲和力，且通常产生过于特异的结合序列，这主要是由于必要的严格筛选或洗涤步骤所致。近期发展包括基于深度测序的 HiTS-FLIP16，SELEX-seq17，以及基于微流控技术的MITOMI18 或SMILE-Seq19，可提取绝对结合亲和力；然而，该方法依赖于标记的转录因子（TF）和DNA的荧光强度测量。因此，在低蛋白浓度下以及测定低解离常数（K）时，荧光信号成为限制因素D 值（&#60; 约10 nM）。此外，这些方法中的转录因子- DNA 结合发生在薄层表面，容易引发非特异性结合和/或自发荧光背景问题，从而难以精确量化弱结合信号。
为解决这些局限性，我们开发了一种新方法，用于在平衡状态下和溶液中测定转录因子- DNA 亲和力图谱，该方法被称为高效荧光各向异性（HiP-FA）20。该技术基于已建立的荧光各向异性（FA）检测方法21，但经过改进，结合定制的自动化显微镜和分析系统，能够以高灵敏度大规模测定结合常数。
荧光各向异性（FA）实验通过测量标记分子的分子旋转，来监测荧光标记物种（如DNA寡核苷酸）与其结合伴侣（在此为转录因子，TF）之间的相互作用。当标记分子与TF结合后，由于结合复合物的流体动力学半径和分子量增大，其旋转速度降低，从而导致荧光各向异性增强。准确测量极强的结合相互作用（KD &#60; ~1 nM）需要使用极低浓度的荧光标记参考DNA（c &#60; ~1 nM），而使用商用仪器（如标准微孔板读板仪）难以实现这一条件。此外，通常要求结合态与未结合态复合物之间具有较大的尺寸差异（10至100倍），这限制了对转录因子DNA结合结构域与短DNA寡核苷酸之间相互作用的检测，因为这两者的分子量通常相近。最后，获得完整的滴定曲线通常需要制备并检测多个含有滴定物种浓度梯度的孔。
为解决这些问题，我们采用了一种宽场显微镜装置，并对其进行改造，以实现高检测灵敏度，并可在单个孔的不同 z 位置进行荧光各向异性（FA）测量。这使我们能够监测分子量相近且具有高亲和力的物种之间的结合相互作用。通过在多孔板格式中进行 FA 测量，并利用可控递送系统在单个孔内完成完整的滴定系列，从而实现更高的通量（图1a）。此外，通过采用竞争性结合实验，我们不仅能够获得结合常数，还能测定活性蛋白的浓度。这是该实验方法的一个重要特征，因为由于蛋白质错误折叠或降解，仅有一部分表达的转录因子（TF）分子具有活性。实验装置基于一台商用落射荧光显微镜，配备 XY 和 Z 向压电载物台。我们为系统加装了外置激光激发光源，并利用具有高量子效率的电子倍增 CCD（EM-CCD）相机芯片，分别检测两种发射的线性偏振组分（图1b 和 1c）。该系统采用高数值孔径（NA）物镜与超灵敏传感器耦合，因而能够实现高度灵敏的 FA 测量。通过记录荧光 z 轴层扫图像，在使用非均相反应基质时，可沿光学 z 轴方向测量结合相互作用。所有这些改进均可在现有系统上便捷实施，且成本效益高。
我们采用一种竞争性结合实验，通过与荧光标记的DNA（作为参照）进行比较，测定未标记DNA寡核苷酸的结合亲和力。转录因子（TF）与参照DNA以固定浓度包埋于多孔琼脂糖凝胶基质中（孔径约1 µm），该基质为结合反应提供了非相互作用的环境。参照DNA以Cy5进行标记。该染料因其相对较长的荧光寿命（约1 ns）以及在可见光谱远红区的荧光发射（自发荧光背景低），被证明非常适合用于荧光各向异性（FA）测量。转录因子的浓度在摩尔量上超过Cy5标记的参照DNA，确保所有参照DNA均与蛋白质结合。随后将未标记的竞争性DNA溶液施加于凝胶表面，使其扩散进入多孔基质，形成浓度梯度。 c(z, t) 随时间变化的 z焦平面位置和时间 t (图1a 图2a-2c因此，结合在Cy5标记参照DNA上的转录因子局部暴露于不同浓度的竞争DNA中，后者会竞争结合位点，导致Cy5标记参照DNA的荧光各向异性（FA）发生动态变化 脂肪酸参考文献(z, t) (图2b 和 2c).
为了确定竞争物浓度 c(z,t)，我们在独立的孔中（校准孔）测量尼罗蓝（NB）的动态变化的荧光各向异性信号 FANB(z,t)（图2a 和 图3）。该染料可插入DNA中，从而作为竞争性DNA的DNA传感器。利用这种受控递送系统，可在一块多孔板（96孔或384孔板格式）内同时测量数十至数百种不同的DNA-蛋白质结合亲和力。随后依次进行测量，直至标记的参考DNA完全从转录因子（TF）上被置换下来。我们通过测定长度为 N 的共识序列全部 3N 种单碱基突变体的亲和力，来确定特定因子的结合特异性。HiP-FA 方法仅需少量蛋白质（每条滴定曲线约皮摩尔量级），在测定解离常数 KD 时表现出低变异性［变异系数（CV）&#60; 20%］，同时支持较大规模的测量。该方法可手动操作，也可使用机器人系统实现全自动操作，后者可进一步降低变异系数（图4，上图面板）。该方法可高精度测定低至0.5 nM的解离常数。对于极高亲和力（KD &#60; 500 pM）的情况，由于在低浓度下（&#60; 100 nM）测定竞争物DNA浓度存在不准确性，我们采用标准的竞争性滴定法（图5）。
HiP-FA 几乎可在任何标准的倒置落射荧光显微镜上实施，前提是配备自动化的 XY 载物台和压电式 z 轴载物台。光学组件基于配备长工作距离物镜的自动化宽场系统构建。在实际操作中，该检测方法可适配具有其他特性的物镜（特别是工作距离和数值孔径）。然而，这需要对参数进行优化（各距离之间的） z-琼脂糖凝胶的切片厚度、孔隙率和高度， 等等。也可使用其他类型的激光器或相机。完整的实验步骤和数据分析方法详见下文的方案部分。

<table><tbody><tr><td>Cy5标记的16-/18-碱基DNA寡核苷酸</td><td>Eurofins</td><td></td><td>定制合成</td></tr><tr><td>16-/18-碱基DNA寡核苷酸</td><td>Eurofins</td><td></td><td>定制合成</td></tr><tr><td>尼罗蓝A</td><td>Sigma</td><td>N5632-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sensoplate plus 96孔或384孔微孔板，聚苯乙烯材质</td><td>Greiner</td><td>655891</td><td>底部为175 &amp;micro;m厚玻璃</td></tr><tr><td>384孔Sensoplate，黑色</td><td>Greiner</td><td>788896</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414-50G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>二水合磷酸氢二钾</td><td>Merck</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Q-POD Element</td><td>Merck Millipore</td><td>ZMQSP0DE1</td><td></td></tr><tr><td>Millipak 40 Gamma Gold滤器</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGL04GK2</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Integral 3纯水系统</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td></td></tr><tr><td>Quantum TIX</td><td>Merck Millipore</td><td>QTUMOTIX1</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>Z316083</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal管，1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Multiply-Pro杯，0.2 mL，聚丙烯材质</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜系统设置：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>全自动宽场显微镜</td><td>LEICA</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>长工作距离物镜</td><td>LEICA</td><td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td><td></td></tr><tr><td>638 nm连续波二极管激光器</td><td>Omicron</td><td>PHOxX 638-40, 40mW</td><td></td></tr><tr><td>背照式电子倍增CCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon DV897</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>AHF</td><td>640nm截止</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>AHF</td><td>ET带通 700/75</td><td></td></tr><tr><td>线性偏振片</td><td>Thorlabs</td><td>LPVISC050-MP2</td><td></td></tr><tr><td>偏振分束器</td><td>Thorlabs</td><td>BS010</td><td></td></tr><tr><td>消色差透镜</td><td>Thorlabs</td><td>焦距200 mm</td><td></td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>Optronis</td><td>FVP600660710</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;机器人系统：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>本机器人系统包含一台Biomek NXP工作站，配备96通道移液头和Span-8移液器，并通过伺服穿梭装置连接，用于执行所有液体转移步骤。此外，系统还配备轨道摇床和微孔板读板仪（Paradigm，Molecular device），由Span-8夹持器进行操作</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek NXP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>编程语言</td><td>National Instruments</td><td>Labview 9.0</td><td></td></tr><tr><td>HiP-FA软件脚本可从以下地址获取</td><td></td><td></td><td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td></tr></tbody></table>

利用荧光显微镜通过竞争性滴定法高灵敏度测定转录因子-dna结合亲和力

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

准确量化转录因子（TF）与DNA的相互作用对于理解基因表达调控至关重要。由于现有方法存在显著局限性，我们开发了一种高灵敏度、可大规模测定TF-DNA结合亲和力的新方法。该检测基于成熟的荧光各向异性（FA）原理，但在技术上进行了重要改进。首先，我们在多孔琼脂糖凝胶基质中同时加入转录因子和荧光标记的参考DNA，在单个孔中测量完整的FA竞争滴定曲线。未标记的DNA寡核苷酸作为竞争物加在顶部，通过扩散形成时空浓度梯度。随后使用定制的落射荧光显微镜系统读取所产生的FA梯度信号。这一改进的装置显著提高了FA信号检测的灵敏度，使得即使对于分子量相近的分子，也能可靠地定量弱结合与强结合。通过这种方式，我们可在多孔板的每个孔中测定一条滴定曲线，并通过拟合程序提取绝对解离常数（KD）和活性蛋白浓度。通过测试给定共识结合序列的所有单点突变变体，我们可以在单个微孔板上全面检测转录因子的完整结合特异性图谱。由此生成的位置权重矩阵（PWMs）在预测性能上优于其他方法所获得的矩阵 体内 转录因子占据情况。本文中，我们提供了在常规自动化荧光显微镜上实施HiP-FA实验及相应数据分析流程的详细指南。

我们对生成果蝇胚胎头尾体节模式的分割基因网络中的转录因子（TFs）应用了HiP-FA技术25,26，该过程主要通过转录调控实现。在该网络中，我们选择bZIP结构域转录因子Giant（Gt）进行详细分析（图4）。由于全长转录因子难以表达，且其DNA结合结构域（DBD）通常能产生与全长蛋白几乎相同的结合偏好性13，因此我们采用了与GST融合表达的DBD片段，并在E.coli中表达该融合蛋白；GST融合蛋白可获得与单独DBD相同的结果20。
Gt 共有序列（ATTACGTAAC）是我们如上所述确定的最强结合序列。随后，我们研究了在10碱基Gt共有序列内所有可能的单点突变（共30种）对结合能的影响，这些突变序列的两侧带有额外的5'和3'端碱基。我们测量了两个通过自动化方式制备凝胶样品的重复实验，并额外进行了一次人工制备样品的重复实验以作比较。单突变序列的KD值范围为0.6至&gt;2000 nM，我们还证实了对“无结合”序列完全无结合活性（数据未显示）。
转录因子- DNA 结合特异性通常使用位置权重矩阵（PWM）进行建模，其中为结合基序中每个位置上的每种可能核苷酸分配一个分数。PWM 假设每个位置对结合强度的贡献相互独立，在大多数情况下足以描述转录因子的结合偏好27。我们根据已建立的方法28,29，利用测得的亲和力数据生成了修订后的 PWM，并将其与文献中先前报道的两个 PWM 进行比较。第一个 PWM 基于通过 DNA 足迹法鉴定出的结合位点中的核苷酸频率统计4,5，第二个 PWM 则通过细菌单杂交（B1H）筛选获得15。
三个重复实验的PWMs具有高度相似性（图4，上图），包括手动制备的样本（重复3），表明HiP-FA方法具有高度的可重复性。尽管HiP-FA获得的PWMs总体上与其他方法获得的PWMs相似（图4，下图），但仍存在显著差异：在第2位点（黑色箭头），即核心bZIP基序的起始位置，突变T&gt;(G,C,A)导致HiP-FA获得的基序中结合能力完全丧失，这与B1H基序一致，但与DNase足迹法获得的基序不符，在后者中，(G,A)碱基的结合仍相对较强。相反，在第7位点（灰色箭头），突变T&gt;C导致的结合强度远高于先前测定的PWMs所预期的结果。
其他差异较为细微，但同样重要。总体而言，HiP-FA 获得的 PWM 特异性低于另外两种方法，这反映出即使偏离共识序列的许多突变仍能导致中等强度的结合。这一特性可通过信息含量（IC）进行量化。HiP-FA 矩阵的信息含量为 11.5 比特（三个重复实验的平均值），而 DNase 足迹法和 B1H 矩阵的信息含量分别为 13.4 比特和 16.8 比特。根据已研究的 26 种转录因子，通常（尽管并非普遍）HiP-FA 方法获得的 PWM 特异性低于其他方法20。
<img alt="琼脂糖凝胶中Cy5标记DNA的扩散实验，荧光检测，激光装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：HIP-FA分析法与实验装置的示意图。(a) 用于在单个孔中滴定竞争性DNA的凝胶递送系统。(b) HIP-FA显微镜装置。定制的自动化宽场显微镜，配备EM-CCD相机，用于检测偏振荧光信号。(c) 原始荧光图像，其中两个感兴趣区域用于测定平行（红色）和垂直（绿色）偏振分量。(d) 96孔板的典型布局。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光检测图和结合KD图表，比较强结合与中等强度结合，数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：原始荧光各向异性（FA）数据及重建的滴定曲线。 (a) 含有NB的校准孔中典型的FA(z,t)轨迹。(b,c) 两个滴定孔的FA(z,t)时间轨迹，用于测量与强结合(b)和较弱结合(c)DNA竞争物的结合。(d, e) 对应的重建FA滴定测量结果及拟合曲线，分别对应强结合(d)和中等强度结合(e)。(d, e) 对应的重建FA滴定测量结果及拟合曲线，分别对应强结合(d)和中等强度结合(e)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA结合分析；显示竞争性DNA浓度与ΔFA、浓度与循环次数关系的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：利用尼罗蓝（NB）测定竞争性DNA的浓度c(z,t)。 （a）16个碱基对DNA寡核苷酸的荧光各向异性（FA）-浓度校准曲线。在常规滴定实验中，将NB包埋于琼脂糖凝胶中，并加入不同浓度的竞争性DNA。NB与DNA的结合亲和力与序列无关20；因此，相同长度但不同序列的DNA可使用相同的校准曲线来确定其c(z,t)。（b）通过五个校准孔测定的某一任意高度z处竞争性DNA的时间扩散曲线。在每个测量周期中，四个含NB孔的平均FA值以白色圆点表示。曲线根据公式3进行拟合（白色实线，单个孔以彩色显示），在低浓度条件下（C &lt; ~100 nM）的c(z,t)由外推拟合曲线确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HiP-FA 方法比较；序列标志图；自动与手动 DNA 足迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：bZIP 结构域家族转录因子 Giant (Gt) 的结合特异性。 三个重复实验的 HiP-FA PWM 结果（上图）：其中两个样本采用自动化方式制备，一个为手动制备，与通过 DNase 足迹法和细菌单杂交（B1H）筛选方法生成的 PWM（下图）进行比较。总体而言，HiP-FA 结合模体与先前数据一致，但也显示出显著差异，如黑色和灰色箭头所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光各向异性 FA 热图和结合曲线；DNA 竞争实验；Kd 测定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：使用 HIP-FA 进行常规竞争滴定。 (a) 板式设计显示在 96 孔板的一行中，8 种不同竞争 DNA 在结合缓冲液中进行连续稀释。图中展示了不同任意结合强度下的 FA 热图。(b) 三种与 Bcd 转录因子结合能力不同的竞争 DNA 进行竞争滴定实验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种在溶液中高灵敏度、大规模测定平衡状态下结合亲和力的新方法。该方法可改进转录因子与DNA结合的定量分析。本方法基于在受控递送系统中进行的自动化荧光各向异性测量。

利用荧光显微镜通过竞争性滴定法高灵敏度测定转录因子-DNA结合亲和力

转录因子（TF）与DNA相互作用的精确定量对于理解基因表达调控至关重要。由于现有的……

为了加深对转录因子与DNA结合的理解，我们开发了一种大规模测定解离常数的方法，例如使用各向异性测量技术。该方法能够自动获得完整的滴定曲线，以高灵敏度确定解离常数。该技术在溶液中平衡状态下进行，具有中等通量和宽广的动态范围。我们应用HiP-FA来精细描绘转录因子的结合亲和力图谱。然而，该方案也可用于其他类型的结合事件，例如蛋白质-蛋白质或蛋白质-药物相互作用。我建议首先使用相同的结合配对进行多次滴定实验，以评估测量结果的可重复性。如有条件，可使用自动化系统以获得更佳的可重复性。将每种十毫摩尔的双标记正向链和未标记反向链各七微升混合于一个离心管中，以退火参考DNA的寡核苷酸。对于竞争DNA，将每种100毫摩尔的未标记链各20微升分别加入96孔PCR板的两个孔中。然后，使用标准PCR仪将DNA溶液加热至70摄氏度，持续3分钟。接着以每秒0.1摄氏度的速率降至室温。使用微波炉将0.5克琼脂糖溶于100毫升结合缓冲液中。加入重蒸水以调整最终体积，以补偿可能的蒸发损失。制备10毫升的储备分装液。为准备96孔板的滴定和校准孔，将两份凝胶储备分装液转移至75摄氏度的恒温振荡培养箱中。对于每个滴定孔，加入1.4 纳摩尔的参照DNA、终浓度为20–60 纳摩尔的转录因子蛋白、0.2 毫摩尔的DTT，并加入结合缓冲液，使融化的凝胶总体积达到240 微升。通过倒置并轻轻振荡试管充分混匀。然后，将含有DNA的凝胶缓慢地每孔200 微升加入至96孔板中指定的滴定孔内。对于每个校准孔，向 240 微升熔化的凝胶中加入 5 纳摩尔尼罗蓝染料。避免产生气泡，将含染料的凝胶溶液缓慢吸取 200 微升，加入 96 孔板中的五到六个孔内。将凝胶置于完全水平的表面上，在室温下孵育 10 分钟，再于 4 摄氏度孵育 10 分钟。使用多孔板读数仪检测平板中不同孔内凝胶高度水平的均一性。为制备竞争性DNA溶液，首先将标记的参照DNA、蛋白质和三倍浓度结合缓冲液混合。然后，取20微升该溶液与40微升每种退火后的竞争性DNA溶液混合。对于每个校准孔，将适当体积的其中一种退火的竞争性DNA溶液与含有15毫摩尔尼罗蓝染料溶液的三倍浓度结合缓冲液混合。最后，尽可能同时将50微升混合后的竞争性溶液加至凝胶表面。开始图像采集时，将96孔板放置在显微镜载物台上。然后，对各孔进行Z轴层扫成像的时间序列采集，直至蛋白质完全从参照DNA上解离。按照论文所述方法进行滴定实验。随后使用HiP-FA软件为各个竞争序列生成滴定曲线。然后，点击导出按钮以获得每次滴定孔中的解离常数和活性蛋白浓度。吸取黏稠的凝胶溶液时需特别小心。移液不准确会降低解离常数测定的准确性。本研究中，采用HiP-FA方法确定果蝇体节形成基因网络中的B-zip转录因子Giant的DNA结合偏好性。通过手动或自动化技术制备的重复样本，其PWM结果具有高度相似性，表明HiP-FA方法具有高度的可重复性。通过该方法及其他方法获得的PWM总体相似。然而，在核心基序的第二位和第七位上可以观察到显著差异，这些位置的突变可能导致完全丧失结合能力，或比先前测量结果强得多的结合能力。我们使用HiP-FA对数十种转录因子的结合情况进行优化，结果表明，最终获得了对数据更准确的预测。我们认为，其高精度的测量对于更好地理解所有系统或各类相互作用中的转录因子- DNA 结合具有重要意义。

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