Name: crispr 介导的人类真菌病原体白色念珠菌基因组编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学习利用CRISPR技术对人类真菌病原体白色念珠菌进行高效基因组编辑的方法。该技术可实现精确的基因修饰，有助于研究真菌致病机制并开发新型治疗策略。

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作者感谢 Gennifer Mager 博士对稿件的审阅和有益的评论。本研究得到了 Ball State 大学实验室启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH-1R15AI130950-01）对 D.A.B. 的资助。

1. 向导RNA序列的鉴定与克隆
<ol>
	<li>确定向导RNA序列
	<ol>
		<li>在将要插入终止密码子的位置附近，找到一个5’-NGG-3’的PAM序列。（图1A）中标注了在TPK2基因前100个碱基对中发现的所有PAM序列（图1A）。 
		注意： 针对每个C. albicans开放阅读框的向导序列可在http://osf.io/ARDTX 处获取11,12。</li>
		<li>确定正向向导引物_3序列，该序列为NGG PAM位点上游紧邻的20个碱基，且不包含连续超过5个T。用鼠标左键点击NGG位点正上游的碱基，并向左拖动光标选择20个碱基，然后点击引物标签以添加该引物。</li>
		<li>确定反向向导引物_3序列，该序列应为正向向导序列的互补序列。 
		注意： 图中所示为使用PAM_3的向导序列（图1B）。</li>
		<li>右键点击引物并选择“复制引物数据”。将序列粘贴至文本编辑程序中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为正向和反向向导寡核苷酸添加用于克隆的突出端序列（表1，图1B）。
	<ol>
		<li>在购买前，在正向向导引物_3的5’端添加核苷酸序列ATTTG。</li>
		<li>在购买前，在正向向导引物_3的3’端添加G。</li>
		<li>在购买前，在反向向导引物_3的5’端添加核苷酸序列AAAAC。</li>
		<li>在购买前，在反向向导引物_3的3’端添加C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用BsmBI酶切CaCas9表达载体pV1524。 
	注意： pV1524含有氨苄青霉素（Ampr）和诺尔斯曲菌素（Natr）抗性标记。Cas9已针对C. albicans进行密码子优化。
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中加入：2 μg pV1524质粒、5 μL 10x缓冲液、1 μL BsmBI酶及ddH2O补足至50 μL，混匀后于55 °C孵育20分钟。（或者，可使用BsmBI的同裂酶Esp3I，在37 °C下酶切15分钟。）</li>
		<li>冷却至室温（RT），在2,348 x g条件下离心30秒，使冷凝液沉至管底。随后进行步骤1.4，或将酶切后的质粒于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对酶切后的载体骨架进行磷酸酶处理。
	<ol>
		<li>向酶切混合物中加入1 μL小牛肠碱性磷酸酶（CIP），37 °C孵育1小时。</li>
		<li>使用市售的聚合酶链式反应（PCR）纯化试剂盒纯化酶切质粒（操作按试剂盒说明书进行），并用30 μL洗脱缓冲液（EB）洗脱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对正向向导引物_3和反向向导引物_3进行磷酸化并退火。
	<ol>
		<li>在PCR管中加入：0.5 μL 100 μM正向向导引物_3、0.5 μL 100 μM反向向导引物_3、5 μL 10x T4连接酶缓冲液、1 μL T4多核苷酸激酶及43 μL H2O。</li>
		<li>在另一PCR管中加入：5 μL 10x T4连接酶缓冲液、1 μL T4多核苷酸激酶及44 μL分子生物学级H2O。 
		注意： 此管作为阴性对照。</li>
		<li>将反应混合物置于PCR仪中，37 °C孵育30分钟，随后95 °C孵育5分钟。</li>
		<li>以最慢的降温速率冷却至16 °C，使寡核苷酸退火。退火完成后将混合物置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将退火后的寡核苷酸连接至步骤1.4.3中获得的酶切pV1524质粒中。
	<ol>
		<li>在PCR管中加入：1 μL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 μL T4 DNA连接酶、0.5 μL退火寡核苷酸混合物、经CIP处理并纯化的酶切质粒（20–40 ng）以及ddH2O补足至10 μL总体积。</li>
		<li>在另一PCR管中加入：1 μL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 μL T4 DNA连接酶、经CIP处理并纯化的酶切载体（20–40 ng）、1 μL阴性对照混合物以及ddH2O补足至10 μL总体积。</li>
		<li>将两管反应物置于PCR仪中，16 °C孵育30分钟，随后65 °C孵育10分钟，最后冷却至25 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取5 μL连接产物，采用标准热激转化法转入化学感受态Escherichia coli DH5α菌株中，并在LB Amp/Nat培养基（200 μg/mL Amp，50 μg/mL Nat）上进行筛选。 
	注意： 若未在双抗筛选培养基上筛选pV1524及其衍生物，可能导致细菌中FLP/FRT介导的Nat/CaCas9/向导模块丢失。</li>
	<li>通过质粒小提纯化四个转化子的质粒，并使用测序引物对插入序列进行测序（表1）。 
	注意：通常情况下，测序4个转化子足以鉴定出至少1个正确克隆。</li>
	<li>将含有向导RNA序列单次插入BsmBI切割位点的质粒于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 修复模板的设计与构建
<ol>
	<li>通过在基因序列中左键单击，并添加编码终止密码子和限制性酶切位点的核苷酸来插入终止密码子（图1C，表1）。 
	注意： 插入操作将破坏PAM序列。 
	注意： 修复模板序列中将包含一个限制性酶切位点，以方便高效筛选克隆（图1C）。</li>
	<li>在突变位点下游10个碱基处左键单击，并将光标向上游拖动60个碱基。单击引物标签以添加引物，这将添加修复模板正向引物_3。在突变位点上游10个碱基处左键单击，并将光标向下游拖动60个碱基。单击引物标签以添加引物，这将添加修复模板反向引物3（图1C）。</li>
	<li>进行引物延伸以生成修复模板。
	<ol>
		<li>向每个PCR管中加入1.2 μL 100 μm修复模板正向引物、1.2 μL 100 μm修复模板反向引物、6 μL脱氧核苷三磷酸（dNTPs）（总浓度40 mM）、6 μL缓冲液、0.6 μL Taq DNA聚合酶（3单位）以及45 μL H2O。</li>
		<li>通过运行20至30轮PCR进行引物延伸。示例延伸条件：95 °C预变性2分钟，(95 °C变性30秒，50 °C退火1分钟，68 °C延伸1分钟) × 34个循环，68 °C终延伸10分钟。</li>
		<li>将4个PCR管中的内容物合并至一个1.5 mL离心管中，并使用PCR纯化试剂盒将产物纯化至50 μL H2O中。</li>
		<li>定量引物延伸产物，通过测定260 nm处的吸光度确保获得足够的DNA量。 
		注意： 引物延伸产物的典型终浓度约为200–300 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用修复模板和质粒转化白色念珠菌（C. albicans）
<ol>
	<li>制备TE/醋酸锂溶液。
	<ol>
		<li>混合 10 mM Tris-Cl、1 mM EDTA、100 mM 乙酸锂和 H2O（所有储备液 pH 7.5）至终体积 50 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作 PLATE
	<ol>
		<li>混合 40% PEG 3350、100 mM 醋酸锂、10 mM Tris-Cl、1 mM EDTA 和 H2O（所有储备液 pH 值为 7.5）以达到总体积 50 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化步骤1.9中正确克隆的质粒。
	<ol>
		<li>加入10 μg质粒、4 µL 10x缓冲液、0.4 µL 10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、0.5 µL KpnI、0.5 µL SacI以及H20至40 µL总反应体积，置于1.5 mL离心管中。37 °C孵育过夜（图1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养一管过夜培养物 C. albicans SC5314，野生型原养型菌株，在添加了0.27 mM尿苷（YPD + Uri）的酵母胨葡萄糖培养基中，于25 °C培养，理想条件下至OD600 小于6
	<ol>
		<li>5 OD 离心沉淀600 每次转化每单位细胞数，以2,348 x重力加速度离心5分钟 g 并重悬至 5 OD600 100 µL TE/醋酸锂中的细胞沉淀</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向一个1.5 mL离心管中按以下顺序加入：1）3.4.1步骤中的100 µL细胞，2）40 µL煮沸后快速冷却的鲑鱼精子DNA（10 mg/mL），3）3.3.1步骤中获得的10 µg质粒消化产物，4）6 µg纯化的修复模板，以及5）1 mL PLATE。</li>
	<li>向一个1.5 mL离心管中按以下顺序加入：1）100 µL细胞，2）40 µL煮沸后快速冷却的鲑鱼精子DNA（10 mg/mL），3）H2与第3.5步中转化DNA等体积的溶液，以及4）1 mL的PLATE。 
	注意：这将作为阴性对照。</li>
	<li>用移液器轻轻混匀转化产物，于25 °C孵育过夜。</li>
	<li>将细胞置于44 °C水浴中热激25 min。</li>
	<li>离心5分钟，2,348 x g 在台式离心机中离心，弃去PLATE混合物的上清液。加入1 mL YPD + Uri重悬沉淀，洗涤一次，再次于2,348 x g离心5 min。 g.</li>
	<li>将细胞重悬于 0.1 mL YPD + Uri 中，于 25 °C 在滚轴摇床或摇床中过夜培养。</li>
	<li>在含有200 μg/mL 诺尔斯霉素的YPD + 尿嘧啶培养基上划线培养，菌落将在2–5天内出现。</li>
</ol>
4. 单菌落划线
<ol>
	<li>将一个 100 mm × 15 mm 的培养皿均分为四个象限，并标记每个象限。
	<ol>
		<li>用无菌牙签或接种棒接触转化平板上的一个菌落，并在象限的最长边上划线接种。</li>
		<li>采用无菌技术进行单菌落分离划线，于 30 °C 培养 2 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 菌落PCR
<ol>
	<li>在引入的限制性酶切位点上游约 200 个碱基处设计正向验证引物（FCP），在下游约 300 个碱基处设计反向验证引物（RCP）。
	<ol>
		<li>向一个 1.5 mL 离心管中加入 0.3 μL FCP、0.3 μL RCP、0.3 μL 耐热 DNA 聚合酶（ExTaq，1.5 单位）、3 μL dNTPs（总浓度 40 mM）、3 μL ExTaq 缓冲液和 23 μL H2O。 
		注意：每反应加入 0.5 μL 二甲基亚砜（DMSO）可提高 PCR 扩增效率。</li>
		<li>使用 P10 移液器吸头，从 4.1.2 步骤中取 0.25 μL 单个酵母菌落加入到 5.1.1 步骤的混合液中，注意不要搅动琼脂。</li>
		<li>通过 PCR 扩增 DNA，并取 5 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增成功，操作时注意不要扰动管底的细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 菌落PCR的限制性酶切
<ol>
	<li>加入 10 μL PCR 产物（注意不要扰动管底的细胞沉淀）、3 μL 缓冲液、1 μL 限制性内切酶和 16 μL H2O，然后按照制造商说明书进行孵育，并在琼脂糖凝胶上电泳以鉴定正确的基因组编辑。 
	注意：此处使用的限制性内切酶为 TPK2 特异性修复模板中编码的位点。</li>
</ol>
7. 菌株保存
<ol>
	<li>从经限制性消化确认的菌落中，在 YPD + Uri 培养基中于 30 °C 培养过夜。</li>
	<li>取 1 mL 培养物与 1 mL 50% 甘油混合（使甘油终浓度为 25%），加入适合在 -80 °C 保存的离心管中。</li>
	<li>将正确的克隆菌株在 -80 °C 保存。 
	注意： 正确的菌株可在 -80 °C 保存多年。</li>
</ol>
8. 去除 Natr 标记
<ol>
	<li>将正确的转化子划线接种至酵母胨麦芽糖培养基（YPMaltose）（含2%麦芽糖）。</li>
	<li>从划线平板上挑取单菌落，于液体YPMaltose培养基（含20 g/L麦芽糖）中，30 °C振荡培养48小时。</li>
	<li>将200–400个细胞涂布于YPMaltose平板（含20 g/L麦芽糖），30 °C培养24小时。</li>
	<li>将平板复制至YPMaltose和YPMaltose（含200 μg/mL Nat）平板上。</li>
	<li>30 °C培养24小时。 
	注意：在含200 μg/mL 诺尔斯托辛（nourseothricin）的YPMaltose平板上不再生长，但在YPMaltose平板上正常生长的菌落，表明已丢失Natr标记(CaCAS9)和引导RNA。</li>
	<li>按照步骤7.1–7.3的方法保存已丢失Natr标记(CaCAS9)和引导RNA的菌株。 
	注意：一种类似的质粒pV1393使用SAP2启动子而非MAL2启动子。若基因编辑过程中使用pV1393，则在YCB–BSA培养基上生长可诱导flippase表达，从而去除Natr标记。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

C. albicans CRISPR 技术可高效编辑 C. albicans 基因组。质粒 pV1524 编码一种酵母密码子优化的 Cas9 蛋白，并设计为便于研究者将引导 RNA 序列克隆至 CaSNR52 启动子下游（图 1）11。必须通过测序确保引导序列仅以单拷贝形式插入 CaCas9 表达载体中，因为额外拷贝会阻碍基因组编辑。若 consistently 出现多个引导序列拷贝，应降低连接反应中退火引导序列的使用浓度。文中所述载体与方案可用于靶向任意 C. albicans 基因。尽管 C. albicans 为二倍体，仅需一次转化即可同时靶向基因的两个等位基因。此外，CRISPR-CaCas9 基因组编辑的持续性使研究者能够同时靶向基因家族中的多个成员。许多基因家族，如分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPS）和类聚集素序列蛋白（ALS），在 C. albicans 的致病性中具有重要作用。CRISPR 基因组编辑将促进对这些基因家族的功能研究。
上述方案通过在开放阅读框中引入终止密码子，从而产生表型上的无效突变（图2）。通过改变修复模板，可实现多种多样的遗传修饰。无义突变、错义突变和同义突变均可通过与适当的修复模板发生重组而插入。在修复模板中引入限制性酶切位点可简化转化子的筛选流程，因为缺乏该位点的样本必须通过测序进行鉴定12,13。此外，C. albicans 的CRISPR技术使研究人员能够实现基因的插入与缺失，因此成为插入亲和标签、进行启动子替换以及构建基因敲除的理想系统（图3）。对于这些突变，正确转化子的筛选更为耗时，必须对编辑区域进行测序，以确认修复模板已正确整合。此外，可能还需进行Southern印迹分析，以确保基因组其他位置未插入额外的基因拷贝。NGG PAM位点的要求对可靶向的基因组区域造成了一定限制。采用其他核酸酶（如Cpf1）或Cas9系统的变体所构建的替代性CRISPR系统，将有望显著缓解这些限制14。据研究人员目前所知，这些系统尚未应用于C. albicans。
上述方案中描述的CRISPR系统已开发为可应用于多种物种，包括Saccharomyces cerevisiae、Naumouozyma castellii以及人类病原体Candida glabrata11。对这些酵母进行转化和高效编辑需要对所述方案进行轻微调整，但编辑这些不同基因组的基本框架与C. albicans的编辑方案极为相似12。此外，酵母为基因组编辑技术的开发提供了优良的实验体系。在酵母中，当ADE2基因发生突变时，腺嘌呤生物合成途径的前体物质会积累，导致细胞呈现红色。这种易于观察的表型使研究人员能够识别已编辑的细胞，并快速优化基因组编辑方案。结合真菌领域已有的丰富分子生物学工具，目前已建立了多种酵母物种的基因组编辑方案15,16。基因组编辑技术在真菌中的广泛应用有望对众多科学领域产生重大影响。
CRISPR 极大地提高了对 C. albicans 进行基因组编辑的效率，但迄今为止，CRISPR 尚未被用于在 C. albicans 中开展全基因组范围的筛选。目前的实验方案需要提供修复模板以引入突变，因为 C. albicans 中的非同源末端连接通路效率较低12。为每个基因合成修复模板寡核苷酸是实施全基因组筛选的重要障碍。随着DNA合成成本的降低以及CRISPR技术的进步，构建缺失文库将变得更加可行。例如，从CaCas9载体pCas9中表达修复模板，为建立可长期使用的、靶向每个基因的质粒文库铺平了道路11。此外，已有研究开发出无需CaCas9表达载体整合至 C. albicans 基因组的瞬时 Candida CRISPR 实验方案17。另外，提高向导RNA的表达水平可提升基因组编辑效率18。这些以及其他CRISPR技术的进步，对于在 C. albicans 中建立全基因组筛选体系至关重要19,20,21,22。
C. albicans 基因组为二倍体，但 A 和 B 等位基因并不总是完全相同5。这种杂合性既带来挑战，也提供了机遇。如果目标是同时靶向两个等位基因，则必须使用能够作用于基因两个拷贝的 PAM 位点、向导序列和修复模板。然而，根据基因中单核苷酸多态性（SNP）的存在情况，C. albicans 的 CRISPR 系统可使研究人员靶向单个等位基因。这种精确性有望让研究人员探究不同等位基因之间的功能差异。在靶向特定等位基因时必须谨慎操作，因为已观察到等位基因水平或整条染色体水平的杂合性丢失（LOH）现象。在编辑单个 C. albicans 等位基因时，必须检查邻近的 DNA 序列，以确定克隆是否维持了二倍体 SNP 图谱。此外，C. albicans CRISPR 的脱靶效应非常低，但对于关键菌株，仍可考虑进行全基因组测序。

Candida albicans 是最常见的人类真菌病原体1,2,3。深入了解 C. albicans 与哺乳动物分子生物学之间的差异，对于开发下一代抗真菌治疗药物至关重要。这要求研究人员能够快速、准确地对 C. albicans 进行遗传操作。
长期以来，对C. albicans进行遗传操作一直具有挑战性。C. albicans无法稳定维持质粒，因此所有构建体都必须整合到基因组中。此外，C. albicans是二倍体，因此在敲除基因或引入突变时，必须确保两个等位基因拷贝均已被改变4。另外，某些C. albicans基因座具有杂合性，这进一步增加了遗传分析的复杂性5。为了对C. albicans进行遗传操作，通常需要进行多轮同源重组6。然而，由于基因组的二倍体特性以及构建体构建过程繁琐，这一过程可能十分耗时，尤其是在需要进行多个遗传修饰的情况下。这些局限性以及C. albicans在医学上的重要性，迫切需要开发新技术，使研究人员能够更便捷地操控C. albicans基因组。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）介导的基因组编辑是一种强大的工具，可使研究人员改变基因组的序列。CRISPR 需要三个组分：1）切割靶标 DNA 的 Cas9 核酸酶，2）将 Cas9 引导至目标序列的 20 个碱基的向导 RNA，以及 3）用于修复切割位点并引入预期改变的修复模板 DNA7,8。一旦向导 RNA 将 Cas9 带到目标基因组序列，Cas9 需要在向导序列的上游紧邻位置识别一个原间隔序列邻近基序（PAM）序列（NGG），才能切割 DNA9。对 20 个碱基的向导序列和 PAM 序列的双重要求提供了高度的靶向特异性，并限制了脱靶切割的发生。
CRISPR 系统已被设计用于编辑多种生物的基因组，并解决各种各样的问题10。本文描述了一种灵活且高效的 CRISPR 协议，用于编辑 C. albicans 中的目标基因。该实验在基因中引入一个终止密码子，导致翻译提前终止。其他类型的编辑可根据引入的修复模板而实现。一段带有诺尔斯硫霉素抗性标记（Natr）的片段被整合到 C. albicans 基因组中的中性位点，该片段包含酵母密码子优化的 Cas9（CaCas9）和一条向导 RNA。与编码目标突变的修复模板共转化后，可通过同源重组修复双链断裂，实现高效的基因组编辑。下文以 TPK2 基因的编辑为例进行说明，但 CRISPR 可针对 C. albicans 基因组中所有开放阅读框进行多次靶向编辑。该 CRISPR 系统两侧含有 FRT 位点，可通过诱导 CaCas9 表达质粒上编码的 Flippase 实现从 C. albicans 基因组中切除。该 C. albicans CRISPR 系统使研究人员能够准确、快速地编辑 C. albicans 基因组11,12。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>amresco</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bsmb1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶（CIP）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2810000ACS</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>BDH VWR analytical</td><td>BDH9230</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Kpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基</td><td>MP</td><td>3002-032</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>NEB3.1 Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>诺尔斯霉素</td><td>Werner Bioagents</td><td>74667</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>Sac1</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156L</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267X</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>复制平板装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滚筒摇床或振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr介导的人类真菌病原体candida albicans基因组编辑

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

该方法描述了利用CRISPR介导的高效基因组编辑技术对二倍体人类真菌病原体进行基因编辑 白色念珠菌 CRISPR 介导的基因组编辑在 C. albicans 需要 Cas9、引导 RNA 和修复模板。已构建一种表达酵母密码子优化 Cas9（CaCas9）的质粒。将位于 PAM 位点（NGG）正上游的引导序列克隆至 Cas9 表达载体中。随后通过引物延伸法构建修复模板 体外将修复模板和载体共同转化 C. albicans 导致基因组编辑。根据所使用的修复模板，研究者可以引入核苷酸改变、插入或缺失。如 C. albicans 是二倍体，可在基因的两个等位基因中同时引入突变，前提是A和B等位基因不含有干扰向导靶向或修复模板整合的单核苷酸多态性（SNPs）。如果所有家族成员中存在合适的保守序列，则可对多成员基因家族进行并行编辑。 C. albicans 所描述的CRISPR系统两侧带有FRT位点，并编码flippase。在诱导flippase表达后，抗生素标记（CaCas9）和引导RNA将从基因组中被切除。这使得研究者能够对基因组进行后续编辑。 C. albicans CRISPR 是一种强大的真菌基因工程工具，对所述实验方案进行微小调整即可实现对其他真菌物种的改造，包括 光滑假丝酵母，卡斯蒂利亚念珠菌 和 S. cerevisiae.

靶向的向导RNA序列和修复模板 白色念珠菌 TPK2， 根据上述建议的指导原则，设计了c-AMP依赖性蛋白激酶催化亚基的引物。序列如(所示表1， 图1。向导RNA被克隆至CaCas9表达载体中，并与修复模板共同转化至野生型中 C. albicans。一个 生态学RI 限制性内切酶消化位点和修复模板中的终止密码子可破坏 PAM 位点，有助于正确突变体的筛选（图1). 转化子划线培养以获得单菌落，并通过菌落PCR和限制性酶切筛选修复模板的整合情况 (图2)限制性消化可快速区分野生型与突变序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>寡核苷酸名称</td>
			<td>寡核苷酸序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Guide Primer_3</td>
			<td>ATTTGgggtgaactatttgttcgccG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Guide Primer_3</td>
			<td>AAAACggcgaacaaatagttcacccC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repair Template Forward_3</td>
			<td>tcagcaatatcagcaacaatttcaacaaccgcagcaacaactttatTAAGAATTCggcga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repair Template Reverse_3</td>
			<td>attttgtccagtttgggctgcagcagggtgaactatttgttcgccGAATTCTTAataaag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Check Primer</td>
			<td>ttaaagaaacttcacatcaccaag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Check Primer</td>
			<td>actttgatagcataatatctaccat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Primer</td>
			<td>ggcatagctgaaacttcggccc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的寡核苷酸列表。 指导引物序列中为克隆目的添加的位点以大写并加粗表示。修复模板中用于突变基因组DNA的序列以大写并加粗表示。
<img alt="显示CRISPR-Cas9靶向与修复的基因编辑示意图；包含序列引物和sgRNA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58764/58764fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：向导RNA与修复模板设计示意图。（A）TPK2 基因前100个核苷酸中所有PAM序列的标注。PAM序列3（PAM_3）被高亮显示，本研究使用该序列。（B）使用PAM_3设计的向导RNA。使用SnapGene设计的20个碱基的引物以小写蓝色表示；用于克隆所需的额外碱基以大写绿色表示，并偏移显示。（C）将插入TAA终止密码子和EcoRI位点的修复模板引物插入TPK2的阅读框中。与野生型序列不同的DNA以红色大写表示。（D）使用PAM_4在DNA正链上设计向导RNA的示例。（E）pV1524质粒在克隆向导RNA并用KpnI和SacI酶切后的示意图。Neut5L-5'和Neut5L-3'将载体靶向C. albicans基因组中的Neut5L位点。CaENO1p是驱动酵母优化的CaCas9表达的启动子。Natr 为诺瑟替星抗性表达盒。CaSNR52p是驱动向导RNA（sgRNA）表达的启动子。FRT位点可被翻转酶（FLP）切割并重组，从而在表达翻转酶时移除CRISPR表达盒。类似（E）的示意图由Vyas et al.11发表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58764/58764fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="TPK2基因编辑分析；电泳结果；EcoRI消化；DNA条带模式；PCR。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58764/58764fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：在TPK2基因中引入并验证终止密码子和EcoRI限制性酶切位点。 用于扩增的引物列于表1中。凝胶下方显示了野生型和突变型序列。该图已根据Vyas等人的研究进行了修改11。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58764/58764fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑示意图；上游/下游元件、启动子、亲和标签、DNA转录。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58764/58764fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：修复模板的示意图，用于产生（A）缺失和（B）插入。（A）中的灰色虚线表示修复模板引物中不存在的间隔序列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58764/58764fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

高效地对Candida albicans进行基因组编辑对于理解其致病机制及开发治疗手段至关重要。本文介绍了一种利用CRISPR技术快速、准确编辑C. albicans基因组的实验方案。该方案可使研究人员引入多种遗传修饰，包括点突变、插入和缺失。

CRISPR介导的人类真菌病原体Candida albicans基因组编辑

该方法描述了利用CRISPR介导的高效基因组编辑技术对二倍体人类真菌病原体白色念珠菌（Candida albicans）进行基因组编辑。CRISPR介导的基因组编辑……

该方法有助于揭示真菌与哺乳动物在分子水平上的差异，这些差异可被用于探索新的治疗策略。该技术的主要优势在于，与经典的同源重组技术相比，它能更高效地对白色念珠菌（C. Albicans）的基因组进行修饰。为了确定引导 RNA 序列，需在插入终止密码子位置附近寻找一个 NGG PAM 序列。此处显示的是 TPK2（一种环磷酸腺苷激酶催化亚基）前 100 个碱基对中找到的所有 PAM 序列。请确定正向引导引物三序列。该序列将位于 NGG PAM 位点上游 20 个碱基处，并且不包含超过五个连续的 T。用鼠标左键单击 NGG 上游的碱基，然后将光标向左拖动 20 个碱基。接着，单击引物标签以添加引物。现在，确定反向引导引物的三序列，该序列应为正向引导序列的互补序列。在NGG上游紧邻的碱基处左键单击，并将光标向左拖动20个碱基。对于每个引物，单击引物标签页以添加该引物。右键单击引物并选择复制引物数据。将序列粘贴到文本编辑程序中。在正向和反向引导寡核苷酸上添加突出序列，以方便克隆。在购买前，将核苷酸序列ATTTG添加至正向引导引物三的5'端，并在正向引导引物三的3'端添加G；最后，将核苷酸序列AAAAC添加至反向引导引物三的5'端，并在反向引导引物三的3'端添加C。通过向1.5毫升离心管中加入pv1524、10x缓冲液、bs9b1和水，总体积为50 µL，混匀后于55 °C孵育20分钟，对优化用于假丝酵母的cas9表达载体进行染料测试。将消化混合物冷却至室温，然后在2348 ×g下离心30秒，使冷凝液聚集于离心管底部。为对消化后的载体进行磷酸酶处理，向消化混合物中加入1 µL小牛肠磷酸酶。在37 °C孵育反应体系1小时。现在，将正向引导引物三和反向引导引物三与10x T4连接酶缓冲液、T4多核苷酸激酶及水在PCR管中混合，进行磷酸化和退火反应。另取一个PCR管，加入10x T4连接酶缓冲液、T4多核苷酸激酶和分子生物学级水，作为空白对照。将反应体系置于PCR仪中，37摄氏度孵育30分钟，随后95摄氏度孵育5分钟。以最慢的降温速率将混合物冷却至16摄氏度，以退火寡核苷酸。然后将退火后的寡核苷酸混合物在4摄氏度下孵育。现在将退火的寡核苷酸连接至已消化的PV1524中。在第一个PCR管中，加入10倍T4连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶、退火的寡核苷酸混合物、经CIP处理并纯化的消化质粒以及水，总体积为10微升。同样地，使用阴性对照混合物替代退火的寡核苷酸混合物，制备第二个PCR管。将两个PCR管置于PCR仪中，先在16摄氏度孵育30分钟，然后在65摄氏度孵育10分钟，最后冷却至25摄氏度。连接反应完成后，将连接产物转化至化学感受态细胞中，随后按照文本方案所述纯化并测序质粒。设计修复模板时，通过在基因序列上左键点击并添加编码终止密码子及限制性酶切位点的核苷酸来插入终止密码子。在预期突变位点下游10个碱基处左键点击，并将光标向上游拖动60个碱基。单击引物选项卡以添加引物。这将添加修复模板正向引物三。然后在突变位点上游10个碱基处单击并拖动光标至下游60个碱基处。单击引物选项卡以添加引物。这将添加修复模板的反向引物三。为生成修复模板，向四个 PCR 管中分别加入修复模板正向引物、修复模板反向引物、脱氧三磷酸核苷酸、缓冲液、TACH 聚合酶和水。现在通过进行20到30轮PCR来执行引物延伸。为了消化正确克隆的质粒，在1.5毫升离心管中加入质粒、10倍缓冲液、牛血清白蛋白、KPN 1、SAC 1和水，总体积为40微升。在37摄氏度下孵育过夜。同时，在添加尿苷的YPD培养基中，于25摄氏度下培养白色念珠菌SC5314（野生型原养型）过夜培养物。将培养物培养至600纳米处的光密度（OD 600）低于6。每项转化以2348 ×g离心5分钟，收集相当于5个OD 600单位的细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于100 µL TE/乙酸锂溶液中。现在，按以下顺序向一个1.5毫升离心管中加入重悬的细胞、经煮沸并快速冷却的鲑鱼精子DNA、质粒消化产物、纯化的修复模板以及上样缓冲液。同时以相同方式制备阴性对照，唯一不同的是用与转化DNA等体积的水代替转化DNA。转化反应在过夜孵育后，通过将细胞置于44°C水浴中25分钟进行热激处理。在台式离心机中以2348 ×g离心5分钟，去除孔板混合物的上清液。加入1毫升尿嘧啶补充YPD培养基洗涤一次，再次离心。将细胞重悬于0.1毫升尿嘧啶补充YPD培养基中，于25°C在滚筒摇床或摇床中过夜培养。第二天，将细胞接种到补充尿苷的YPD培养基中，培养基中需含有200微克/毫升的诺尔斯硫霉素。菌落将在2至5天内出现，应按照文本方案中所述方法划线分离单菌落。进行菌落PCR时，设计一个位于所引入限制性酶切位点上游约200个碱基的正向检测引物，以及一个位于下游约300个碱基的反向引物。向一个离心管中加入 0.3 微升正向验证引物、0.3 微升反向验证引物、0.3 微升耐热 DNA 聚合酶、3 微升 dNTP 混合液、3 微升 XTAC 缓冲液以及 23 微升水。然后使用 P10 移液器枪头吸取 0.25 微升单个酵母菌落加入该混合液中，注意不要扰动琼脂。PCR 扩增 DNA 后，取 5 微升 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增成功，操作时注意不要扰动离心管底部的细胞碎片沉淀。此处展示了利用CRISPR介导的基因组编辑技术在白色念珠菌（C. Albicans）中获得的代表性结果。将靶向白色念珠菌TPK2基因的引导RNA和修复模板共转化至白色念珠菌中。修复模板中包含EcoR1限制性酶切位点和终止密码子，可破坏PAM位点，便于对正确突变体进行筛选。通过菌落PCR结合限制性酶切可快速区分野生型序列与编辑后的序列。在进行该操作时，需注意检查PV1524载体中是否含有多个拷贝的向导RNA序列，因为这会降低基因组编辑效率。请注意，白色念珠菌是一种生物安全二级（BL2）病原体，在进行本实验操作时，务必始终穿着适当的实验服，并遵守所有安全规程。

crispr-mediated-genome-editing-human-fungal-pathogen-candida

Research

科研

JoVE Journal

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