crispr 介导的人类真菌病原体白色念珠菌基因组编辑
November 14th, 2018
白色念珠菌的高效基因组工程是了解治疗方法的发病机制和发展的关键。在这里, 我们描述了一个协议, 以快速和准确地编辑白色念珠菌基因组使用 crispr. 该协议允许调查人员引入各种各样的基因修饰, 包括点突变、插入和删除。
这种方法可以帮助揭示真菌和哺乳动物在分子水平上的差异。可以利用这种差异来确定新的治疗方法。与经典的同源重组技术比较，该技术的主要优点是它更有效地修改了C.Albicans的基因组。
要识别引导RNA序列，请确定靠近停止codon插入位置的NGG PAM序列。此处显示，所有 PAM 序列都位于 TPK2 的第 100 个碱基对中，这是一个循环 AMP 激酶催化亚单位。确定前导底三个序列。
此序列将是 NGG PAM 站点直接上游的 20 个基座，并且连续包含不超过 5 个 T。左键单击 NGG 正上游的基座，然后拖动光标 20 基。然后，左键单击底图选项卡以添加底图。
现在，确定反向导轨底像三个序列，这将是对前进导序的赞美。左舔 NGG 正上游的底座，拖动光标 20 底座。对于每个底图，左键单击底图选项卡以添加底项符。
右键单击底图并选择复制底图数据。将序列粘贴到文本编辑程序中。将悬伸序列添加到前进和反向引导寡头，以方便克隆。
将核苷酸序列 ATTTG 添加到前进导序底转三的五个底端，并将 G 添加到前进导轨底转三的三个底端。最后，在核苷酸序列AAAAC到反向导序底图三的五个底端，并在购买前将C添加到反向导序底图三的三个底端。染料测试念珠子优化的cas9表达向量，在1.5毫升管中添加pv1524、10x缓冲液、bs9b1和水到50微升，并在55摄氏度下孵育20分钟。
将消化混合物冷却至室温，在 2348 倍 G 下旋转 30 秒，使冷凝到管底。要磷酸酶治疗消化的骨干，在消化混合物中加入一微升的小牛肠磷酸酶。在37摄氏度前孵育反应一小时。
现在，磷酸盐和退火前导导底片三和反向导导底片三，将它们与10x T4利加塞缓冲液，T4多核苷酸激酶，和水在PCR管中结合。将10x T4利加塞缓冲液、T4多核苷酸激酶和分子生物学级水加入第二个PCR管作为负对。在37摄氏度的热循环器中孵育反应混合物30分钟，然后在95摄氏度下孵育5分钟。
将混合物在最慢的斜坡速率冷却至16摄氏度，使寡头退火。然后在4摄氏度下孵育退火的寡性混合物。现在将退火的寡头放入消化的 PV1524 中。
在第一个PCR管中，加入10x T4利加塞缓冲液、t4 DNA Ligase、退火寡糖混合物、消化CIP处理纯化质粒和水到10微升总体积。同样，使用负控制混合物而不是退火的寡分混合物准备第二个 PCR 管。在16摄氏度的热循环器中孵育两根管子30分钟，然后在65摄氏度下孵育10分钟，最后冷却至25摄氏度。
结扎后，将结扎混合物转化为化学上称职的细胞，然后按照文本协议中所述对质粒进行纯化和测序。要设计修复模板，请通过左键单击基因序列中插入停止胶合体，并添加编码停止胶合物并限制消化位点的核苷酸。左键单击将发生突变的下游 10 个基座，并将光标 60 基在上游拖动。
左舔底像标签添加底像。这将添加将修复模板转发三。然后左键单击将发生突变的上游 10 个碱基，并将光标 60 基在下游拖动。
左键单击底图选项卡以添加底图。这将添加修复模板反向三。要生成修复模板，请将修复模板向前底材、修复模板反向底材、脱氧核苷酸三磷酸盐、缓冲液、TACH 聚合酶和水添加到四个 PCR 管中。
现在，通过运行 20 到 30 轮 PCR 来执行底流扩展。要消化正确克隆的质粒，在1.5毫升管中加入质粒、10倍缓冲液、牛血清白蛋白、KPN 1、SAC 1和水到40微升总体积。一夜之间在37摄氏度下孵育。
同时，在25摄氏度的尿素补充YPD的C.albicansSC5314，野生型原生，生长一个过夜文化。在 600 纳米或小于 6 的 OD 600 下将培养成光密度。每个转化的5个OD 600单位细胞，以2348倍G的速度旋转5分钟，然后悬浮在100微升TE/醋酸锂微升中。
现在，到1.5毫升管和顺序，加入重新悬浮的细胞，煮沸和快速冷却的鲑鱼精子DNA，血浆消化，纯化修复模板，和板缓冲液。以相同的方式准备负对，但以等于转化DNA的体积替代水。孵育一夜后，加热将细胞放入44摄氏度的水浴中25分钟。
在台式离心机中旋转 2348 次 G，旋转五分钟，然后取出板混合物上一代。通过添加一毫升的乌里丁补充YPD并再次离心洗一次。在将 0.1 毫升的 Uridine 补充 YPD 中细胞悬浮后，在 25 摄氏度的滚筒或摇床上孵育悬浮液。
第二天，在Uridine补充YPD上的细胞与200微克每毫升的努尔西诺他林。殖民地将在两到五天内出现，并且应该像文本协议中描述的单一殖民地一样条纹。要执行殖民地 PCR，请设计一个正向检查底像，大约 200 个基对向上引入的限制站点流，以及一个反向底像约 300 基对下游。
添加 0.3 微升的前检查底板、0.3 微升的反向检查底板、0.3 微升的热固性聚合酶、3 微升的 dNTP、3 微升的 XTAC 缓冲液和 23 微升的水到管中。然后使用P10移液器尖端将单个酵母菌群的0.25微升加入混合物中，并注意不要打扰啤酒。通过 PCR 放大 DNA 后，在凝胶上运行五微升 PCR，以确保放大成功，注意不要干扰管底的细胞碎片颗粒。
此处显示了CRISPR中筛选的C.Albicans基因组编辑的代表性结果。C.Albicans 使用针对 C.Albicans TPK2 的指南 RNA 和修复模板进行转换。EcoR1 限制消化站点并停止修复模板中的鳕鱼会破坏 PAM 站点，并方便筛选正确的突变体。
殖民地PCR后，限制消化迅速区分野生类型与编辑序列。在尝试此过程时，必须记住检查克隆到 PV1524 的指南 RNA 的多个副本。因为这将降低基因组编辑效率。
别忘了，C.Albicans 是 BL2 病原体，在执行此程序时，请始终穿着适当的实验室服装并遵循所有安全程序。
概述
本文介绍了一种利用CRISPR技术对白色念珠菌进行高效基因组工程的协议。该方法允许进行精确的基因修饰，这对于研究该生物的发病机制和治疗开发至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 微生物学
- 生物技术
背景
- 白色念珠菌是一种重要的真菌病原体。
- 了解其基因组对于开发新的治疗方法至关重要。
- 传统的基因组编辑方法比CRISPR效率低。
- 本研究旨在增强C. albicans的基因组编辑技术。
研究目的
- 提供C. albicans基因组编辑的详细协议。
- 展示CRISPR相对于经典方法的优势。
- 促进各种基因修饰的引入。
使用的方法
- 引导RNA序列的识别。
- Cas9表达载体的制备。
- 用编辑过的质粒转化C. albicans细胞。
- 用于验证基因修饰的菌落PCR。
主要结果
- 成功引入点突变、插入和缺失。
- 展示了CRISPR在修改C. albicans基因组方面的效率。
- 为未来的基因研究提供了一种可靠的方法。
- 突出了治疗进展的潜力。
结论
- CRISPR协议显著提高了基因组编辑效率。
- 该方法可以增强我们对真菌发病机制的理解。
- 未来的研究可以在这些发现基础上开发新的治疗方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans enables rapid, precise genetic manipulation of a key human fungal pathogen, supporting target validation and mechanistic de-risking in antifungal discovery. This capability accelerates the interrogation of gene function and pathogenicity, directly impacting early-stage therapeutic hypothesis testing and portfolio triage. Efficient editing in diploid and gene family contexts enhances predictive confidence for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate genes implicated in fungal virulence or drug resistance.
- Supports mechanistic de-risking by allowing targeted disruption or modification of specific loci.
- Facilitates parallel editing of gene families to clarify redundancy and essentiality in disease pathways.
- Improves predictive confidence for target selection by enabling allele-specific and multi-locus edits.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant strains for downstream phenotypic screening and compound evaluation.
- Standardizes genetic backgrounds to improve assay reproducibility and quantitative output reliability.
- Enables rapid cycling of marker removal and re-editing for iterative assay optimization.
- Supports scalable preparation of isogenic panels for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered strains with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from genetic hypothesis to preclinical validation in infection models.
- Reduces biological risk by enabling precise modeling of clinically relevant mutations.
- Facilitates cross-species adaptation for comparative pathogenicity studies when supported by conserved sequences.
Pipeline & Workflow Integration
This CRISPR editing workflow integrates at the early discovery and target validation stages, extending through assay development and into translational research for antifungal R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene disruption and pathway mapping in C. albicans.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined strains for robust assay development and screening campaigns.
- Analytics: Enables quantitative assessment of editing efficiency and genotype-phenotype relationships via PCR and restriction analysis.
- Translational Research: Bridges genetic findings to preclinical infection models and biomarker alignment when relevant.
- Enterprise Reuse: Provides a modular, marker-removable system adaptable to other fungal species and iterative editing cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines genome editing with standardized, efficient protocols and marker recycling.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in antifungal portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, fungal genetics, and CRISPR design.
- Needs access to PCR, electrophoresis, and sequencing infrastructure for verification.
- Demands rigorous cross-team standardization of guide and repair template design.
- Adaptation to other fungal species depends on sequence conservation and transformation efficiency.
- Editing efficiency may be reduced by multiple guide copies or allele-specific SNPs, requiring careful design and validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Identification and Cloning of Guide RNA Sequence
4:28
Designing and Generation of Repair Template
5:33
Transformation of C. albicans with Repair Template and Plasmid
7:47
Colony PCR
8:52
Results: Evaluation of Successful Genome Editing in C. albicans
9:27
Conclusion
