Name: 线虫模型中气单胞菌感染的毒力及发病机制评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 了解利用秀丽隐杆线虫模型评估气单胞菌毒力及致病机制的方法。该技术可比较不同菌株毒性差异，为研究宿主-病原体相互作用提供可靠模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢中国台湾的 C. elegans 核心设施，以及国立成功大学医院诊断微生物学与抗菌药物耐药性实验室提供 Aeromonas 分离株。同时感谢线虫遗传中心（CGC）和 WormBase。我们还感谢 Savana Moore 对稿件的编辑工作。
本研究部分得到了中国台湾科技部（MOST 105-2628-B-006-017-MY3）和国立成功大学医院（NCKUH-10705001）对 P.L. Chen 的资助。

1. 培养基的制备
注意：溶液配制方法见表1。
<ol>
	<li>配制 M9 培养基12：将 1.5 g KH2PO4、5.66 g Na2HPO4 和 2.5 g NaCl 溶解于 500 mL 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待冷却至室温后，首次使用前加入 0.5 mL 1 M MgSO4。</li>
	<li>配制线虫生长培养基（NGM）12：将 3 g NaCl、2.5 g 细菌蛋白胨和 20 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待其在水浴中冷却至 55 °C 后，加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 5% 乙醇胆固醇溶液和 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。</li>
	<li>每 6 cm 培养皿中倒入约 5 mL NGM。避免平板表面产生气泡。将平板在室温下放置 1 夜，包装后于 4 °C 保存。使用前恢复至室温。</li>
	<li>配制富集型 NGM（ENGM）：将 3 g NaCl、5 g 细菌蛋白胨、1 g 酵母提取物和 30 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待其在水浴中冷却至 55 °C 后，加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 5% 乙醇胆固醇溶液和 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。</li>
	<li>每 9 cm 培养皿中倒入约 10 mL ENGM。避免平板表面产生气泡。将平板在室温下放置 1 夜，包装后于 4 °C 保存。使用前恢复至室温。</li>
	<li>配制 S 培养基12：使用前将 40 mL S 基础液、0.4 mL 1 M 柠檬酸钾、0.4 mL 微量金属溶液、0.12 mL 1 M CaCl2、0.12 mL 1 M MgSO4、40 µL 5% 乙醇胆固醇溶液和 1 mL 8 mM 氟脱氧尿苷（FudR）混合均匀。</li>
</ol>
2. C. elegans 的同步化6,9,12
<ol>
	<li>在15 mL离心管中，用10 mL无菌去离子水清洗约2,000条处于怀卵成虫阶段的线虫。用离心法洗涤3次以去除细菌，每次均将线虫保留在管底。</li>
	<li>将样品在500 x g下离心1分钟 g 用以沉淀线虫。移除上清液，将线虫保留在3.5 mL去离子水中。</li>
	<li>加入1 mL次氯酸钠（10–15%）和0.5 mL 5 M KOH至离心管中，振荡混匀 &#60;6 分钟以裂解线虫虫体。</li>
	<li>卵从线虫中释放后，加入10 mL去离子水以终止裂解。在1,200 x g下离心1分钟 g 收集卵子并尽可能吸除上清液。用15 mL M9培养基至少洗涤3次。 
	注：M9 培养基的成分见步骤 1.1。</li>
	<li>将卵置于1 mL M9培养基中，转移至3.5 cm培养皿，在20 °C下孵育过夜（约12–18 h）。 
	注意：孵育后，卵将孵化成蠕虫幼虫，称为第一阶段幼虫（L1）。</li>
	<li>用移液器吸取10 µL含L1期幼虫的M9培养基。计数线虫数量，并计算M9培养基中L1期幼虫的浓度。</li>
	<li>用移液器将最多10,000条经孵化的L1期线虫接种至直径9 cm的ENGM平板上，平板表面已涂布 大肠杆菌 OP50
	<ol>
		<li>在此步骤中，取0.5 mL过夜培养的 E. coli 在9 cm ENGM平板上使用含Luria-Bertani (LB) 肉汤的OP50。将平板置于37 °C培养16–18 h 
		注意：为避免污染，涂布步骤应在超净工作台中进行。</li>
		<li>冷却至室温后再接种L1幼虫。每个培养皿中接种的经孵化的L1期幼虫数量不得超过10,000条&#160;含ENGM平板 E. coli OP50</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在20 °C下孵育线虫44小时，或直至其生长至L4期th L4幼虫阶段 
	注意： 参见步骤1.3了解ENGM培养基的成分。在L4阶段，线虫体侧中部可见一个新月形的白色斑点。</li>
	<li>在以下实验中使用同步化的L4期线虫。使用野生型N2线虫 秀丽隐杆线虫 生存实验与 Aeromonas dhakensis 以及 秀丽隐杆线虫 液体毒性检测实验 Aeromonas dhakensis. 使用 RW1596 蚯蚓（myo-3(st386);stEx30[myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]）在 秀丽隐杆线虫 肌肉坏死检测 Aeromonas dhakensis.</li>
</ol>
3. C. elegans 与气单胞菌（Aeromonas）共培养的生存分析实验6,9
<ol>
	<li>在将L1幼虫接种到ENGM平板上的当天 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50 并分别在 37 °C 下用 2 mL LB 肉汤培养 16 小时。 
	注意： 为避免污染，此步骤应在超净工作台中进行。本实验使用了以下菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完成全序列测定的致病性临床&#160;A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学附属医院的代表性临床分离株。</li>
	<li>测量OD600 细菌肉汤的吸光度测定及调整至OD600 = 2.0，使用LB肉汤。</li>
	<li>在每个6 cm NGM平板上分别点样并涂布30 µL细菌培养液。将平板于室温下培养过夜。 
	注意： NGM 培养基的配方见步骤 1.2。</li>
	<li>在L1幼虫发育至L4阶段的当天，随机挑选并转移50条线虫至含有四种不同条件之一的NGM平板 气单胞菌属 菌株或 大肠杆菌 OP50</li>
	<li>在20 °C下孵育NGM平板，直至实验结束。</li>
	<li>将所有存活的线虫转移至新制备的含细菌NGM平板上，每天统计活虫、死虫和感测虫的数量，直至最后一条线虫死亡。 
	注意： 每天将线虫转移至新制备的NGM平板，以维持感染状态，即使使用无菌线虫（例如glp-4，或使用 FudR。</li>
	<li>根据每日数据计算结果绘制生存曲线。</li>
</ol>
4. 秀丽隐杆线虫 液体毒性检测实验 气单胞菌属7
注意：为避免污染，所有步骤应在层流罩内进行。
<ol>
	<li>接种L1幼虫至ENGM平板后的第二天 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株和 E. coli OP50，并分别在37 °C下用5 mL LB肉汤培养16 h。 
	注意：在本实验方案中，使用了以下细菌菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完全测序的致病性临床 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学附属医院的代表性临床分离株。</li>
	<li>测量OD600 细菌肉汤的吸光度。</li>
	<li>将细菌培养液在 3,500 x g 15分钟以去除LB肉汤。重悬细菌，并将菌液调整至OD600 3.0，加入S培养基。向96孔板的至少8个孔中，每孔加入195 µL含S培养基的细菌培养液。 
	注意： 参见步骤1.6中S培养基的成分。</li>
	<li>用ENGM平板冲洗L4期蠕虫 E. coli 在96孔板的每个孔中加入5 µL线虫溶液，调整线虫溶液浓度为每µL含5条线虫，确保每孔约有25条线虫。</li>
	<li>将96孔板置于摇床中，在25 °C、200 rpm条件下孵育。</li>
	<li>在24、48和72小时后分别计数活线虫和死线虫的数量。按以下公式计算每个孔的存活率：（活线虫数 / 总线虫数）× 100%。</li>
	<li>使用每日数据计算结果绘制散点图。</li>
</ol>
5. 秀丽隐杆线虫 肌肉坏死检测 气单胞菌属6
注意： 为避免污染，这些步骤应在层流罩中进行。
<ol>
	<li>L1幼虫接种至含有ENGM的培养皿当天 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株和 E. coli OP50 及各 2 mL LB 肉汤，37 °C 培养 16 小时。 
	&#8203;注意： 此处使用了以下细菌菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完全测序的致病性临床&#160;A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾国立成功大学医院的代表性临床分离株。</li>
	<li>测量 OD600 细菌肉汤的吸光度，并将细菌肉汤调整至OD600 用LB肉汤稀释至2.0。取30 µL菌液点种并涂布于6 cm NGM平板上。将平板于室温下培养过夜。</li>
	<li>在L1幼虫发育至L4阶段的当天，将50条线虫分别转移至含有四种不同条件的NGM平板上 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50。将NGM平板在20 °C培养。每隔24小时将线虫转移至新制备的含细菌NGM平板上。</li>
	<li>使用荧光显微镜拍摄肌肉图像。
	<ol>
		<li>随机选取10条线虫置于载玻片上含M9培养基的2%琼脂糖凝胶中。在成像前，加入2 µL含1%叠氮化钠的M9培养基溶液处理线虫，使其在琼脂糖上麻痹，处理时间少于5分钟。</li>
		<li>放置盖玻片，使用配备电荷耦合器件相机的荧光显微镜，通过绿色荧光蛋白（GFP）滤光片采集肌肉图像。分别在L4阶段后24、48和72小时采集肌肉图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用图像处理软件进行图像分析和图件制作。 
	注意： 评分的定义及肌肉损伤程度如图所示 图3，评分标准如下：缺失肌纤维计3分；肌纤维断裂或破裂计2分；肌纤维弯曲计1分；健康肌纤维计0分。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>所有实验至少独立重复三次。</li>
	<li>采用Kaplan-Meier法评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）的生存实验，并使用log-rank检验分析生存差异。统计学显著性水平设定为0.05。</li>
	<li>采用Student t检验分析两组间秀丽隐杆线虫（C. elegans）液体毒性实验的统计学结果。对于单个自变量下三个或更多数值间的差异，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。统计学显著性水平设定为0.05。</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li>
<li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila%2C+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft+tissue+infection+caused+by+Aeromonas+species+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
<li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li>
<li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

C. elegans 是一种以细菌为食的线虫，其在进化过程中自然摄取细菌作为食物，并发展出复杂的细菌先天免疫系统。维持和支撑这种免疫系统的两个主要器官是表皮和肠道9,13。C. elegans 的表皮和肌肉带在结构上类似于哺乳动物和人类的软组织6。由于这些特性，C. elegans 可作为研究气单胞菌（Aeromonas）感染发病机制的模式生物。
本文介绍了三种用于研究Aeromonas感染C. elegans的方法，这些方法代表了4种Aeromonas物种之间不同的毒性特征，并与临床观察结果相关联7。这些简便的方法可区分不同Aeromonas物种的毒性程度。利用这些方法，研究人员能够研究不同Aeromonas物...

临床研究表明，人类病原体Aeromonas可引起胃肠炎、伤口感染、败血症以及尿路感染1,2。大多数相关人类疾病已被报道与四种细菌物种有关：Aeromonas dhakensis、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii和Aeromonas caviae2,3,4,5。在Aeromonas引起的感染性疾病中，软组织感染可导致人类严重的发病率和死亡率。其中，肌肉坏死是最严重的软组织感染形式6。通过观察感染后秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的存活情况及肌肉坏死程度，是推测Aeromonas毒力的一种便捷方法。
科学家们已开发出多种模式生物用于研究细菌感染。在以往的研究中，小鼠、斑马鱼和线虫被用作动物模型，以研究病原菌的致病机制和毒力 气单胞菌属6,7,8每种动物模型都有其优势和应用。模式生物， 秀丽隐杆线虫是一种以细菌为食的食细菌线虫，可自然摄取细菌作为食物。&#160;秀丽隐杆线虫在进化过程中，已形成针对细菌感染的复杂先天免疫系统。在细菌感染的压力下，&#160;秀丽隐杆线虫 已被证实是研究细菌致病机制的优良感染模型 气单胞菌属6,7,9 以及其他病原体，如真菌10 肠出血性 大肠杆菌 O157:H711然而，目前仍没有专注于使用该方法的出版物 秀丽隐杆线虫 作为研究毒力的模型 气单胞菌属.
在此，我们介绍三种不同的实验方法来研究 气单胞菌属 使用感染 秀丽隐杆线虫 作为动物模型：生存率、液体毒性和肌肉坏死的检测方法。这些方法可便捷地用于评估不同种类之间及同一种类内部的毒性差异 气单胞菌属 物种并加深对发病机制的理解 气单胞菌属.

<table><tbody><tr><td>摇床培养箱</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021519455</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>琼脂平板制备</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>液体检测</td></tr><tr><td>细菌蛋白胨</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>柠檬酸&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钾&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FudR&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA二钠</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>221279</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>204986</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜系统</td><td>尼康&amp;nbsp;</td><td>Eclipase Ti 倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>显微镜成像</td></tr><tr><td>科学级CCD相机</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>Retiga-2000R Fast 1394&amp;nbsp;</td><td>显微镜成像</td></tr></tbody></table>

评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在a中 秀丽隐杆线虫 模型

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

人类病原菌Aeromonas在临床上已被证实可引起胃肠炎、伤口感染、败血症以及尿路感染。大多数人类疾病被报道与四种细菌物种相关：Aeromonas dhakensis、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii和Aeromonas caviae。模式生物Caenorhabditis elegans是一种以细菌为食的线虫，为研究Aeromonas的细菌致病机制提供了优良的感染模型。本文介绍了利用C. elegans模型研究Aeromonas感染的三种不同实验方法，包括生存率测定、液体毒性试验和肌肉坏死检测。这三种方法在测定Aeromonas毒力方面的结果具有一致性。A. dhakensis被证实是引起临床感染的四种主要Aeromonas物种中毒性最强的菌种。这些方法为评估Aeromonas种间及种内毒力提供了便捷手段，并有助于加深我们对Aeromonas感染致病机制的理解。

通过遵循上述方案，可轻松区分四种毒性之间的差异 气单胞菌属 菌株。存活率测定 秀丽隐杆线虫 如图所示 图1. 存活率 秀丽隐杆线虫 感染了 气单胞菌属 物种，按从高到低顺序排列如下： A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, 和 A. dhakensis. 尽管在不同种类之间以及同一种类内部的毒性方面存在差异 气单胞菌属 物种，存活率 秀丽隐杆线虫平均而言，在感染的蠕虫中表现出最高的死亡率 A. dhakensis毒力 A. hydrophila 差于 A. dhakensis (p &lt; 0.01). 与之相比 A. dhakensis 和 A. hydrophila,两种减毒的毒力 A. veronii 和...

本文介绍了三种不同的实验方法，用于研究Aeromonas对C. elegans的感染。利用这些简便的方法，可轻松评估不同Aeromonas物种之间及同一物种内部的毒性差异。

评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在A中 秀丽隐杆线虫 模型

人类病原菌气单胞菌（Aeromonas）在临床上已被证实可引起胃肠炎、伤口感染、败血症和尿路感染。大多数人类感染……

该方法有助于解答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如细菌感染的致病性和毒力。该技术的主要优势在于，我们能够评估气单胞菌属内及不同气单胞菌种之间的毒性，从而增进对气单胞菌感染发病机制的理解。首先，用无菌去离子水清洗约 2,000 条带有卵的成虫线虫。重复洗涤三次，每次均使蠕虫保持在试管底部。离心后弃去上清液，将蠕虫保留于3.5毫升去离子水中。向试管中加入1毫升次氯酸钠和0.5毫升氢氧化钾。然后振荡试管6分钟，以裂解线虫虫体。待卵释放后，加入10毫升去离子水以终止裂解反应。随后离心试管，使卵沉淀，并尽可能吸除上清液。用15毫升M9培养基至少清洗卵三次。将卵转移至3.5厘米培养皿中，在20摄氏度下孵育一晚。之后从平板中取出10微升L1期线虫和M9培养基。计数线虫并获得M9培养基中L1线虫的浓度。用移液器取0.5毫升E.coli OP50 LB肉汤，涂布于ENGM平板上。然后将平板在37摄氏度下孵育16至18小时。将ENGM冷却至室温。然后将已孵育的L1线虫接种到含有大肠杆菌OP50的ENGM平板上。在20摄氏度下孵育线虫，直至其发育至L4阶段。首先，分别挑取四种气单胞菌（Aeromonas）菌株的单个菌落，并根据文本方案进行培养。然后测定细菌培养液在600 nm处的OD吸光度，并调整至吸光度等于2.0。接着，将每种菌株的30微升培养液点种并涂布于NGM平板上。随机选取之前制备的L4期线虫，并将其转移至含有气单胞菌株的NGM平板上。随后将平板在20摄氏度下培养，直至实验结束。每天将所有存活的线虫转移至新的含细菌NGM平板上。每天统计存活、死亡和传感器线虫的数量，直至最后一条线虫死亡。在培养气单胞菌菌株并按前述方法测定其吸光度后，将细菌培养液在 3,500 ×g 下离心 15 分钟。用 S 培养基调整细菌培养液的浓度。向96孔板的八个孔中每孔加入195微升S培养基中的细菌培养液。用M9培养基将线虫从ENGM平板上冲洗下来。然后将线虫悬液的浓度调整为每微升5只线虫。向96孔板的每个孔中加入5 µL线虫溶液。将该板置于摇床中孵育，并在24、48和72小时时计数活线虫的数量。在培养气单胞菌菌株并根据文本方案调整吸光度后，将细菌培养液点样并涂布于NGM平板上。此后，将50条L4期线虫转移至每块NGM平板上。每隔24小时将线虫转移至新的NGM平板。随机选取10条线虫，将其转移至载玻片上含有M9培养基的2%琼脂糖凝胶中。最后将盖玻片置于凝胶上，并使用配备相机的荧光显微镜，通过绿色荧光蛋白滤光片捕获肌肉图像。在本实验方案中，评估了四种气单胞菌株的毒性。感染气单胞菌属的秀丽隐杆线虫（C.elegans）在使用豚鼠气单胞菌（A.caviae）的实验中存活率最高，而在使用达氏气单胞菌（A.dhakensis）的实验中存活率最低。在液体毒性实验中，秀丽隐杆线虫（C.elegans）感染达氏弧菌（A.dhakensis）或嗜水气单胞菌（A.hydrophilia）后，其存活率显著下降。在肌肉坏死实验中，不同气单胞菌种类引起的肌肉损伤程度存在差异。其中，豚鼠气单胞菌（A.caviae）造成的肌肉损伤最轻，而达氏弧菌（A.dhakensis）引起的肌肉损伤最为严重。本视频中描述的方法为区分气单胞菌属内及属间毒力多样性提供了一种便捷的方式。此外，该方法也是研究病原体与宿主相互作用的可靠模型。

evaluating-virulence-pathogenesis-aeromonas-infection-caenorhabditis

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

线虫模型中气单胞菌感染的毒力及发病机制评价

来源：Anderson, Q. L., 等。一种高通量、高内涵、基于液体的C. elegans病理系统。J. Vis. Exp. (2018)该视频展示了一种基于液体的检测方法，其中将基因改造的C.

评估致病菌诱导的 C. elegans 幼虫死亡率

来源： Chen, Y., 等评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在A中 秀丽隐杆线虫 模型。 视频实验杂志 (2018)本视频展示了一种利用秀丽隐杆线虫（C.

建模 气单胞菌属 发病机制 C. elegans 使用存活率测定实验

来源：Chen, Y., et al. 利用秀丽隐杆线虫模型评估气单胞菌感染的毒力与致病机制。J. Vis. Exp. (2018)。本视频演示了利用嗜水气单胞菌（Aeromonas）对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行的液体毒性测定实验，该方法通过测量线虫在营养受限的液体环境中的存活情况来评估细菌的毒力。该实验可根据毒素对C.

使用C. elegans液体毒性检测法评估细菌毒力

来源： Chen, Y. 等。 评估气单胞菌感染在一种动物模型中的毒力与致病机制 秀丽隐杆线虫 模型。 视频实验杂志 (2018)本视频展示了利用致病性气单胞菌（Aeromonas）菌株在秀丽隐杆线虫（C. elegans，Caenorhabditis...

肌肉坏死检测 秀丽隐杆线虫 由致病性诱导 气单胞菌属 菌株

卵在虫体内（EIW）检测是一种用于量化产卵行为的有效方法。产卵行为的改变可能是模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

使用产卵滞留实验测量细菌对C. Elegans行为的影响

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本文介绍一种可灵活应用的全生物体高内涵筛选工具，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用，并适用于药物发现。...

一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

Caenorhabditis elegans 是研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素的有力模型。我们提出了一种高通量分析流程，可在单个动物水平上同时表征肠道微生物组定植情况以及 C. elegans...

秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

了解利用秀丽隐杆线虫模型评估气单胞菌毒力及致病机制的方法。该技术可比较不同菌株毒性差异，为研究宿主-病原体相互作用提供可靠模型。

评估毒力与致病机制气单胞菌属感染在A中秀丽隐杆线虫模型

探索更多视频

评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在A中 秀丽隐杆线虫 模型

探索更多视频

评估毒力与致病机制气单胞菌属感染在A中秀丽隐杆线虫模型