Name: 基因治疗诱导聚化涂层保护 dna 折纸纳米结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解利用壳聚糖和线性聚乙烯亚胺涂层保护DNA折纸纳米结构的方法，该技术可防止酶降解并增强细胞摄取，为基因递送和靶向治疗应用提供新途径。

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本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为686647。透射电子显微镜（TEM）图像由维也纳生物中心核心设施有限公司（VBCF）电子显微镜平台的Morgagni设备在80 kV条件下采集。我们感谢Tadija Kekic在图形设计方面的协助，以及Elisa De LIano在设计线框纳米结构方面的工作。

1. 准备聚阳离子储备液
<ol>
	<li>LPEI 储存液
	<ol>
		<li>将 10 mg LPEI 加入含有 &lt;10 mL H2O 的玻璃烧杯中。</li>
		<li>为完全溶解 LPEI，逐滴加入 HCl（32%），直至 pH 达到 2.0。</li>
		<li>通过加入 NaOH（10 M）将 pH 调整至 7.0。</li>
		<li>加水定容，得到终浓度为 1 mg/mL 的溶液。</li>
		<li>将 LPEI 储存液经 0.22 µm 滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>壳聚糖储存液
	<ol>
		<li>将 16.6 mg 壳聚糖低聚物乳酸盐（Mw ~ 5 kDa，60% 低聚物组成，脱乙酰度 90%）溶于 1 mL 乙酸（10%）水溶液中，配制成浓度为 10 mg/mL 的储存液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. DNA折纸纳米结构的纯化
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，将100 µL DNA折纸样品（溶于含18 mM MgCl2 的5 mM Tris、1 mM EDTA、5 mM NaCl缓冲液（记为TB））与等体积的补充22 mM MgCl2 的TB缓冲液（100 µL）混合。</li>
	<li>加入200 µL纯化缓冲液（15% (w/v) PEG 8,000、5 mM Tris、1 mM EDTA和505 mM NaCl），通过轻轻翻转离心管进行温和混匀。</li>
	<li>在室温（r.t.）下以16,000 × g离心25分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，并将沉淀重悬于补充16 mM MgCl2 的TB缓冲液中。上清液和沉淀分别含有过量的短链DNA以及沉淀的DNA折纸结构。</li>
	<li>将样品在恒温混匀仪中于室温（r.t.）以650 rpm孵育一天，以确保DNA折纸结构完全重悬。</li>
</ol>
3. 琼脂糖凝胶电泳（AGE）
<ol>
	<li>取1.6 g琼脂糖和80 mL 0.5x TAE缓冲液（20 mM Tris，0.5 mM EDTA，10 mM乙酸，pH 8）加入玻璃烧杯中，制备2%琼脂糖凝胶。微波加热5分钟。将烧杯内容物在水浴中轻轻摇动1分钟。加入352 µL MgCl2（2.5 M），使凝胶中MgCl2终浓度为11 mM。用10 µL DNA凝胶染料对凝胶进行预染色。</li>
	<li>将凝胶溶液倒入干燥的凝胶模具中，插入琼脂糖凝胶电泳梳。室温下静置15–30分钟，使溶液凝固。</li>
	<li>在电泳缓冲液（0.5x TAE缓冲液）中添加11 mM MgCl2。</li>
	<li>取10–20 µL样品与等体积20%的6x上样缓冲液（30% (v/v)甘油，0.25% (w/v)溴酚蓝，0.25% (w/v)二甲苯青FF）混合后，上样至琼脂糖凝胶孔中。</li>
	<li>在室温下以70 V电压电泳2.5–3小时。</li>
	<li>使用紫外扫描仪观察凝胶结果。</li>
</ol>
4. 负染透射电子显微镜（nsTEM）
<ol>
	<li>将稀释后的纳米结构或聚集体溶液5 µL滴加到经辉光放电处理的碳支持膜铜网（Cu400透射电镜载网）上，吸附约1分钟。</li>
	<li>用滤纸从载网边缘吸去多余液体。</li>
	<li>滴加5 µL的2%醋酸铀酰水溶液，静置1分钟。</li>
	<li>用滤纸边缘彻底吸除载网边缘的多余液体。</li>
	<li>待载网完全干燥后，再将其装入透射电子显微镜中进行观察。</li>
</ol>
5. 聚合物复合物的形成
注意：制备N/P比为0.01-8的DNA折纸与壳聚糖多聚复合物的示例说明。
<ol>
	<li>使用公式-1（表1）计算每个多聚阳离子所含的胺基数。</li>
	<li>使用紫外分光光度计在260 nm处测定纯化后DNA折纸结构的浓度。以2 µL TB缓冲液作为空白对照校准仪器。使用公式-2计算“磷酸根的纳摩尔数（nmol）”。</li>
	<li>制备含有1 nmol磷酸根的15 µL DNA折纸结构溶液。</li>
	<li>使用公式-3计算在N/P比为0.01–8时制备聚集体所需的壳聚糖体积。例如，若要制备N/P为8的聚集体，需要1.8 µL的壳聚糖溶液（0.8 mg/mL）（N/P = 8，磷酸根为1 nmol，壳聚糖分子量为5,000 g/mol，壳聚糖储备液浓度为0.8 mg/mL，每个壳聚糖分子含28个胺基）。将1.8 µL壳聚糖（0.8 mg/mL）与13.2 µL TB缓冲液混合。然后将15 µL上述壳聚糖溶液（0.8 mg/mL）加入到15 µL来自步骤5.3的DNA折纸溶液中，得到N/P为8的DNA折纸-壳聚糖聚集体。该聚集体可自发形成。</li>
	<li>重复步骤5.4，制备不同N/P比的聚集体。</li>
	<li>按照步骤3所述进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）分析（图1A），以未结合的DNA折纸作为对照。</li>
	<li>按照步骤4所述对聚集体进行成像（图2）。 
	 
	公式-1） 每个多聚阳离子的胺基数 
	<img alt="分子量比方程，聚电解质化学，教学公式，生化分析。" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程1"> 
	 
	公式-2） 磷酸根的摩尔数 
	=<img alt="DNA折纸浓度计算方程；基于分子量、ng/µL和µL体积进行计算。" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程2"> 
	 
	公式-3） 多聚阳离子的体积（µL） 
	=<img alt="聚合物分析公式，N/P比计算，用于磷酸根与胺基分析的方程。" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程3"></li>
</ol>
6. 使用硫酸葡聚糖进行脱囊
<ol>
	<li>使用公式-4（表2）计算每分子硫酸葡聚糖所含的硫酸根基团数量。</li>
	<li>使用公式-5计算在预设的A/P比下，用于解离多聚复合物（polyplex）所需的硫酸葡聚糖体积。A/P电荷比是指聚阴离子（A）的硫酸根基团与DNA折纸结构（DNA origami）的磷酸根基团（P）之间的摩尔比。为实现多聚复合物的有效解离，需使用过量的硫酸葡聚糖（例如 500–1,000）。例如，在A/P比为1,000的条件下解离第5节中制备的多聚复合物（含1 nmol磷酸根基团），需要3.6 µL的40 kDa硫酸葡聚糖溶液（50 mg/mL）（A/P比为1,000，磷酸根基团为1 nmol，硫酸葡聚糖分子量为40,000 g/mol，储备液浓度为50 mg/mL，硫酸根基团数量为220）。向5.4步所得的多聚复合物中加入3.6 µL硫酸葡聚糖溶液（50 mg/mL），充分混匀。</li>
	<li>若使用壳聚糖多聚复合物，需加入NaOH以促进解离过程，使NaOH终浓度达到10 mM。对于LPEI多聚复合物，则跳过此步骤。</li>
	<li>按照第3步所述进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）（图1B），同时设置裸露的DNA折纸结构和多聚复合物作为对照。 
	 
	公式-4） 每个聚阴离子的硫酸根基团数量= 
	<img alt="显示聚合物化学分析中聚阴离子分子量计算的方程式。" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程4"> 
	 
	公式-5） 硫酸葡聚糖体积（µL） 
	=<img alt="涉及硫酸葡聚糖浓度和分子量的磷酸根基团定量公式。" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程5"></li>
</ol>
7. 对镁耗竭的稳定性
<ol>
	<li>使用超滤柱（截留分子量约 3 kDa），用 4 次、每次 600 µL 的无镁缓冲液（5 mM Tris、1 mM EDTA 和 30 mM NaCl）洗涤 20 µL 的 DNA 折纸结构或相应的多聚复合物（包含 2 nmol 磷酸根）。每次洗涤在室温下以 14,000 × g 离心 3–5 分钟。</li>
	<li>收集剩余溶液（80 µL），在恒温混匀仪中于 37 °C、650 rpm 条件下孵育一天。</li>
	<li>若测试 LPEI 多聚复合物，加入 2.5 µL 的 MgCl2（500 mM），使终浓度为 16 mM MgCl2。随后加入 7 µL 硫酸葡聚糖-40 kDa（50 mg/mL）（相当于 A/P 1,000），以解开核心 DNA 纳米结构（脱壳，见步骤 6）。 
	注意：若使用壳聚糖多聚复合物或裸 DNA 折纸结构，则跳过此步骤。</li>
	<li>按照步骤 3 所述进行纳秒级透射电子显微镜（nsTEM）成像（图 2）。</li>
</ol>
8. 裸露DNA折纸纳米结构的DNase I滴定实验
<ol>
	<li>在0.2 mL PCR管中，将3 µL含有1 nmol磷酸的裸DNA折纸结构与2 µL 10x DNase I缓冲液（100 mM Tris-HCl，25 mM MgCl2，5 mM CaCl2，pH 7.6）、1 µL MgCl2（250 mM）和12 µL水混合。加入2 µL DNase I（10x）。调整DNase I（10x）的储存浓度，使最终DNase I浓度为0.25–2 U/mL。</li>
	<li>将样品置于37 °C下孵育1–2小时，使用PCR仪进行温控。</li>
	<li>将样品浸入冰中，并加入2 µL 500 mM二硫苏糖醇（DTT）和2.5 µL EGTA（33 mM），以终止核酸酶活性。</li>
	<li>使用琼脂糖凝胶电泳（AGE）分析样品，方法如第3步所述。</li>
</ol>
9. 聚合物复合物对DNase I的稳定性
<ol>
	<li>在0.2 mL PCR管中，将4 µL多聚复合物（含1 nmol磷酸根，按不同N/P比制备）与1.5 µL DNase I缓冲液（10×）、8 µL TB以及1.5 µL DNase I（100 U/mL）混合。</li>
	<li>将样品在37 °C下于热循环仪中孵育24小时。</li>
	<li>加入2 µL蛋白酶K（20 mg/mL）以消化DNase I。在热循环仪中37 °C孵育30分钟。 
	注意：也可不采用酶消化法，而是通过加入1.5 µL DTT（500 mM）和2 µL EGTA（33 mM）进行DNase I的化学失活。</li>
	<li>加入3.6 µL硫酸葡聚糖-40 kDa（50 mg/mL）（相当于A/P 1,000），以解开核心DNA纳米结构。</li>
	<li>按步骤3所述进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）（图3A，图3C）。以新鲜DNA折纸结构作为对照，用于测量和比较凝胶上的条带强度。</li>
	<li>切下AGE凝胶中的条带，按照供应商提供的方案，使用挤压冷冻提取柱提取DNA折纸结构。</li>
	<li>按照步骤4所述进行负染透射电子显微镜（nsTEM）成像（图2）。</li>
</ol>
10. 对胎牛血清（FBS）的稳定性
<ol>
	<li>在0.2 mL PCR管中，将4 µL的裸DNA折纸结构或其相应的多聚复合物（包含1 nmol磷酸盐）与17 µL TB + 10% FBS混合。使用 freshly thawed FBS。</li>
	<li>将样品在37 ˚C的热循环仪中孵育24小时。</li>
	<li>将样品浸入冰浴中。</li>
	<li>若测试多聚复合物，通过加入3.6 µL葡聚糖硫酸酯-40 kDa（50 mg/mL）进行脱包封处理。若使用壳聚糖多聚复合物，还需加入NaOH（参见步骤6.3）。</li>
	<li>按照步骤3所述进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）。将新鲜的DNA折纸结构作为对照，用于测量和比较凝胶上的条带强度。</li>
	<li>切下AGE凝胶中的条带，并通过挤压冷冻提取柱回收DNA折纸结构。</li>
	<li>在0.2 mL PCR管中，向提取的DNA折纸溶液（20 µL）中加入2 µL蛋白酶K（20 mg/mL）。在热循环仪中37 °C孵育30分钟，以消化结合在纳米结构上的血清蛋白。</li>
	<li>使用超滤离心柱（MWCO ~ 100 kDa），用含16 mM MgCl2的TB缓冲液分5次、每次500 µL洗涤样品，以去除蛋白酶K（分子量 ~ 28.9 kDa）。每次洗涤在室温下以14,000 × g离心3–5分钟。</li>
	<li>按照步骤4所述进行负染透射电子显微镜（nsTEM）成像（图3）。 
	注意：步骤10.6中从凝胶提取的样品可直接用于nsTEM成像。然而，由于血清蛋白可能附着在DNA折纸纳米结构上，成像可能非常困难。因此，建议进行蛋白酶K处理（步骤10.7–10.9），以促进成像过程。</li>
</ol>
11. 多聚阳离子包被后辣根过氧化物酶功能化DNA折纸结构可寻址性的检测
<ol>
	<li>按照步骤2所述方法纯化自组装的生物素化纳米棒（Biotin-NR）。</li>
	<li>将200 µL纯化的Biotin-NR（36 nM，溶于16 mM添加物的TB缓冲液中）与200 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（540 nM，溶于TB缓冲液中）孵育。加入4.8 µL MgCl2（500 mM），使其终浓度为14 mM。在恒温混匀仪中，室温下以650 rpm转速孵育12小时。</li>
	<li>采用PEG纯化法（如步骤2所述）纯化HRP功能化的纳米棒（HRP-NR），以去除未结合的HRP酶。将沉淀的HRP-NR重悬于含有16 mM MgCl2的TB缓冲液中。</li>
	<li>将6.5 µL纯化的HRP-NR（36 nM）与6.5 µL不同浓度的多聚阳离子混合，制备N/P比为1、2、4、10和20的多聚复合物（使用公式3）。</li>
	<li>对非生物素化的DNA纳米棒（NR）重复步骤11.2–11.4。由于HRP酶可能非特异性地结合到DNA折纸结构上，因此将非生物素化的DNA折纸结构经HRP酶处理并进行PEG纯化（方法与Biotin-NR类似）作为实验中的对照组。</li>
	<li>将6.5 µL去离子水与6.5 µL不同浓度的多聚阳离子混合，对应设定N/P比为1、2、4、10和20。这些样品作为空白对照组。</li>
	<li>将步骤11.4–11.6中制备的溶液（12.5 µL）加入含有72.5 µL HEPES缓冲液（25 mM HEPES、20 mM KCl、200 mM NaCl、0.05% Triton X-100、1% DMSO，pH 7.4）的96孔板中，并充分混匀。</li>
	<li>加入10 µL 2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）（15 mM）。</li>
	<li>加入5 µL H2O2（12 mM），并通过上下吹打充分混匀。H2O2启动反应。</li>
	<li>使用多功能酶标仪在421 nm波长下连续测定4小时的吸光度（图4A）。</li>
</ol>
12. 聚阳离子包覆后检测血红素结合适配体（HBA）功能化DNA折纸结构的可寻址性
<ol>
	<li>按照步骤 2 所述纯化 HBA 功能化的纳米棒（HBA-NR）。将沉淀的 HBA-NR 重悬于含有 6 mM MgCl2 的 TB 缓冲液中（较高的盐浓度会导致 HBA-NR 聚集）。</li>
	<li>将 10 µL HBA-NR（40 nM）与 10 µL 不同浓度的多聚阳离子混合，制备 N/P 比分别为 1、2、10 和 20 的多聚复合物（polyplex）。</li>
	<li>将 10 µL 未修饰的纳米棒（naked-NR，40 nM）或蒸馏水与 10 µL 对应不同浓度的多聚阳离子混合，得到 N/P 比分别为 1、2、10 和 20 的对照样品。</li>
	<li>将步骤 12.2 和 12.3 中制备的 20 µL 溶液加入含有 60 µL HEPES 缓冲液（25 mM HEPES、20 mM KCl、200 mM NaCl、0.05% Triton X-100、1% DMSO，pH 7.4）的 96 孔板中，并充分混匀。至少设置一个空白样品，用 20 µL 水替代步骤 12.2 和 12.3 中的多聚复合物或多聚阳离子溶液。</li>
	<li>加入 5 µL 血红素（0.04 mM），随后加入 10 µL ATBS（15 mM）。将 96 孔板置于轨道摇床上振荡 5 分钟。</li>
	<li>加入 5 µL H2O2（12 mM），并通过移液器反复吹打充分混匀。</li>
	<li>使用多功能酶标仪在 30 分钟内测定 421 nm 处的吸光度（图 4B）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明本报告无任何利益冲突。

在DNA折纸自组装过程中，通常将连接链以相对于支架链5-10倍的过量比例加入。这些过量的连接链也会与多聚阳离子结合，在单体尺度上形成多聚复合物，且难以与DNA折纸多聚复合物分离。因此，多聚复合物形成的关键步骤是去除过量的连接链，并使用高度纯化的DNA折纸纳米结构。
已有其他方法被开发用于稳定DNA纳米结构，例如通过点击反应实现DNA链的环化26。由于该技术需要使用炔基和叠氮修饰的短链DNA来形成互锁的单链环，因此仅适用于稳定小型纳米结构（如DNA索烃），且难以扩展应用于本实验方案中所使用的大尺寸DNA折纸结构。最近，Gerling et al.27 报道了一种利用紫外照射在DNA纳米结构内相邻胸腺嘧啶之间形成共价环丁烷嘧啶二聚体（CPD）键的方法。尽管该方法具有位点选择性和可扩展性，但其在保护DNA折纸结构方面的效率远低于多阳离子包被法。例如，经CPD稳定的DNA折纸结构仅能在0.4 U/mL DNase I中维持1小时，而多聚复合物在10 U/mL DNase I中至少可稳定存在一天。
简而言之，受基因治疗启发的壳聚糖和LPEI包覆方法是一种低成本、一步式且高效的技术，可用于解决DNA折纸纳米结构在缺乏镁离子且富含核酸酶的环境中长期稳定性的问题。该多聚复合物形成的可逆性使其适用于多步骤诊断检测：在某一检测步骤中，保护DNA折纸结构免受核酸降解或盐耗竭至关重要，但在其他步骤（如DNA扩增）中这种保护可能带来干扰。此外，多聚阳离子包覆也是增强DNA折纸纳米结构细胞摄取能力的一种潜在策略，可用于药物递送应用28。

DNA 是一种可用于程序化自组装纳米级结构的多功能构建单元1。构建 DNA 纳米结构最常用的方法是 DNA 折纸技术，该技术依赖于一条长的环状单链 DNA 支架链，在数百条较短的、决定形状的合成短链辅助下实现自组装2。如今，几乎任意几何形状和形貌的 DNA 纳米结构都可便捷地构建。DNA 纳米结构能够以高精度实现位点特异性功能化3,4，并可被编程以发生变构构象变化5,6。因此，以 DNA 作为构建材料为开发可编程、可响应的定制纳米结构提供了独特机遇，可用于生物传感、诊断和药物递送等领域。然而，DNA 纳米结构易被外切核酸酶（exo-nucleases）和内切核酸酶（endo-nucleases）降解，且基于晶格的三维 DNA 折纸纳米结构通常需要高盐缓冲液（例如，5–20 mM Mg+2）以维持其完整性7,8。
血液和细胞外基质中存在的核酸酶对DNA的快速降解是将遗传物质高效递送至细胞内（in vivo）的主要障碍之一9。为克服这一限制，在非病毒基因递送中，通常在特定的N/P电荷比（即聚阳离子中的胺基与DNA中的磷酸基的摩尔比）下将DNA与阳离子聚合物混合10。DNA与阳离子聚合物形成的复合物称为聚复合物（polyplex），可保护DNA免受核酸酶介导的降解，并增强其细胞摄取能力11。受基因递送技术进展的启发，寡聚赖氨酸12、寡聚赖氨酸-聚乙二醇（PEG）共聚物13、基于聚（2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PDMAEMA）的聚合物14以及病毒衣壳蛋白15已被用于稳定DNA折纸纳米结构。
最近，我们报道了一种利用天然阳离子多糖壳聚糖和合成线性聚乙烯亚胺（LPEI）在镁离子耗尽且富含核酸酶的环境中保护DNA折纸纳米结构的方法16。本文是对我们前期工作的改进与扩展，详细描述了多聚复合物（polyplexes）的制备流程、表征方法，以及在低盐和富含核酸酶的环境中对裸露和受保护纳米结构稳定性的检测，并进一步探讨了酶和适配体功能化的DNA折纸纳米结构在多阳离子包被后是否仍保持其可寻址性。

<table><tbody><tr><td>10&amp;times; DNase I 反应缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室（NEB）</td><td>B0303</td><td></td></tr><tr><td>ABTS（2&amp;prime;3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐（ABTS）</td><td>Alfa Aesar</td><td>J65535</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 超滤离心柱</td><td>默克密理博</td><td>UCF500308, UCF510024</td><td></td></tr><tr><td>乳酸壳寡糖（M&lt;sub&gt;n &lt;/sub&gt;~ 4000-6000, &gt; 90% 去乙酰化，60% 组成寡糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>523682</td><td></td></tr><tr><td>特定设计的短链DNA片段</td><td>集成DNA技术公司（Integrate DNA Technologies，IDT）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖钠盐（Mr ~ 4 kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75027</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖钠盐（Mr ~ 40 kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867</td><td></td></tr><tr><td>DNA凝胶上样缓冲液（6×）&amp;times;)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（RNase free）</td><td>新英格兰生物实验室（NEB）</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）BioUltra，无水 &amp;ge;99%（滴定）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA凝胶回收离心柱</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>7326165</td><td></td></tr><tr><td>血红素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液（32 wt%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>LPEI-25 kDa</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 样品还原剂（500 mM 二硫苏糖醇（DTT））</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG，M&lt;sub&gt;W &lt;/sub&gt;~ 8000 Da</td><td>卡尔·罗斯</td><td>O263.1</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺，线性，平均分子量 10,000，PDI &amp;le;1.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺，线性，平均分子量 5,000，PDI &amp;le;1.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764582</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K溶液（20 mg/ml）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>SYBER safe DNA凝胶染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S33102</td><td></td></tr></tbody></table>

基因治疗启发的聚阳离子涂层用于保护dna折纸纳米结构

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA折纸纳米结构在生物学和医学应用中具有巨大潜力。然而，生理液体中的低盐环境和核酸酶会导致自组装DNA纳米结构发生变性和降解。在非病毒基因递送中，通常通过将带负电荷的DNA包裹在阳离子外壳中来抵抗DNA的酶降解。受基因递送技术进展的启发，本文提出一种简单、一步式且稳健的方法，通过使用壳聚糖和线性聚乙烯亚胺对DNA折纸纳米结构进行包覆，实现其稳定化。该多聚阳离子包覆可有效保护DNA折纸纳米结构，使其在镁离子耗尽且富含核酸酶的环境中保持完整。该方法同时保留了基于酶和适体功能化的DNA纳米结构的完全可寻址性。

设计了三种不同构型的DNA折纸纳米结构，包括纳米棒（NR）、纳米瓶（NB）和线框纳米结构（WN）（纳米结构的3D模型如图2所示）。NR和NB分别基于方形和蜂窝晶格设计，使用caDNAno17软件完成，而WN则使用Daedalus软件18构建。有关DNA纳米结构设计与自组装的完整实验方案已有文献报道19,20,21,22。结构特异性的订书针链（staple strands）根据Stahl et al.23描述的方案进行订购、自组装并进一步纯化（步骤2）。
通过凝胶阻滞实验和纳米级透射电子显微镜（nsTEM）成像对多聚复合物进行了表征。将DNA折纸结构与聚阳离子混合后，观察到裸露纳米结构条带向阴极发生迁移（图1A）。这可归因于聚阳离子结合后中和了磷酸基团的负电荷，同时复合物整体尺寸增大。加入过量的聚阴离子（如硫酸葡聚糖）可逆转多聚复合物的形成。在此方面，分子量较高的硫酸葡聚糖（MW ~ 40 kDa）相较于低分子量的硫酸葡聚糖（MW ~ 4 kDa）表现出更强的解复合能力（图1B）。
通过醋酸铀负染透射电镜观察LPEI多聚复合物时，难以观察到任何颗粒。推测可能是由于LPEI对DNA折纸结构的紧密屏蔽，阻碍了醋酸铀与磷酸骨架的结合。因此，在进行负染透射电镜成像前，向LPEI多聚复合物中加入了过量的硫酸葡聚糖。解聚后的DNA折纸纳米结构未显示出任何缺陷或降解迹象。相反，壳聚糖多聚复合物无需聚阴离子处理即可成功成像（图2）。
所有裸露的DNA纳米结构（无论其构型如何不同）在37 °C孵育一天后均完全变性 37 °C 在无镁缓冲液中，未加保护的纳米结构迅速解体，这一现象通过纳秒级透射电子显微镜（nsTEM）成像得到证实。相比之下，在N/P≥1条件下以LPEI或壳聚糖包被的纳米结构则保持完整。类似地，DNase I滴定实验显示，未受保护的纳米结构易受酶解作用。裸露的纳米结构在含有1 U/mL DNase I的条件下孵育2小时后即被完全降解，而经LPEI或壳聚糖封装的DNA折纸结构在补充有10 U/mL DNase I的无镁缓冲液中至少可保持完整一天。图2）。通过提高聚复合物的N/P比，可增强其对核酸酶降解的稳定性。此外，与壳聚糖相比，线性聚乙烯亚胺（LPEI）对DNA纳米结构的保护作用更为高效。图3A, 图3C），这可能是由于LEPI具有更高的电荷密度，从而对DNA具有更强的结合亲和力24使用不同分子量的LPEI时未观察到差异 （图3B).
DNA纳米结构在聚合物外壳封装后其功能基团仍具有可寻址性，这是一个重要特性。此外，还考察了多阳离子涂层与辣根过氧化物酶（HRP）以及血红素结合适配体（HBA）功能化的DNA折纸结构的相容性。从纳米棒（NR）表面突出三条生物素化的短链，随后与HRP偶联的链霉亲和素结合（每个DNA折纸结构结合三个酶）。在这些实验中选用了催化活性很高的HBA适配体PS2.M（Kd: 439 nM；序列为5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3'）25。最多24条短链通过一段5 nm长的连接子（5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3'）从NR表面突出，其后连接PS2.M序列（每个DNA折纸结构结合24个适配体）。当以不同的N/P比用LPEI和壳聚糖对HRP或HBA功能化的DNA折纸结构进行包覆时，未观察到酶活性或适配体活性受到明显阻碍（图4A-B）16。然而，HRP酶在结合到DNA折纸结构后，其动力学特性发生了显著变化（图4C）。
<img alt="凝胶电泳结果；DNA-聚合物复合物，N/P 比分析，聚集体形成研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：聚集体形成与脱壳的代表性琼脂糖凝胶电泳（AGE）图像。（A） 壳聚糖在 N/P 比为 0.01–8 时与 NB 混合的电泳迁移率偏移实验。每条泳道含有 1 nmol NB。第一条泳道为参考 NB。（B） 阴离子型葡聚糖硫酸酯（DS）诱导聚集体脱壳。本图改编自先前发表的图示16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒相互作用的电子显微镜观察；LPEI和壳聚糖效应，Mg耗竭，DNase，TB。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：DNA折纸结构与多聚复合物的负染透射电子显微镜照片。 裸露DNA折纸纳米结构的三维模型及负染透射电镜（nsTEM）图像（第1和第2列）。LPEI多聚复合物（脱包后）和壳聚糖多聚复合物的nsTEM图像（第3和第4列）。裸露及受保护的DNA折纸结构（多聚复合物）在Mg²⁺耗竭（第5、6、7列）、酶降解（第8、9列）以及血清消化（第10、11列）条件下于37 °C孵育一天后的nsTEM图像。本实验使用LPEI-5 kDa。裸露DNA纳米结构在含有1 U/mL DNase I的条件下，或在TB + 10% FBS中于37 °C孵育2小时后，已在琼脂糖凝胶电泳（AGE）中降解至无法检测。比例尺：100 nm。本图改编自先前发表的图示16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果与柱状图；不同N/P比下的LPEI分析，显示浓度趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：DNase I保护实验的代表性结果。（A）WN与LPEI-5 kDa、LPEI-10 kDa和LPEI-25 kDa在N/P比为2、4、8和10时形成的聚集体的DNase I保护实验。样品在37 °C下经10 U/mL DNase I处理24小时。最末泳道为对照WN。上样前对聚集体进行脱包处理。（B）从AGE图像A中提取的不同LPEI与DNA折纸结构形成的聚集体的归一化平均条带强度。Y轴表示归一化平均条带强度。（C）壳聚糖-WN聚集体在N/P比为1、2、4、10和20时的DNase I保护实验。样品在37 °C下经10 U/mL DNase I处理24小时。第6泳道为对照聚集体（N/P 20）。最末泳道为对照WN。所有壳聚糖聚集体在上样前均进行脱包处理。本图改编自先前发表的图示16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="吸光度与 N/P 比值的柱状图及吸光度随时间变化的曲线；HRP-NR、HBA-NR、壳聚糖分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：比色法酶和适配体功能化 DNA 折纸检测的代表性结果。（A） 反应开始 3.7 小时后，经壳聚糖包覆的酶功能化纳米结构（HRP-NR）的比色检测结果。（B） 反应启动 6 分钟后，经壳聚糖包覆的适配体功能化纳米结构（HBA-NR）的比色检测结果。Y 轴表示归一化的吸光度。（C） 随时间监测 HRP 和 HRP-NR 的比色检测过程。本图改编自先前发表的图示16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>阳离子聚合物</td>
			<td>壳聚糖</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚合物分子量 (kDa)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单体分子量 (g/mol)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每个单体的胺基数</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每个聚合物的胺基数</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 计算每个多阳离子的胺基数。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>硫酸葡聚糖的分子量（kDa）</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单体的分子量（g/mol）</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每个单体上的硫酸根基团数量</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每个聚合物上的硫酸根基团数量</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 计算每个多阴离子的硫酸根数目。

本文介绍了一种利用天然阳离子多糖壳聚糖和合成线性聚乙烯亚胺（LPEI）包被来保护在低镁且富含核酸酶环境中DNA折纸纳米结构的方案。

基因治疗启发的聚阳离子涂层用于保护DNA折纸纳米结构

DNA折纸纳米结构在生物学和医学应用方面具有巨大潜力。然而，低盐环境以及核酸酶的存在……

DNA纳米结构的生物稳定化对于未来的体内应用（如靶向药物递送）至关重要。然而，DNA在体内会被多种酶降解。本文介绍一种涂层技术，可保护DNA纳米结构免受酶降解。主要优点在于，我们的涂层由无毒化合物组成，这些化合物已在生物体内得到应用，同时仍可对表面进行功能化修饰。这种功能化修饰对于整合用于靶标识别的分子传感器以及用于药物负载释放的开关至关重要。聚阳离子涂层显著提高了封装的DNA折纸结构的细胞摄取效率，因此该方法可为DNA折纸结构在诊断和治疗领域的应用开辟新的途径。对于DNA纳米技术在基因递送应用中的潜在用途而言，细胞摄取也是必需的。我认为该方法相当直接，易于掌握。首先，测定纯化后的DNA折纸结构的浓度。使用 2 µL TB 缓冲液作为空白对照，校准紫外分光光度计，然后在 260 纳米处测定 DNA 折纸结构的浓度。随后根据手稿中所述公式二，计算纯化后 DNA 折纸溶液中磷酸根的含量。使用 TB 缓冲液进行稀释，加入一纳摩尔的磷酸盐，制备 15 微升的 DNA 折纸结构。将 1.8 微升壳聚糖加入 13.2 微升 TB 缓冲液中。然后将 15 微升壳聚糖溶液加入 15 微升 DNA 折纸结构中，以制备 N/P 比为 8 的 DNA 折纸-壳聚糖多聚复合物。按照文中所述计算方法，继续制备不同N/P比的聚复合物。准备一个80毫米的试管用于2%琼脂糖凝胶。加入352微升2.5摩尔的氯化镁，然后用10微升DNA凝胶染料进行预染色。将凝胶溶液倒入干燥的凝胶模具中。插入琼脂糖凝胶电泳梳，并在室温下静置15至30分钟使其凝固。同时，向电泳缓冲液中添加11毫摩尔氯化镁。取每种样品10至20微升，与6×上样缓冲液按1:5体积比混合。将样品加入琼脂糖凝胶孔中，同时以裸露的DNA折纸结构作为对照。在室温下以70伏电压电泳运行两个半小时至三小时。然后使用紫外扫描仪观察凝胶。进行DNase I保护实验时，取不同N/P比下比较的每种聚集体各4微升，加入1.5微升10X DNase I缓冲液、8微升TB缓冲液和1.5微升DNase I至各自的2毫升PCR管中。随后在37摄氏度的热循环仪中孵育24小时。为了消化DNase I，加入2 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，在PCR仪中37°C条件下孵育30分钟。随后，为解开核心DNA纳米结构，加入3.6 µL浓度为50 mg/mL的40 kDa硫酸葡聚糖。然后将这些样品与新鲜的DNA折纸结构作为对照，按照先前所述方法进行琼脂糖凝胶电泳分析。从凝胶中切下与上样样品对应的位置条带。为提取DNA折纸结构，使用挤压冷冻洗脱柱，并按照制造商说明书操作，随后按照文中所述进行负染透射电子显微镜成像。将6.5微升纯化的36纳摩尔HRP-NR与6.5微升不同浓度的多聚阳离子混合。为制备N/P比为1、2、4、10和20的聚复合物（polyplex），通过将6.5微升蒸馏水与6.5微升相应浓度的多聚阳离子溶液混合，配制空白组，该多聚阳离子溶液浓度分别对应N/P比为1、2、4、10和20。然后将12.5微升上述每种配制好的溶液分别加入96孔板的独立孔中。随后向每个孔中加入72.5微升HEPES缓冲液并混匀。向每个孔中加入10 µL 15 mM ABTS，然后加入5 µL 12 mM过氧化氢，通过反复吹打混匀。最后，使用多功能酶标仪在4小时内测量421 nm处的吸光度。在使用凝胶阻滞实验分析聚复合物后，观察到裸纳米结构向阴极发生迁移，这可能是由于多聚阳离子结合后中和了磷酸基团的负电荷，以及复合物尺寸增大的缘故。当加入过量的多聚阴离子（如硫酸葡聚糖）时，多聚复合物的形成被逆转。与低分子量相比，高分子量的硫酸葡聚糖显示出更高的效率。通过负染透射电子显微镜分析多聚复合物后，显微图像显示了裸露的DNA折纸纳米结构、脱壳后的线性聚乙烯亚胺多聚复合物、壳聚糖多聚复合物，以及在镁离子耗竭、酶降解和血清消化处理条件下裸露和受保护的DNA折纸结构图像。在DNase I存在的情况下，两小时后，裸露的纳米结构被完全消化，而由壳聚糖包裹的线性聚乙烯亚胺多聚体DNA折纸结构在含有每毫升10单位DNase I的条件下仍保持完整。与壳聚糖相比，线性聚乙烯亚胺多聚体对DNA纳米结构的保护效率更高。当多聚体的N/P比值增加时，DNA的消化程度降低。在使用不同N/P比值的线性聚乙烯亚胺多聚体和壳聚糖对酶进行包被，或对功能化程度更高的DNA折纸结构进行包覆后，未观察到对酶活性产生显著干扰。另一方面，HRP 酶在与 DNA 折纸结构结合后，其动力学性质发生了显著变化。因此，实验开始时必须使用纯度高、结构完整的 DNA 折纸。存在一种更稳定的链，也可与多价阳离子结合。它们很难从DNA折纸多聚复合物中分离出来。我们的包被分子也可用于基因治疗应用。这意味着DNA纳米结构未来可用于改变生物体的基因组。对于琼脂糖凝胶染色，通常使用能够插入DNA的分子，这些分子可能具有致突变性。在对DNA进行染色时，请遵循实验室的安全操作规程。

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基因治疗诱导聚化涂层保护 dna 折纸纳米结构

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