细菌病原体在细胞和有机水平宿主反应探针中的应用

细胞内复制的微生物病原体最终必须退出受感染的细胞。其中，与宿主病原体相互作用的其他方面相比，相对研究不足。在这里，我们描述了分析病原体排放的技术。

我们展示如何相对简单的检测可用于评估排放效率或描述后排放病原体。与建立任何实验系统一样，必须建立明确的控制措施，以确保在实验样本或队列中观察到真正的生物过程。演示这个程序将是彼得里亚盖尔，一个研究生从我的实验室。

首先进行感染实验，使用移液器将20微升的新鲜准备的Lm inoculum添加到井中，盘中稍微倾斜，移液器尖端小心地放在上部介质中。避免使用移液器尖端接触井壁。轻轻移液每一个井的内容，以确保完全混合。

请勿摇晃或明显倾斜板，以免将 LM 铺在井壁上。将细胞培养皿返回37摄氏度，5%的二氧化碳孵化器。使用未感染细胞的有条件介质作为稀释剂，每毫升基因霉素溶液中可准备 10 微克。

感染后30分钟，小心地将30微升的根霉素溶液加入盘中，达到每毫升2点5微克的最终浓度。轻轻移液井的内容，混合并返回细胞培养皿到孵化器。要收获，请稍微倾斜盘子，并小心地使用移液器将整个介质从井中拆下。

向井中加入五毫升的蒸馏无菌水。30秒后，将所得水酸盐转移到1点-5毫升微离心管和涡流中，用力进行10秒。将四点五微升和50微升水酸盐加入450微升蒸馏无菌水，以准备十倍和一百倍稀释。

短暂涡流，确保彻底混合。将原10倍稀释和百倍稀释样品的50微升加入利原汤加糖板，然后使用板材摊铺器进行扩散。为了检测新兴的LM，从培养皿中提取10微升的覆盖介质，并分为两个五微升的等分和微型离心管。

将 5 微升 DMEM/FCS 添加到一个等分中，并将含有每毫升 5 微升的 DMEM/FCS 的 5 微升添加到第二个等分项中作为控制。在室温下等待五分钟。在每个等分中加入90微升蒸馏无菌水，并大力旋转两个，10秒钟。

然后在 LB 阿加板上添加 50 微升样品，然后使用板扩散器进行扩散。将盘子存放在37摄氏度的培养箱中两天，然后列举Lm菌落。使用自动细胞计数器，将准备好的二六四点七细胞的浓度调整为每毫升六细胞的浓度为 10 倍。

将一毫升样品加入六孔组织培养板的井中。感染细胞与准备的Lm inoculum，对应于50的多重感染。感染后一点五小时，在充满500微升4%PFA的1点-5毫升微离心管中，从第一组油井收集介质，将管子放在冰上。

要收集细胞内 Lm，请向每井加入一毫升蒸馏无菌水。60 秒后，将产生的水酸盐转移到 1 点 5 毫升微离心管中，并配有 500 微升的 4% PFA。用力旋转管子10秒钟，然后放在冰上。

对于剩余的水井，去除介质，用每毫升5微克的DMEM/FCS代替，以杀死细胞外Lm.迅速将菜回孵化器。30 分钟后，取出介质，用 DMEM/FCS 更换，无需根霉素。再过两四个小时，收集第二次和第三次点到管中的介质，并把它们放在冰上冷却。

10，000次G的离心管，7分钟。使用移液器，去除上流剂，而不干扰颗粒。将含有 50 微升 4% PFA 和 15 微升的 phaloidin 的染色鸡尾酒加入管中，混合以悬浮每个颗粒。

在黑暗中孵育管，在4摄氏度下孵育20分钟。孵育后，将一毫升的FACS缓冲液添加到每个管中，并上下移液器混合。在离心机中旋转管，以10，000次G速度旋转7分钟。

在不干扰颗粒的情况下去除上一液。立即使用，将每个颗粒悬浮在 400 微升 FAX 缓冲液中。如果存储供以后分析，请将 200 微升的 FAX 缓冲液和 4% PFA 的 200 微升添加到管中并混合以挂起。

利用抗生素根霉素的短暂治疗中的感染条件，消除非内化Lm，在与培养的巨噬细胞共育1点5小时后，可恢复野生型Lm的零点-一至5%。在随后的联合孵化中，活体Lm的恢复量增加了四倍和七点五倍，这完全代表细胞内增殖。在初始感染期间，在三到六个 HPI 之间，观察到具有超维性prfA的Lm菌株的可比配置文件。

当 prfA 从 Lm 菌株中删除时，在长时间的共育后，该菌株的恢复会减少。当六个HPI从井中去除根霉素时，一小时后可以检测到野生型和超维性prfA菌株的细胞外Lm，但无法检测出删除prfA菌株的菌株。覆盖未感染和受感染巨噬细胞的介质含有光散射、细菌大小的颗粒物。

然而，只有来自受感染巨噬细胞的介质在尺寸门控内具有GP阳性信号。观察到感染的巨噬细胞出现法罗酮阳性的 Lm 的时间依赖性增加。当电镀48孔组织培养皿中的巨噬细胞时，留下一些没有细胞的井。

然后，这些无细胞控制井在添加病原体、抗生素等方面与含细胞井完全相同，以确保实验信号依赖于宿主细胞的存在。与图一和图三所示的实验类似，可以测试病原体或宿主因子和或小分子对病原体细胞外流的影响。