Name: 细菌病原体在细胞和有机水平宿主反应探针中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 了解用于分析细胞内细菌病原体外排效率的体外和体内感染实验方法。这些技术可评估宿主因子活性并表征外排后的病原体，为研究宿主-病原体相互作用提供重要工具。

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小鼠的处理遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的所有适当政府规定，符合人道主义原则，且本研究中动物使用已获得迈阿密大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 16-053）。
1. 准备细胞以进行感染
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清的DMEM培养基（以下简称DMEM/FCS）中，使用125 mL细胞培养瓶和维持在37 °C、5% CO2条件下的细胞培养箱，培养小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7。</li>
	<li>感染前一天，使用细胞刮刀从扩增用培养瓶中收集细胞，并转移至15 mL带螺帽的锥形离心管中。以800 × g 离心10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL不含抗生素的DMEM/FCS中，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞滴度。</li>
	<li>将细胞滴度调整至2 × 106 个细胞/mL，取0.10 mL（含2 × 105 个细胞）接种至48孔细胞培养板的各孔中。确保细胞悬液完全覆盖每个孔的表面。
	<ol>
		<li>在额外的孔中接种细胞，以备后续制备条件培养基使用。另在三个额外的孔中各加入0.10 mL DMEM/FCS，作为“无细胞对照”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。次日，在细菌接种物配制完成并可使用前，不要将培养板从培养箱中取出。</li>
</ol>
2. 准备用于感染的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）
<ol>
	<li>从新鲜划线的琼脂平板（&#60;2天）上挑取单个单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌落，接种于2 mL脑心浸液（BHI）培养基中，于37 °C、130 转/分钟振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>次日，取0.10 mL过夜培养物加入2 mL预热的BHI培养基中，继续在37 °C、振荡条件下培养，直至其在600 nm处的光密度（OD600）达到0.4至0.6之间。</li>
	<li>使用经验推导的换算公式估算细菌滴度。在本实验室中，处于对数生长期的Lm在BHI培养基中的浓度约为1.3 × 109菌落形成单位（CFU）/OD600。应尽量减少细菌培养物在室温下的暴露时间。</li>
	<li>感染前，使用预热的DMEM/FCS培养基作为稀释液，将菌液滴度调整至5 × 107 CFU/mL。</li>
</ol>
3. 感染
<ol>
	<li>迅速而精确地操作，将20 µL（1 × 106 CFU；感染复数，MOI = 5）新鲜制备的 Lm 接种液（见上述步骤2.4）加入孔中，方法为轻微倾斜培养皿，并将移液枪头小心插入上层培养基中； 
	注意：&#160;避免移液枪头接触孔壁。</li>
	<li>轻柔吹打各孔内容物以确保充分混匀；切勿振荡或大幅倾斜培养板，以免将 Lm 扩散至孔壁。将细胞培养皿放回37 °C/5% CO2 培养箱中。</li>
	<li>使用未感染孔中的条件培养基作为稀释液，配制10 µg/mL的庆大霉素溶液。</li>
	<li>感染后30分钟（mpi），小心向每孔加入30 µL庆大霉素溶液（终浓度为2.5 µg/mL），并像之前一样轻柔吹打孔内液体，随后将细胞培养皿放回37 °C/5% CO2 培养箱中。</li>
	<li>在60 mpi时，收获相应孔中的样本，用于CFU检测（60 mpi时间点）或流式细胞术（FCM）分析（分别见下文第4和第5节）。</li>
	<li>对于其余孔，在此后不同时间点，可按前述方法收获细胞；或在进行 Lm 释放检测时，完全移除孔内培养基，并更换为150 µL不含庆大霉素的条件培养基。</li>
</ol>
4. 通过菌落形成单位（CFU）测定法对细胞内及释放的单核细胞增生李斯特菌（Lm）进行取样处理与分析
<ol>
	<li>收获时，轻轻倾斜培养皿，小心移除孔中的全部培养基。向孔中加入 0.50 mL 无菌蒸馏水（dsH2O）。30 秒后，将所得的水裂解液（100）转移至 1.5 mL 微量离心管中，剧烈涡旋振荡 10 秒。</li>
	<li>通过将 4.5 µL 或 50 µL 水裂解液分别加入 450 µL 的 dsH2O 中，制备 10-1 和 10-2 稀释液，并短暂涡旋以确保充分混匀。</li>
	<li>取 50 µL 的 100、10-1 和/或 10-2 样品，涂布于 LB（Luria-Bertani）琼脂平板上。</li>
	<li>为检测释放出的 Lm（见上述步骤 3.6），取出 10 µL 上层培养基，均分为两个 5 µL 的等分试样：向其中一个试样加入 5 µL DMEM/FCS，向另一个试样加入含 5 µg/mL 庆大霉素的 5 µL DMEM/FCS。后者作为对照，用于在后续的菌落形成单位（CFU）检测中区分细胞外 Lm（对庆大霉素敏感）与细胞内 Lm（对庆大霉素耐药）。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟后，加入 90 µL 的 dsH2O，剧烈涡旋振荡 10 秒，然后取 50 µL 涂布于 LB 琼脂平板上。</li>
	<li>在 37 °C 条件下培养 2 天后，计数 LB 琼脂平板上的 Lm 菌落。</li>
</ol>
5. 通过流式细胞术（FCM）对胞内及外排的Lm进行取样处理与分析
<ol>
	<li>按照步骤 1.1-4 所述方法准备 RAW 264.7 细胞。将细胞调整至 1 × 106 个细胞/mL，每孔加入 1 mL（即 1 × 106 个细胞）至 6 孔组织培养板中。</li>
	<li>按照步骤 2.1-2.3 所述方法制备细菌接种物，并加入相应体积的接种物以达到感染复数（MOI）为 50（即 5 × 107 CFU）。</li>
	<li>感染后 1.5 小时（hpi），收集第一组孔中的培养基，转移至含有 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）的 1.5 mL 微量离心管中，置于冰上，待所有孔处理完毕。</li>
	<li>为收集细胞内 Lm，向孔中加入 1 mL 双蒸水（dsH2O），60 秒后将所得水裂解液转移至含有 500 µL 4% PFA 的 1.5 mL 微量离心管中。剧烈涡旋振荡 10 秒，置于冰上，待所有孔处理完毕。（样品处理详见下文步骤 5.8。）</li>
	<li>对于其余孔，吸除培养基，更换为含 5 µg/mL 庆大霉素的 DMEM/FCS 培养基 1 mL，以杀灭细胞外的 Lm，并立即将细胞放回培养箱中继续培养。</li>
	<li>30 分钟后（即 2 hpi），吸除培养基，更换为不含庆大霉素的 DMEM/FCS 培养基。</li>
	<li>在感染后 2 小时和 4 小时（即 4 hpi 和 6 hpi），分别采集第二和第三个时间点的样品，方法同步骤 5.3 和 5.4，收集培养基和裂解液。</li>
	<li>将离心管在 10,000 × g 条件下离心 7 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>将每管沉淀重悬于染色混合液中（含 50 µL 4% PFA 和 15 µL 鬼笔环肽），避光于 4 °C 孵育 20 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，向每管加入 1 mL FACS 缓冲液，用移液器反复吹打混匀。</li>
	<li>将离心管在 10,000 × g 条件下离心 7 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>将每管沉淀重悬于 400 µL FACS 缓冲液中，用于立即检测；或重悬于 200 µL FACS 缓冲液和 200 µL 4% PFA 中，用于后续分析时保存。</li>
	<li>将样品上流式细胞仪检测，并分析所获得的数据。</li>
</ol>
6. 样品处理与分析 Lm 肝脏中的定植与宿主反应
<ol>
	<li>按照步骤 2.1–2.3 所述方法准备用于感染的 Lm。</li>
	<li>计算获得目标滴度为 3 × 106 CFU/mL 所需的亚培养物用量。</li>
	<li>在感染前，将计算量的细菌用预热的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）稀释至终体积为 1 mL。此即注射入小鼠的接种物。</li>
	<li>使用 28 G½ 100U 胰岛素注射器吸取 100 µL（3 × 105 CFU）接种物，并去除任何可见气泡。</li>
	<li>将小鼠（C57BL/6 品系；雄性，6 至 12 周龄）放入固定装置中，用温水（不超过 45 °C）扩张尾静脉，随后将接种物注入静脉。</li>
	<li>将接种物进行 10-2 和 10-3 稀释后涂布于 LB 琼脂 10bcm 平板，37 °C 过夜培养，以确定实际接种剂量。</li>
	<li>在感染后 18 小时（hpi），以人道方式处死小鼠（CO2 窒息后行颈椎脱位），使用无菌剪刀切开小鼠腹膜，分别使用不同的镊子和剪刀处理小鼠体外和体内组织，采集肝脏前叶。将肝脏置于冰上放置的 6 cm 培养皿中。</li>
	<li>将肝脏切成小块，放入含磁力搅拌子的玻璃小瓶中。加入 2 mL 用不含 FCS 的 DMEM 重悬的 2 mg/mL 胶原酶 D。将小瓶置于 37 °C 磁力搅拌器上孵育 30–45 分钟。组织匀浆后，加入 3 mL DMEM/FCS 以灭活胶原酶。</li>
	<li>将细胞通过 70 µm 细胞滤网过滤至锥形管中，必要时补充更多 DMEM/FCS。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟使细胞成团，弃上清，用 500 µL ACK 缓冲液重悬细胞沉淀以裂解红细胞。</li>
	<li>在室温下用 ACK 缓冲液孵育细胞 5 分钟，随后用 1 mL DMEM/FCS 重悬细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟使细胞成团，弃上清，用 1 mL DMEM/FCS 重悬细胞。然后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
	<li>将 1 × 106 个细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，离心成团。然后用 1 mL 去离子水（dsH2O）重悬并涡旋以裂解细胞。取 50 µL 未稀释及 10-2 稀释的样品涂布于 LB 平板，37 °C 培养以进行 CFU 分析并计数 Lm。</li>
	<li>根据细胞计数结果，将 1 × 106 个细胞转移至每个组织样本对应的流式管（FACS 管）中，并用 1 mL FACS 缓冲液洗涤。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟使细胞成团，弃上清。</li>
	<li>根据每种抗体的推荐浓度和 FACS 缓冲液配制含有目标抗体的抗体混合液。参见材料表中分析所用的推荐用量。</li>
	<li>用 100 µL 抗体混合液重悬细胞沉淀，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，向每管中加入 2 mL FACS 缓冲液并重悬细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 800 × g 离心使细胞成团，弃上清。然后用 400 µL FACS 缓冲液重悬细胞，用于立即检测；或用 200 µL FACS 缓冲液和 200 µL 4% 多聚甲醛（PFA）重悬，用于后续保存。</li>
	<li>通过流式细胞术分析细胞（参见步骤 5.13）。</li>
</ol>

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<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于单核细胞增生李斯特菌（Lm）具有快速且高效的细胞感染程序，因此它是研究影响感染过程的宿主细胞活动的理想病原体。已有大量宿主因子被发现可正向或负向调控Lm的细胞感染11,12,13,14。我们实验室已鉴定出其中两种宿主因子——穿孔素-2（Perforin-2）和血红素调节抑制因子（Heme Regulated Inhibitor，分别简称为P2和hI），它们分别调控Lm感染过程中的不同特征。如图3所示，P2缺陷型细胞对Lm高度易感，P2基因敲除小鼠也表现出增强的易感性4。对表达P2与缺乏P2的巨噬细胞进行的详细比较研究表明，后者会形成高度酸化的含Lm吞噬体，从而导致毒力基因表达增强。进一...

基于感染的实验模型本质上具有挑战性，因其依赖于宿主和病原体的初始状态条件、病原体多样的感染策略，以及难以根据结果区分由病原体或宿主驱动的过程。Listeria monocytogenes（Lm）由于其遗传和微生物学上的可操作性、快速且高效的细胞内感染策略，以及其在细胞水平和个体水平上的感染表型之间关系相对清晰，已成为研究宿主防御反应的理想病原体。Lm的细胞感染过程可分为四个明确的阶段1：（i）细胞入侵，最终使Lm被包裹在液泡内；（ii）由Lm介导的液泡膜溶解，并将Lm释放至胞质溶胶中；（iii）在胞质溶胶内的复制；（iv）对质膜的物理穿透，导致邻近细胞的直接感染（如在上皮细胞层中），或在孤立细胞中将Lm释放到细胞外环境。这些阶段均由特定的Lm编码因子（称为“毒力因子”）促进，若这些因子缺失，会在细胞和动物模型中均导致感染缺陷。这种通用的感染策略已被多种所谓的“胞质内”病原体独立演化出来2。
菌落形成单位（CFU）实验被广泛用于评估体外（即细胞水平）和体内（即生物体水平）的感染结果。除了具有高灵敏度（尤其是对体内感染）外，CFU实验还能明确反映病原体的侵袭能力以及其在细胞内的存活与增殖情况。CFU实验已被广泛用于分析影响感染过程的单核细胞增生李斯特菌（Lm）和宿主细胞的相关因子。尽管以往的研究利用CFU实验深入揭示了细胞侵袭和胞质内复制过程，但据我们所知，CFU实验尚未被用于追踪Lm感染过程的第四阶段：细胞逃逸。本文介绍了一种相对简便的方法，可通过CFU实验（以及流式细胞术）监测细胞逃逸过程（下文简称为“逸出”），并举例说明病原体和宿主编码的因子如何调控Lm感染周期的这一阶段。对细胞内Lm感染周期终末阶段的分析，可能有助于发现更多与病原体及宿主细胞感染特异性相关的因子和生物学活动。

<table><tbody><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>ArC胺反应性补偿微珠&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI（脑心浸液）肉汤</td><td>EMD Milipore</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，70 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FACS管&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS－热灭活&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo;平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB琼脂</td><td>Grow Cells MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD可固定黄色死细胞染色试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800光谱分析仪</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器 28G 1/2&quot; 1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP组织培养48孔板&amp;nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP组织培养6孔板&amp;nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗原&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = PE Cy5，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = AF 647，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = APC Cy7，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = PE，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = BM8</td></tr><tr><td>活/死细胞染色</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>荧光染料 = AmCyN，稀释倍数 = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = PacBlue，稀释倍数 = 1/200，克隆号 = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = AF 700，稀释倍数 = 1/200，克隆号 = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>荧光染料 = BV 605，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = PK136</td></tr></tbody></table>

利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

细菌病原体在进入真核细胞后，会采用多种策略以存活并增殖。所谓“胞质内”病原体（如Listeria monocytogenes、Shigella flexneri、Burkholderia pseudomallei、Francisella tularensis 和 Rickettsia spp.）通过物理和酶解方式降解初级液泡膜，从而进入感染细胞的胞质溶胶。一旦进入胞质溶胶，这些病原体不仅能够增殖，还能产生足够的机械力穿透宿主细胞的质膜，以感染新的细胞。本文展示了如何通过菌落形成单位实验和流式细胞术对单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，Lm）细胞感染周期的这一终末步骤进行定量，并举例说明病原体和宿主编码因子如何影响该过程。我们还展示了体外培养细胞感染中Lm的感染动态与体内感染小鼠来源肝细胞的感染动态之间具有高度一致性。这些基于功能的检测方法相对简单，易于扩展，可用于发现调控真核细胞功能的调节因子的高通量筛选。

评估病原体和宿主编码因子在细胞感染中的作用 
使用上述感染条件，在与培养的巨噬细胞共孵育1.5小时后，可回收0.15%的输入野生型Lm（图1A）。在随后的1.5小时共孵育期间（感染后3小时，hpi），可回收的活Lm增加了4倍；从3小时到6小时（hpi），活Lm的回收量进一步增加了7.5倍。由于在感染后1小时（hpi）向共培养体系中添加了不能穿透细胞的抗生素庆大霉素，以清除细胞外的Lm，因此在1.5至6 hpi期间活Lm水平增加30倍完全代表了其在细胞内的增殖。
Lm 在被真核细胞内化后可迅速进入细胞质（见引言）。进入细胞质的 Lm 会与肌动蛋白聚合机制结合，借此推...

我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。

细菌病原体在进入真核细胞后，会采用多种策略以求生存和增殖。所谓“胞质内”……

在细胞内复制的微生物病原体最终必须离开被感染的细胞。与宿主-病原体相互作用的其他方面相比，这一过程的研究相对不足。本文中，我们描述了用于分析病原体外排的实验技术。我们将展示如何利用相对简单的实验方法来评估外排效率或表征外排后的病原体。此处描述的通用技术具有广泛的适用性，尽管针对特定病原体与宿主细胞的模型可能在动力学、剂量以及可能的检测读数方面有所不同。如同建立任何实验系统一样，必须设立明确的对照，以确保在实验样本或队列中观察到的是真实的生物学过程。本次实验操作将由我实验室的研究生 Petoria Gayle 进行演示。开始感染实验时，使用移液器将 20 µL 新鲜配制的 Lm 接种液加入培养板孔中，将培养板略微倾斜，小心将移液器吸头置于覆盖的培养基液面下，避免吸头接触孔壁。轻轻吹吸混匀各孔中的液体，以确保充分混合。不要振荡或大幅倾斜培养板，以免将LM扩散到孔壁上。将细胞培养皿放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。使用未感染细胞的条件培养基作为稀释液，配制10微克/毫升的庆大霉素溶液。感染后30分钟，小心地向培养皿中加入30微升庆大霉素溶液，使终浓度达到每毫升2.5微克。轻轻吹打孔内液体以混匀，并将细胞培养皿放回培养箱。收获时，将培养皿略微倾斜，小心使用移液器吸除孔内全部培养基。向孔中加入0.5毫升蒸馏灭菌水。30秒后，将所得水裂解液转移至1.5毫升微量离心管中，剧烈涡旋振荡10秒。取4.5微升和50微升水裂解液，分别加入450微升蒸馏灭菌水中，制备十倍和一百倍稀释液。轻轻涡旋以确保充分混匀。取50微升原始十倍稀释和一百倍稀释的样品，加入LB（Lysogeny Broth）琼脂平板中，使用涂布棒均匀涂布。为检测新出现的LM，从培养皿中吸取10微升上层液体，分装为两份，每份5微升，分别加入微量离心管中。向一份等分试样中加入5 µL DMEM/FCS，向另一份等分试样中加入含有5 µg/mL庆大霉素的DMEM/FCS 5 µL作为对照。室温下静置5分钟。向每份等分试样中加入90 µL无菌蒸馏水，剧烈涡旋振荡10秒。然后取50 µL样品加入LB琼脂平板中，使用涂布棒涂布均匀。将平板置于37 °C培养箱中培养两天，然后计数单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌落。使用自动细胞计数仪，将制备的原始264.7细胞调整至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。向六孔组织培养板的孔中加入一毫升样品。用制备好的单核细胞增生李斯特菌（Lm）接种物感染细胞，感染复数为50。感染后1.5小时，在装有500微升4%多聚甲醛（PFA）的一点五毫升微量离心管中收集第一组孔中的培养基，并将该管置于冰上。为收集胞内单核细胞增生李斯特菌（Lm），向每个孔中加入一毫升无菌蒸馏水。60秒后，将所得的水裂解液转移至含有500微升4%多聚甲醛（PFA）的一点五毫升微量离心管中。剧烈涡旋振荡该管10秒，然后置于冰上。对于其余孔，吸除培养基，并加入一毫升含每毫升五微克庆大霉素的DMEM/FCS，以杀灭胞外李斯特菌（Lm）。立即将培养皿放回培养箱中。30分钟后，吸除培养基，并更换为不含庆大霉素的DMEM/FCS。再经过两小时和四小时后，分别第二次和第三次收集裂解液中的培养基至离心管中，并置于冰上冷却。将离心管在10,000 × g条件下离心七分钟。使用移液器小心移除上清液，避免扰动沉淀。向管中加入染色液混合物，包含50微升4%多聚甲醛和15微升鬼笔环肽，混匀以重悬各沉淀。将离心管置于4°C避光孵育20分钟。孵育结束后，向每根离心管中加入1毫升FACS缓冲液，用移液器上下吹打混匀。将离心管放入离心机中，在10,000 × g下离心7分钟。去除上清液时勿扰动沉淀。如需立即使用，将每份沉淀重悬于400 µL FAX缓冲液中。如需保存以备后续分析，则向管中加入200 µL FAX缓冲液和200 µL 4% PFA，混匀以重悬沉淀。采用简短的抗生素庆大霉素处理条件以消除未内化的单核增生李斯特菌（Lm），在与培养的巨噬细胞共孵育1.5小时后，可回收到0.15%的野生型Lm。在随后的共孵育过程中，可回收的活Lm数量分别增加了4倍和7.5倍，这些增加完全代表了胞内增殖。在初始感染期间，携带高毒力prfA的Lm菌株表现出类似的趋势，但在感染后3至6小时之间则未观察到相似的增殖模式。当从单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌株中删除 prfA 基因后，在长期共孵育后该菌株的回收率随之降低。在感染后6小时（HPI）去除庆大霉素后，一小时后可在细胞外检测到野生型和高毒力 prfA 菌株，但无法检测到 prfA 缺失的菌株。覆盖在未感染和感染的巨噬细胞上的培养基均含有散射光的、大小与细菌相当的颗粒物质。然而，仅感染的巨噬细胞培养基在设定的尺寸门控范围内显示出GFP阳性信号。在感染的巨噬细胞中，可见鬼笔环肽阳性单核细胞增生李斯特菌（Lm）的数量随时间推移而增加。将巨噬细胞接种至48孔组织培养板时，需留出部分孔不加细胞。这些无细胞对照孔需与含细胞的孔一样，接受相同的处理，包括添加病原体、抗生素等，以确保实验信号依赖于宿主细胞的存在。与图一和图三所示实验类似，可检测病原体或宿主因子和/或小分子对病原体细胞外排的影响。

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科研

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免疫学与感染

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自动化高通量细菌黏附宿主细胞检测方法

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