Name: 荧光显微镜对聚焦超声的刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习低强度脉冲超声刺激技术，用于机械生物学研究中的细胞非侵入性力学刺激。该方法可在荧光显微镜下实时测量生物样本对机械力的响应，为研究细胞力学机制提供高时空分辨率的实验手段。

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感谢 Mikhail Shapiro 博士和 Nikita Reznik 博士富有成效的讨论。本工作得到了美国西海岸健康科学大学启动资金以及美国国立卫生研究院资助项目 R21NS101384 的支持。

1. 在声学透明的聚酯膜上培养细胞
<ol>
	<li>使用垂直台式钻机在标准35 mm培养皿底部钻一个12 mm直径的孔。操作时应缓慢进行，并佩戴护目镜。用刀片去除附着在皿底的塑料碎片，使外部表面平整光滑（图2）。</li>
	<li>在培养皿外部底面涂上一层薄薄的船用级环氧树脂或胶水。</li>
	<li>将一层聚酯膜（厚度2.5 µm）贴附于培养皿外部底面，用力按压，确保环氧树脂/胶水在膜与厚塑料表面之间均匀分布。用手指以离心方式轻轻拉伸薄膜，使其形成平整表面（图2）。</li>
	<li>待环氧树脂/胶水完全干燥后，用95%乙醇对聚酯膜底培养皿进行短暂冲洗并干燥，并将培养皿及其盖子内表面置于高强度254 nm紫外激发光源下进行灭菌。调节照射时间和强度，使紫外剂量达到约330 mJ cm-2，以彻底灭活大多数类型的微生物。该能量剂量大致相当于使用1,000 µW cm-2紫外光照照射5分钟。</li>
	<li>将市售的细胞外基质蛋白混合物（EMPM）分装至小管中（每管50–100 µL），并在无菌条件下于-20 °C或更低温度保存。</li>
	<li>在无菌环境（例如 生物安全柜内），将冷冻保存的EMPM原液用所需的培养基按1:100比例稀释。操作过程保持在冰上，以防止EMPM在室温下发生聚合。迅速将100 µL稀释后的混合液滴加到聚酯膜表面，并盖上皿盖以维持无菌状态。</li>
	<li>将包被有EMPM的聚酯膜底培养皿置于细胞培养用CO2培养箱中，在37 °C条件下孵育6–12小时。</li>
	<li>孵育结束后，吸除多余液体，直接按所需密度在表面接种细胞。操作过程中须保持无菌条件以确保无菌性。</li>
</ol>
2. LIPUS 实施
<ol>
	<li>将一个水箱放置在直立式显微镜物镜下方，该显微镜需具有较大的工作空间，且透射光路中无照明装置。</li>
	<li>使用市售的光学机械组件，将样品 holder 置于物镜下方，超声换能器 holder 置于样品 holder 下方。为便于后续样品搜索和超声对准，将这两个 holder 安装在平移台上。
	<ol>
		<li>将平移台的运动部件和驱动装置置于水箱外部或水面以上，以避免水损。浸入水中的光学机械组件仅使用非腐蚀性材料，如阳极氧化铝或不锈钢。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在使用浸入式换能器之前，用水箱盛装去离子且脱气的水。水面应与样品 holder 的水平面重合（图3）。 
	注意：去离子水可防止在强电场存在时发生电耦合。脱气还可防止声波的散射和畸变。每次实验后应使用泵或阀门将水排出，使水位降至换能器位置以下。同时应频繁更换或过滤水，并根据需要清洁水箱，以防止微生物滋生。</li>
</ol>
3. 斜入射声波激发
<ol>
	<li>使用市售的光机械组件，将换能器相对于光路以倾斜位置放置。这将确保任何反射波均被导向远离样品的方向（图3 和 图4）。</li>
</ol>
4. 驱动换能器
注意：超声换能器将振荡的电能转换为压电材料的机械膨胀/收缩。这种转换会以热能形式产生能量损耗。因此，换能器不仅具有峰值输入电压限制，还具有电功率限制，以避免压电元件因过热而损坏： 
<img alt="功率计算公式，P = 占空比 × Vrms²/Z，用于电路分析的方程图示。" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> 
其中占空比为电信号激励时间的相对比例，P 为电功率（单位：瓦特），Vrms 为交流电压源的输入均方根电压（单位：伏特），Z 为电学阻抗（单位：欧姆）。 
<img alt="Vrms 公式，\( V_{rms} = \frac{V_{pp}}{2\sqrt{2}} \)，电路计算。" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"> 
其中 Vpp 为施加于换能器的峰-峰值输入电压。
<ol>
	<li>使用商用函数发生器创建包含所需频率、每脉冲周期数和脉冲重复频率的正弦波形。然而，由于有效驱动标准超声换能器通常需要较高的峰峰值电压（Vpp），往往需添加功率放大器以放大输出信号即， 增加 V 的幅度pp函数发生器的输出端。 
	注意：例如，某换能器制造商标明特定换能器的功率上限为 35 W。正弦波峰-峰值输入电压（V在50%占空比下500 mV的电压经50 dB/100 W放大器放大后，是否在此换能器的功率限制范围内？
	<ol>
		<li>要回答这个问题，需计算放大后的电压。对于射频（RF）功率放大器，放大倍数（dB）的定义为： 
		<img alt="分贝计算公式，dB=20log(Vout/Vin)，用于信号增益分析。" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq3.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"> 
		因此，放大后的电压具有幅值输出 Vpp (Vpp = V出的： <img alt="电压计算，公式 Vpp=0.5×10^(dB/20)=158V，电气工程公式。" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 
		根据公式1和公式2，并以50 Ω作为电学阻抗，该电压产生的相应功率为： 
		<img alt="功率计算公式，P=(0.5×[0.5×0.707×158]²)/50≈31 W，数学方程。" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"> 
		因此，该刺激处于换能器的功率限制范围内。</li>
		<li>以以上示例为例，计算与换能器制造商提供的功率和电压限制相对应的波形参数（Vpp、频率、脉冲持续时间及脉冲重复频率）。务必遵守这些限制，以避免损坏换能器及其他连接设备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择一个工作频率范围与超声换能器兼容的信号发生器。将信号发生器的频率调节至换能器的标称峰值频率。</li>
	<li>使用函数发生器的突发模式，生成所需持续时间和重复频率的正弦电压脉冲。将峰峰值电压调节至所需数值。确保脉冲持续时间短于两个连续脉冲之间的时间间隔。</li>
	<li>通过将信号发生器的输出端连接至示波器的输入端，检查波形是否与所需信号一致。</li>
	<li>将函数发生器的输出端连接至射频功率放大器的输入端图4确保刺激参数在换能器制造商规定的限制范围内。</li>
</ol>
5. 光束准直
<ol>
	<li>选择一个工作频率范围和声强与超声换能器的频率和强度相匹配的水听器。</li>
	<li>小心地将水听器探头的尖端调整至物镜视野内，并对准与样品位置相对应的位置（图4）。</li>
	<li>确保探头和换能器均浸没在去离子且脱气的水中。切勿让水听器尖端接触除水以外的任何物理物体，以免改变其涂层并影响测量结果。</li>
	<li>通过目视将换能器的声轴对准水听器探头，进行粗略预对准。确保换能器表面与水听器尖端之间的距离大致等于换能器的焦距。</li>
	<li>将水听器输出连接至示波器的一个信号输入端口。将函数发生器的同步触发信号连接至示波器的另一个输入端口。在示波器上同时显示两个信号。</li>
	<li>以较低占空比和低振幅驱动换能器，仅施加少量超声波周期，以避免损坏探头。请参考水听器制造商提供的安全操作条件，防止损坏水听器尖端。</li>
	<li>根据超声波从换能器表面传播到水听器所需的时间，调节示波器的s/格旋钮。在同步触发信号之后，于示波器上寻找水听器信号。</li>
	<li>使用电动或手动XYZ位移台缓慢调节换能器位置。将换能器固定在对应水听器信号最强的位置（图4）。 
	注意：若未检测到信号，可能是声脉冲强度过低，或声束未对准或被物体散射。应定期检查水听器与换能器是否已目视预对准，并确认声束路径中除聚酯薄膜外无气泡或其他物体存在。若仍无法检测到信号，可小幅增加输入电压以提高水听器信号的幅度。</li>
</ol>
6. 超声脉冲压力与强度的测定
<ol>
	<li>光束对准后，针对驱动换能器的不同电压，在示波器上测量水听器输出的峰峰值幅度。注意勿超过水听器制造商推荐的压力限值。</li>
	<li>使用水听器制造商提供的校准方法将这些测量值转换为压力和/或声强值。 
	注意：可以使用公式根据声压确定声强，反之亦然： 
	<img alt="强度公式 \( I = \frac{P^2}{\rho c} \)，公式 4，物理概念。" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 6"> 
	与 I 声学压力（单位：W m-2), P 声压（单位：Pa） ρ 扩繁材料的密度（1,000 kg m-3 （用于水）和 c 传播介质中的声速（对于水， c = 1,500 m s-1).</li>
	<li>使用这些测量值绘制校准曲线。 
	注意：压力 与 电压和强度 与 电压曲线分别呈线性和抛物线形状。</li>
	<li>利用相应的校准曲线确定所需驱动电压的压力和/或强度值。</li>
</ol>
7. 钙离子敏感/低强度脉冲超声活细胞荧光成像
<ol>
	<li>更换细胞的培养基为含有理想成像缓冲液 5 µM 一种可穿透细胞膜的钙离子敏感性染料（例如， Fluo-4 AM）。将培养皿置于 CO₂ 培养箱中孵育2 孵育箱于 37 °C 1小时。</li>
	<li>用不含染料的相同缓冲液小心洗涤细胞。</li>
	<li>将培养皿放入样品 holder 中。使用蓝光照明（490 nm）激发细胞，并调节激发强度和相机曝光，以避免过度漂白或像素饱和。</li>
	<li>使用所需的图像采集设置进行延时成像。采用浸没式物镜以获得更佳的图像质量，并选择长工作距离物镜以减少不必要的反射（参见 图4).</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

聚焦超声的主要优势在于能够以高时空精度非侵入性地向生物样本传递机械能和/或热能。其他旨在对细胞进行机械刺激的技术通常需要使用侵入性物理探针（例如，细胞穿刺）或依赖高能激光束与外来物体的相互作用（例如，光镊）。磁热法可对生物样本内部特定空间位置进行加热，但需要引入外来磁性纳米颗粒。另一方面，利用红外或微波激发可在水相介质中实现对小样本（例如，细胞培养物）的精确非侵入性加热17,18,19。
由于目前尚无能够将超声激励与荧光显微镜结合使用的商用系统，许多生物物理学家已针对其特定应用开发了定制化系统8,12,13,<sup class="xre...

许多疾病需要某种形式的侵入性医疗干预。这些操作通常费用昂贵、风险较高，且需要恢复期，从而加重了医疗系统的负担。非侵入性治疗手段有望为传统外科手术提供更安全、更经济的替代方案。然而，目前的非侵入性方法，如药物治疗或经颅磁刺激，往往在组织穿透深度、时空分辨率和不必要的脱靶效应之间存在权衡，因而受到限制。在此背景下，聚焦超声波作为一种有前景的非侵入性技术，能够以高时空精度调控深层组织内的生物功能，同时将脱靶效应控制在较低水平。
聚焦超声刺激是指将声能传递到生物体内部特定位置的技术。根据声脉冲参数的不同，这种能量可用于多种医学用途。例如，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准高强度聚焦超声（HiFU）用于前列腺肿瘤、引起震颤的脑区、子宫肌瘤以及骨转移中引起疼痛的神经末梢的热消融治疗1。此外，HiFU介导的微泡空化也被用于暂时性开放血脑屏障，以实现系统性给药治疗药物的靶向递送2。HiFU应用中所使用的空间峰值脉冲平均强度（Isppa）和空间峰值时间平均强度（Ispta）通常高于数kW cm-2，可产生数十MPa的脉冲压力。这些强度值远高于FDA批准的诊断超声Isppa和Ispta限值，分别为190 W cm-2和720 mW cm-23。相比之下，近期研究表明，强度在或接近诊断超声强度限值范围内的非破坏性脉冲超声刺激（LIPUS）可有效远程且安全地调控神经元放电4,5,6,7,8、激素分泌9,10以及生物工程细胞11。然而，细胞感知和响应超声的细胞与分子机制仍不明确，限制了LIPUS的临床转化。因此，近年来针对人工膜、培养细胞及动物模型的超声刺激研究逐渐增多，旨在揭示LIPUS调控的生物物理与生理过程12,13,14,15。
声音由在物理介质中传播的振动构成。超声波是指频率高于人类听觉范围的声波（即， 高于20 kHz）。在实验室环境中，超声波通常由压电换能器产生，这种换能器包含一种材料，能够在特定高频带的交变电场作用下发生振动。换能器分为两种类型：单元素换能器和换能器阵列。单元素压电换能器具有曲面结构，可起到聚焦透镜的作用，从而将声能集中到一个称为焦区的特定区域。与换能器阵列相比，单元素换能器成本更低且操作更简便。本文将重点介绍单元素换能器。
聚焦单元素换能器的焦区尺寸取决于声学透镜的几何特性及其声学频率。为了使用单元素换能器实现毫米级的焦区，通常需要兆赫兹（MHz）范围的超声频率。然而，此类频率的声波在空气等稀薄介质中传播时会迅速衰减。因此，兆赫兹级超声波必须在水等密度较高的介质中生成并传播至样品。这构成了将LIPUS模式整合到显微镜系统中的首要挑战。
第二个挑战是在声学传播路径上尽量减少声阻抗（材料密度与声波速度的乘积）不同的材料之间的物理界面。这些界面可能导致声波的反射、折射、散射和吸收，从而难以量化有效传递到样品中的声能。它们还可能产生不必要的机械伪影。例如，在声阻抗不匹配的界面处产生的垂直反射会形成反向传播的波，与正向传播的波发生干涉。在干涉路径上，这些波在某些固定的空间区域（称为波节）相互抵消，在交替出现的其他区域（称为波腹）叠加增强，形成所谓的驻波。图1）。实验人员必须能够控制或消除这些实验界面 体外 因为它们可能不存在 体内.
利用光学报告分子进行荧光检测是一种广为人知的方法，可用于实时、无创地检测透明生物样本。因此，该方法非常适合低强度脉冲超声（LIPUS）研究，因为在超声区域中引入任何物理探针都会产生机械伪影。本方案描述了将低强度脉冲超声（LIPUS）整合并应用于商用落射式荧光显微镜的实施与操作流程。

<table><tbody><tr><td>具有大工作体积的直立显微镜</td><td>Thorlabs</td><td>CERNA</td><td></td></tr><tr><td>具有大工作体积的直立显微镜</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope</td><td></td></tr><tr><td>光机械组件</td><td>Thorlabs</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>针式水听器</td><td>ONDA Corporation</td><td>HNP/C/R/A/T 系列 + AH/G 前置放大器</td><td></td></tr><tr><td>针式水听器</td><td>Precision Acoustics</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>光纤水听器</td><td>ONDA Corporation</td><td>HFO 系列</td><td></td></tr><tr><td>光纤水听器</td><td>Precision Acoustics</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Keysight Technology</td><td>DSOX2004A（4 通道 70 MHz）</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>Keysight Technology</td><td>33500B（20 MHz 单通道）</td><td></td></tr><tr><td>射频功率放大器</td><td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td><td>325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td><td></td></tr><tr><td>射频功率放大器</td><td>Electronics &amp;amp; Innovation (E&amp;amp;I)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸入式超声换能器</td><td>Olympus</td><td>聚焦浸入式换能器</td><td></td></tr><tr><td>浸入式超声换能器</td><td>Benthowave Instrument</td><td>HiFu 换能器 BII-76 系列</td><td></td></tr><tr><td>浸入式超声换能器</td><td>Precision Acoustics</td><td>压电陶瓷或 HiFu 换能器</td><td></td></tr><tr><td>浸入式超声换能器</td><td>Ultrasonic-S-lab</td><td>定制 HiFu 换能器</td><td></td></tr><tr><td>高密度 Matrigel</td><td>Corning</td><td>VWR 80094-330</td><td></td></tr><tr><td>2.5 微米厚 Mylar 薄膜</td><td>Chemplex</td><td>CAT.NO:107</td><td></td></tr></tbody></table>

多路复用聚焦超声刺激与荧光显微镜技术

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

通过聚焦能够穿透软组织的低强度超声脉冲，LIPUS 成为一种具有前景的生物医学技术，可用于远程且安全地调控神经放电、激素分泌以及基因重编程细胞。然而，目前该技术在医学应用中的转化受到阻碍，主要原因在于尚缺乏对靶向组织感知和响应 LIPUS 的生物物理机制的明确理解。识别这些机制的一个合适方法是将光学生物传感器与 LIPUS 结合使用，以揭示其潜在的信号通路。然而，在荧光显微镜系统中实施 LIPUS 时，由于物理界面的存在会导致声波的反射、吸收和折射，从而可能引入不必要的机械伪影。本文提供了一套逐步操作流程，用于将 LIPUS 整合到商用直立式落射荧光显微镜中，同时最大限度地减少声学路径中物理界面的影响。文中描述了一种简便的操作方法，用于控制单元素超声换能器，并将换能器的焦区与物镜的焦点对准。通过钙成像技术检测培养的人源胶质母细胞瘤细胞中由 LIPUS 诱导产生的钙瞬变示例，展示了 LIPUS 的应用效果。

图5 是一种将LIPUS实验与钙成像多重结合的示例。胶质母细胞瘤细胞（A-172）在涂有EMPM的聚酯膜上，使用标准培养基（添加10%血清和1%抗生素）培养，并与钙离子敏感的荧光探针Fluo-4 AM共同孵育。细胞使用10X浸没式物镜进行成像，采用白色LED光源照射，并使用标准GFP滤光片组收集荧光信号。LIPUS通过手动驱动一个4 MHz换能器施加，脉冲波形参数为158 V峰峰值幅度、0.1 ms脉冲持续时间及10 ms脉冲重复频率即， 1% 占空比）。这些参数对应于 Isppa = 88 W cm-2 （远低于190 W/cm的诊断限值）-2)我spta = 877 mW cm-2 （略高于720 mW cm的诊断限值）-2），分别。结果表明，该刺激可产生显著的钙离子升高 (图5B<...

低强度脉冲超声刺激（LIPUS）是一种用于对内源性或工程化细胞进行无创机械刺激的方法，具有高空间和时间分辨率。本文介绍了如何将LIPUS系统整合到落射荧光显微镜上，以及如何在超声传播路径中最小化声阻抗失配，以防止产生不必要的机械伪影。

通过聚焦能够穿透软组织的低强度超声脉冲，LIPUS 代表了一种具有前景的生物医学技术，可实现远程且安全的……

该方法有助于解答力学生物学中的关键问题，例如生物样本如何响应低强度超声刺激所产生的机械力。该技术的主要优势在于，它允许实验人员无创地对样本施加机械力，并实时测量各种生物学参数。首先，使用垂直台钻在标准的35毫米培养皿底部缓慢钻一个12毫米的孔。钻孔后，使用刀片去除培养皿底部附着的塑料碎片，以在外部形成光滑的表面。接着，在培养皿外底部表面涂上一层船用级环氧树脂或胶水。在粘合剂上放置一层厚度为2.5 µm的聚酯薄膜，用力按压，确保粘合剂在薄膜与厚塑料表面之间均匀分布。用手指以离心方向轻轻拉伸薄膜，以形成平整的表面。待粘合剂干燥后，用95%乙醇短暂冲洗聚酯底部培养皿。然后，将培养皿置于254纳米强紫外激发光源下进行紫外灭菌。调整持续时间和强度，使紫外线剂量达到约 330 毫焦耳每平方厘米。接下来，将市售的细胞外基质蛋白混合物与所需的培养基按 1:100 的比例稀释。在冰上操作以防止基质聚合，并迅速将 100 微升的培养基混合物滴加到聚酯膜上。将盖子重新盖回培养皿上以保持无菌状态。盖好后，将包被基质且底部为聚酯材料的培养皿置于细胞培养用的二氧化碳缓冲培养箱中，在37摄氏度下孵育6至12小时。孵育结束后，吸除多余培养基，并直接以目标密度在表面接种细胞。将一个水箱放置在直立显微镜物镜的下方。然后，使用 commercially available 光机械组件，将样品 holder 置于物镜与换能器之间。确保平移台的运动部件和驱动装置均位于水箱外部或水面以上，以避免水损。然后，在使用浸入式换能器之前，将去离子且脱气的水注入水箱，直至液面达到样品 holder 的水平面。使用非腐蚀性的市售光学机械部件，确保换能器相对于光路呈倾斜放置，以使任何反射波均被导向远离样品的方向。将函数发生器的频率调节至换能器的标称峰值频率。然后，使用函数发生器的脉冲模式，生成所需持续时间和重复频率的正弦电压脉冲。接着，将峰峰值电压调节至所需数值。确保脉冲持续时间短于两个连续脉冲之间的时间间隔。将函数发生器的输出端连接至示波器的输入端。使用示波器确认波形与所需信号一致。然后，将函数发生器的输出连接到适当尺寸的射频放大器的输入端。使用工作频率范围和声强与超声换能器相匹配的水听器探头，小心地将探头尖端移动至物镜视场内样品所在位置的焦点处。确保探头和换能器均浸没在水浴中，并通过肉眼观察，将换能器的声轴大致对准水听器探头，完成初步粗略对准。确保两者之间的距离等于换能器的焦距。除水以外，切勿让水听器的探头接触任何其他物体，以免改变其涂层并影响测量结果。接下来，将水听器的输出端连接至示波器的其中一个信号输入端口。然后，将函数发生器的同步触发信号连接到示波器的另一个输入通道，在示波器上同时显示两个信号。接下来，以较低的占空比和较低的振幅驱动换能器，施加少量超声波周期，以避免损坏探头。请查阅水听器制造商提供的安全操作条件，以避免损坏水听器探头。根据超声从换能器表面传播到水听器所需的时间，调节S-分隔旋钮。在同步触发后，于示波器上查找水听器信号。接下来，使用电动或手动的 XYZ 位移平台缓慢驱动换能器。将换能器调整至与水听器信号最大值相对应的位置。在声束已对准后，通过示波器测量换能器在不同驱动电压下水听器输出的峰峰值幅度。确保不超过水听器的压力极限。将细胞的培养基更换为含有5 µM细胞膜通透性钙离子敏感性染料（如Fluo-4 AM）的所需成像缓冲液。然后，将培养皿置于37 °C、含二氧化碳缓冲体系的培养箱中孵育1小时。孵育结束后，用不含染料的相同缓冲液小心洗涤细胞。然后，将培养皿放入样品支架中。使用490纳米的蓝光照射激发细胞。调节激发光强度和相机曝光时间，以避免过度漂白或像素饱和。使用工作距离较长的浸没式物镜进行延时成像，以获得更佳的图像质量，并减少不必要的反射。图中显示的是在经细胞外基质包被的聚酯膜上、标准培养基中培养的胶质母细胞瘤细胞。这些细胞已与一种钙离子敏感的荧光报告分子共同孵育。在此图像中，红色圆点代表通过图像处理软件识别的单个荧光细胞。经超声刺激10秒后，可在多个感兴趣区域观察到显著的钙离子水平升高。此处显示了随时间变化的被激活的感兴趣区域数量。超声激活10秒后，约70%的区域达到或超过用户设定的阈值。在进行此操作时，需注意在进行荧光测量前，应先对准超声波束。

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荧光显微镜对聚焦超声的刺激

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

我们描述了一种结合局灶性紫外光诱导激活神经活性化合物、全细胞膜片钳技术以及多光子成像的方法，用于在小鼠脑急性组织切片的海马神经元树突和树突棘中检测细胞内钠离子瞬变。...

结合紫外光介导的谷氨酸局灶性解笼技术进行CA1锥体神经元多光子细胞内钠离子成像

我们展示了一种利用荧光标记抗体的连续结合与洗脱，以单分子精度对异质纳米结构内多种分子进行成像的方法。...

使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。...

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通过与共聚焦显微镜耦合，高度聚焦的飞秒激光能够实现对细胞的精确刺激，从而实现实时观察与光刺激。该光刺激可激活细胞内的分子事件，包括ERK信号通路以及活性氧的线粒体闪光。...

飞秒激光光刺激在靶细胞中激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路或线粒体事件

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内...

利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

本文所述方案可用于表征用于超声触发药物递送应用的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 体外 和 体内...

用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

展示了一种高速开放式顶面紫外光声显微镜，该显微镜可在术中提供组织学图像，用于手术切缘分析，内容包括系统配置、光路准直、样品制备及实验操作流程。...

基于深度学习虚拟染色的高速紫外光声显微镜用于组织学成像

该方案包括换能器制造、参数报告、手术操作以及信号记录，涵盖了在自由活动小鼠中同步进行聚焦超声神经调控和光纤光度记录的整个操作流程。...

自由活动小鼠中同步进行聚焦超声神经调控与光纤光度记录

光谱迭代漂白扩展多重性（IBEX）在基础IBEX技术的基础上，增加了肝素阻断以最大限度减少非特异性结合，并利用光谱检测结合计算解混技术来抑制自发荧光。该方法可加快图像采集速度，同时降低背景信号来源，从而实现稳健的多轮、高参数空间蛋白质组分析。...

利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

学习低强度脉冲超声刺激技术，用于机械生物学研究中的细胞非侵入性力学刺激。该方法可在荧光显微镜下实时测量生物样本对机械力的响应，为研究细胞力学机制提供高时空分辨率的实验手段。

多路复用聚焦超声刺激与荧光显微镜技术

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