多路复用聚焦超声刺激与荧光显微镜技术

该方法有助于解答力学生物学中的关键问题，例如生物样本如何响应低强度超声刺激所产生的机械力。该技术的主要优势在于，它允许实验人员无创地对样本施加机械力，并实时测量各种生物学参数。首先，使用垂直台钻在标准的35毫米培养皿底部缓慢钻一个12毫米的孔。

钻孔后，使用刀片去除培养皿底部附着的塑料碎片，以在外部形成光滑的表面。接着，在培养皿外底部表面涂上一层船用级环氧树脂或胶水。在粘合剂上放置一层厚度为2.5 µm的聚酯薄膜，用力按压，确保粘合剂在薄膜与厚塑料表面之间均匀分布。

用手指以离心方向轻轻拉伸薄膜，以形成平整的表面。待粘合剂干燥后，用95%乙醇短暂冲洗聚酯底部培养皿。然后，将培养皿置于254纳米强紫外激发光源下进行紫外灭菌。

调整持续时间和强度，使紫外线剂量达到约 330 毫焦耳每平方厘米。接下来，将市售的细胞外基质蛋白混合物与所需的培养基按 1:100 的比例稀释。在冰上操作以防止基质聚合，并迅速将 100 微升的培养基混合物滴加到聚酯膜上。

将盖子重新盖回培养皿上以保持无菌状态。盖好后，将包被基质且底部为聚酯材料的培养皿置于细胞培养用的二氧化碳缓冲培养箱中，在37摄氏度下孵育6至12小时。孵育结束后，吸除多余培养基，并直接以目标密度在表面接种细胞。

将一个水箱放置在直立显微镜物镜的下方。然后，使用 commercially available 光机械组件，将样品 holder 置于物镜与换能器之间。确保平移台的运动部件和驱动装置均位于水箱外部或水面以上，以避免水损。

然后，在使用浸入式换能器之前，将去离子且脱气的水注入水箱，直至液面达到样品 holder 的水平面。使用非腐蚀性的市售光学机械部件，确保换能器相对于光路呈倾斜放置，以使任何反射波均被导向远离样品的方向。

将函数发生器的频率调节至换能器的标称峰值频率。然后，使用函数发生器的脉冲模式，生成所需持续时间和重复频率的正弦电压脉冲。接着，将峰峰值电压调节至所需数值。

确保脉冲持续时间短于两个连续脉冲之间的时间间隔。将函数发生器的输出端连接至示波器的输入端。使用示波器确认波形与所需信号一致。

然后，将函数发生器的输出连接到适当尺寸的射频放大器的输入端。使用工作频率范围和声强与超声换能器相匹配的水听器探头，小心地将探头尖端移动至物镜视场内样品所在位置的焦点处。确保探头和换能器均浸没在水浴中，并通过肉眼观察，将换能器的声轴大致对准水听器探头，完成初步粗略对准。

确保两者之间的距离等于换能器的焦距。除水以外，切勿让水听器的探头接触任何其他物体，以免改变其涂层并影响测量结果。接下来，将水听器的输出端连接至示波器的其中一个信号输入端口。

然后，将函数发生器的同步触发信号连接到示波器的另一个输入通道，在示波器上同时显示两个信号。接下来，以较低的占空比和较低的振幅驱动换能器，施加少量超声波周期，以避免损坏探头。

请查阅水听器制造商提供的安全操作条件，以避免损坏水听器探头。根据超声从换能器表面传播到水听器所需的时间，调节S-分隔旋钮。在同步触发后，于示波器上查找水听器信号。

接下来，使用电动或手动的 XYZ 位移平台缓慢驱动换能器。将换能器调整至与水听器信号最大值相对应的位置。在声束已对准后，通过示波器测量换能器在不同驱动电压下水听器输出的峰峰值幅度。

确保不超过水听器的压力极限。将细胞的培养基更换为含有5 µM细胞膜通透性钙离子敏感性染料（如Fluo-4 AM）的所需成像缓冲液。然后，将培养皿置于37 °C、含二氧化碳缓冲体系的培养箱中孵育1小时。孵育结束后，用不含染料的相同缓冲液小心洗涤细胞。

然后，将培养皿放入样品支架中。使用490纳米的蓝光照射激发细胞。调节激发光强度和相机曝光时间，以避免过度漂白或像素饱和。

使用工作距离较长的浸没式物镜进行延时成像，以获得更佳的图像质量，并减少不必要的反射。图中显示的是在经细胞外基质包被的聚酯膜上、标准培养基中培养的胶质母细胞瘤细胞。这些细胞已与一种钙离子敏感的荧光报告分子共同孵育。

在此图像中，红色圆点代表通过图像处理软件识别的单个荧光细胞。经超声刺激10秒后，可在多个感兴趣区域观察到显著的钙离子水平升高。此处显示了随时间变化的被激活的感兴趣区域数量。

超声激活10秒后，约70%的区域达到或超过用户设定的阈值。在进行此操作时，需注意在进行荧光测量前，应先对准超声波束。