用奇米蛋白构建功能蛋白区的鉴定

交换结构上相似的蛋白质区域来产生基梅拉，使我们能够研究负责分子生物功能的区域的重要性。区域交换是蛋白质的一般二级结构，因此该区域对蛋白质整体结构的重要结构可以与直接调解生物功能的二级结构区分开来。它可以转换为选择要替换的确切区域。

从较大的交换开始通常有助于识别蛋白质的关键功能。要开始该程序，请选择合适的蛋白质作为捐赠者，以交换与文本协议中详述的感兴趣的蛋白质的区域。然后，首先访问 ref seq网页中的基因部分，从参考序列数据库中获取接受者和供体蛋白质的蛋白质氨基酸序列。

在搜索框中键入感兴趣的蛋白质的名称，然后单击搜索。单击结果列表中所需物种的基因名称。向下滚动到 ref seq 部分以查看所有记录的等值形式。

单击感兴趣的等式序列标识符。向下滚动并单击 CD 以突出显示基因的蛋白质编码区域。在屏幕的右下角，单击 FAFSDA 并复制基因序列。

使用合适的DNA编辑软件保存DNA序列。使用免费可用的 APE 时，打开程序，将复制的序列粘贴到空白框中，选择序列名称，然后单击"保存"。现在，选择在不同的基美利构造中要替代的蛋白质区域，首先将感兴趣的蛋白质序列划分在不同的结构区域。

为此，请从PDBe网站下载感兴趣的蛋白质的结构数据。访问蛋白质的 PDBe 页面，通过单击屏幕右侧的下载下载来下载 PDBe 文件。在分子可视化系统中打开 PDBe 文件，如 Pymol。

在Pymol中，显示核苷酸序列，隐藏默认结构数据并选择卡通视图，以清楚地显示蛋白质的结构特征。单击屏幕顶部的核苷酸序列以突出显示分子的不同部分，注意与每种独特结构特征对应的氨基酸。现在，通过打开DNA序列，选择它，点击 ORF 翻译，对 APE 中 DNA 序列中不同的结构区域进行注释，然后单击第一个区域的最后一个氨基酸，以突出显示其在 DNA 序列中的位置，并选择该区域的核苷酸编码。

右键单击所选内容并选择新功能，为其命名和颜色。对上一步中标识的每个结构区域重复此过程。为了对齐两种蛋白质的残余序列，首先，获取APE中供体和受体蛋白的完整氨基酸序列。

和以前一样，打开捐赠者 DNA 序列，选择它，然后单击 ORF 翻译。然后，访问Clustal欧米茄网页，然后把两种蛋白质的氨基酸序列。每个序列应按一条文本行进行，该文本行应正确识别蛋白质名称。

向下滚动并单击"提交"。通过单击下载对齐文件选项卡检索对齐文件并保存它。此文件可由任何文本编辑程序打开。

使用对齐文件作为参考，注释其DNA序列中供体蛋白质的相应结构区域。创建受体蛋白的带注释DNA序列的副本，并将其重命名为基美蛋白。在 APE 中打开重命名的 DNA 序列。

选择在供体蛋白中交换的区域，然后在重命名的受体蛋白中选择相应的区域。粘贴供体蛋白DNA序列，然后保存变化。使用 DNA 编辑器（如 APE）设计终端底像。

创建新的 DNA 文件，使用前线序列启动端端底转。其次是在向量MCS中选择的第一个限制位点和在感兴趣的基因的初始18至27个碱基对中选择的可选分空间。在新的DNA文件中，设计C终端底转序列，从感兴趣的基因的最终18到27个碱基对开始，然后是可选的分位空间、选择的第二个限制位点和领导序列。

突出显示整个序列，右键单击，并选择反向恭维以获取反向底图。现在，为基梅里奇构造中每个边界区域设计底木。在 kimera 的 DNA 序列中，突出显示原始序列和插入序列接触的区域中的 30 个碱基对区域。

这由每个序列中的 15 个基对组成。复制该区域，并将其粘贴到新的 DNA 文件中。此序列将是前进底图。

复制上一步生成的前进底像，并将其重命名为反向底项。突出显示底转序列，右键单击，并选择反向恭维以生成反向底转序列。对基美脱氧核酸序列中的每个接触区重复这些步骤。

通常，需要两组正向反向底转才能生成一个 kimera，除非更换发生在 N 端子或 C 终端区域。为组成基美蛋白的每个片段准备单独的PCR反应混合物。首先在冰上设置一点五毫升微注入管，然后按文本协议中列出的顺序对PCR混合物的不同试剂进行移液。

确保每个 PCR 反应都使用正确的底向和模板。标记两个薄壁零点两个毫升PCR管每个反应，并转移20微升的相应PCR混合物在每个管。将 PCR 管传输到 PCR 热循环器中，并启动文本协议中详细说明的协议。

PCR反应完成后，在每个管中加入四个微升的六个xDNA加载缓冲液。将 1% 的 agaross 凝胶插入电泳单元中，并盖上 TAE 缓冲液。小心地将样品与分子量一起装入凝胶中。

在以 80 至 120 伏运行凝胶 20 至 45 分钟后，关闭电泳单元并取出前毛凝胶。在紫外光下可视化放大的DNA波段。使用剃须刀刀片，从凝胶中切出单个DNA片段，并转移到标有两个民兵微注入管。

使用 PCR 清理套件净化 DNA 片段后，通过测量光谱仪中 260 纳米和 340 纳米样品的吸光度来量化提取的 DNA 量。现在，执行PCR扩增以生成基美脱DNA序列。首先，设置50微升的PCR反应，以熔合基梅拉的单独成分一样， 像以前一样。

使用 N 端子和 C 端子底像以及每个放大 DNA 片段的 10 纳米图。恢复和量化纯化DNA片段一样，在30微升的原子核自由水。此片段包含由终端底像中包含的限制位点所侧侧的 kimeric DNA 序列。

一代基美尔蛋白的例子是两个成员之间的卢克和六个西托金家族。白血病抑制因子中的上质M。OSM 提升 kimera 是 OSM 的 BC 环路区域与相应的提升序列交换的结果。

第一个PCR扩增步骤由三个独立的反应组成。N 终端 OSM 片段，需要 N 终端 OSM 转发和 BC 启动反向源使用 OSM 作为模板。利用 LIF 作为模板，通过 BC 开始向前和 BC N 反向底转获得 LIF BC 环路。

C 终端 OSM 片段使用 BC 端前和 C 终端 OSM 反向底转以及 OSM 作为模板。然后，这些纯化片段在第二次PCR反应中用作模板，同时使用N-终端OSM前进和C-终端OSM反向源器，以放大相应的OSM LIF BC环路基因序列。在纯化和转化为电子大肠杆菌后，通过限制性酶消化分离和筛选单个质粒，以正确插入DNA片段。

凝胶电泳显示阳性命中，然后发送序列验证。基默尔蛋白质必须产生，活动在一个完美的派系系统中测量。为了确定被替换区域对该特定派别的重要性。

该技术已非常有用，并经常应用，干扰信号受体，以识别关键功能域和受体识别位点。我用于DNA电泳的号码应该使用一次性手套、实验室外套和防护眼镜处理。