双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

为了全面表征小胶质细胞表型，必须同时研究其基础运动性和趋化性运动。本方案可用于通过双光子成像技术，在小鼠脑切片中利用定制的3D打印接口和灌流室检测小胶质细胞的趋化性运动。本实验操作由本实验室的博士研究生Fanny Etienne和博士后研究员Vincenzo Mastriolia进行示范。

解剖前至少30分钟，开始将70毫升胆碱人工脑脊液（choline aCSF）在冰上通气。加入150毫升32摄氏度、含碳氧混合气体（carbogen）的胆碱aCSF。将一个带有磁力搅拌子的200毫升结晶皿放入密封的食品盒中，并向皿内加入200毫升aCSF。

将一个3D打印的界面切片架放置在培养皿上方，并去除结晶皿中多余的液体，直至仅剩一层薄薄的溶液覆盖在界面载片架的网格上。在食物盒底部加入几毫米的aCSF，并用碳合气（carbogen）对液体进行鼓泡。然后，在持续通入碳合气的同时封闭密封盒，以创建一个湿润、含有95%氧气和5%二氧化碳的界面培养室。

收获后，将脑组织置于经 aCSF 浸润的滤纸上，根据所需的切片角度分离出目标脑区。对于冠状切片，将脑组织的尾侧面向下放置并用胶固定在连接振动切片机切块装置的 10 厘米培养皿上，再将切块装置置于充满冰块的大腔室内的振动切片机储液槽中。向培养皿中加入冰冻的胆碱 aCSF，并使用振动切片机切出厚度为 300 微米的脑片，每次刀片通过后，用直径为 4 毫米的一次性移液管收集每一片脑片。

每片切片获取后，在32摄氏度的胆碱aCSF中恢复约10分钟，然后将切片转移至镜片清洁纸上，纸面上预先滴加一滴胆碱aCSF。随后吸除多余的胆碱aCSF，并用刮铲将切片转移至界面式孵育室的网格上，使其在此环境中至少恢复30分钟。开始记录前30分钟，将蠕动泵连接至定制的记录室，该记录室具备顶部和底部灌流功能，以优化组织切片的氧合状态和存活率，并用50毫升超纯水清洗整个灌流系统。

清洗循环结束后，开始用50毫升盛放在玻璃烧杯中的aCSF对记录室进行灌流，该aCSF需持续通入碳合气（carbogen）；使用一次性宽口移液管将第一片待成像的脑片转移至烧杯中，以去除滤纸。当脑片沉入烧杯底部后，将其转移至记录室，并将脑片固定器置于脑片上，以最大限度减少灌流液流速引起的脑片移动。使用明场照明，在5至10倍放大倍数下定位目标脑区。

然后，使用25倍物镜和0.35倍水浸镜头调整视野位置。利用荧光照明定位荧光标记的小胶质细胞，并用含有目标化合物（终浓度）的10微升aCSF回填移液管。将移液管尖端朝下并轻轻振荡，以去除尖端内可能存在的气泡，随后将装填好的移液管安装至移液管架上，该移液管架连接一个5毫升注射器，推杆置于5毫升刻度位置，并将整个装置固定在三轴显微操作器上。

轻轻将移液管向切片方向移动，同时控制并调节物镜，直至移液管尖端轻轻接触切片表面。现在调节激光器，并将显微镜切换至多光子模式。确保成像腔室避光，并打开非扫描探测器。

设置增益，并使用带有颜色编码上限的查找表，以避免图像中像素饱和。然后开始记录，总时长至少为30分钟；在开始5分钟后，用5秒时间缓慢推动注射器活塞，从5毫升位置推至1毫升位置，将化合物施加到切片上。进行图像分析时，首先在目标文件上使用ImageJ进行z轴投影和漂移校正。

然后，在 Icy 中打开修改后的文件，并在注射位点中心绘制一个直径为 35 微米的圆形感兴趣区域。使用该感兴趣区域重新运行视频，以确保其位置准确。接着，使用感兴趣区域强度变化插件测量该区域内随时间变化的平均强度，并将结果保存为 xls 文件。

本方案可用于检测不同化合物（如ATP或5-羟色胺）所诱导的反应。尽管ATP注射会引发荧光增强，但在大多数ATP注射后，由于组织形变，荧光会出现立即的轻微下降，数分钟后恢复。兴趣区域的大小也会影响定量结果：增大直径可降低实验间的变异性，但会降低检测到的反应的准确性和幅度。

在特定时间点评估小胶质细胞反应，可用于不同化合物之间的统计学比较，或用于检测添加至灌注液中的特定拮抗剂的作用效果。为了在三维空间中量化细胞运动性，需注意可能需要调整z轴步进间隔和采集采样率，以满足分析要求。