Name: 微胶质过程对急性脑片 atp 或血清素的双光子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习利用双光子显微镜对小鼠急性脑片中的微胶质细胞进行实时成像，以研究ATP和血清素等信号分子诱导的方向性运动。该方法为神经免疫学研究提供了重要的技术框架。

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我们感谢巴黎铁匠研究所的细胞与组织成像中心，所有图像的采集与分析均在此完成。本研究部分得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（Inserm）、索邦大学科学部以及索邦大学—皮埃尔与玛丽·居里大学（Emergence-UPMC 2011/2014 计划）、脑科学研究基金会、法国基金会、法国医学研究基金会&#34;FRM 团队项目 DEQ2014039529&#34;、法国科研部（法国国家科研署 ANR-17-CE16-0008 及“未来投资”计划&#34;Bio-Psy Labex&#34; ANR-11-IDEX-0004-02）以及计算神经科学合作研究项目（美国国家科学基金会/法国国家科研署，编号：1515686）的资助。所有作者均隶属于巴黎神经科学学院（ENP）和 Bio-Psy Labex 的成员研究团队。F.E. 是法国巴黎索邦大学博士学院（F-75005）的博士研究生，由 Bio-Psy Labex 提供经费支持。V.M. 是计算神经科学合作研究项目（美国国家科学基金会/法国国家科研署，编号：1515686）资助的博士后研究员。作者感谢 Marta Kolodziejczak 对本项目启动阶段的参与。

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<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li>
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<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
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<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过保持脑组织的结构完整性并仅进行有限的网络调整，与解离培养或器官型脑片培养不同，急性脑片使研究人员能够在接近生理环境的条件下研究小胶质细胞。然而，其主要局限性之一在于切片过程本身会造成损伤，这些损伤可能迅速影响神经元的存活，尤其是在成年脑组织中。由于小胶质细胞对细胞损伤具有高度反应性，因此尽可能减少神经元死亡对于维持小胶质细胞接近其生理状态至关重要。这也进一步有助于 通过 良性循环，有助于切片整体状态的改善。
本文所述方案结合了文献中报道的多项电生理实验改进措施，旨在提高脑片在数小时内的存活率，尤其是成年小鼠脑片的存活率。为克服与年龄相关的脑片存活能力差异，我们在心脏灌注、脑片切割及恢复阶段均以胆碱替代钠离子，并使用胆碱-aCSF溶液，从而将细胞兴奋性毒性降至最低29,30需要注意的是，除了胆碱型人工脑脊液（choline-aCSF）之外，还有许多其他高效用于神经元保护的人工脑脊液配方，例如N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）-aCSF<sup c...

小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞，在生理和病理条件下均发挥重要作用1,2它们具有高度分支的形态，并不断延伸和回缩其突起。3,4。这个 &#34;扫描&#34; 行为被认为与其周围环境的探测相关且必要。小胶质细胞的形态可塑性表现为三种模式。第一，某些化合物可快速调节小胶质细胞形态：添加ATP5,6 或NMDA5,7 在灌注急性脑切片的培养基中，去甲肾上腺素减少小胶质细胞分支的复杂性，而其他因素增加其分支复杂性6这些效应要么由小胶质细胞受体直接介导（如ATP和去甲肾上腺素），要么需要神经元释放ATP（如NMDA）。其次，小胶质细胞突起的生长与回缩速度，称为运动性或 &#34;监测&#34;，可能受到细胞外因素的影响8，稳态失衡9,10，或突变9,10,11第三，除了上述形态和运动性的各向同性变化外，小胶质细胞还能够将突起定向地伸向释放ATP的移液管3,5,12,13,14在培养中、急性脑切片中或在体条件下，或在急性脑切片中递送5-HT15小胶质细胞突起的这种定向生长，也称为方向性运动，最初被描述为对局部激光损伤的一种反应3,4因此，从生理学角度来看，它可能与损伤后的反应有关，或在发育过程中将小胶质细胞突起定向至需要突触修剪或脑区修剪的部位所必需15,16，或在生理条件下17,18,19 或病理情况9,18,19,20 在成年期。这三种形态学变化依赖于不同的细胞内机制11,13,20，且一种给定的化合物不一定能调节所有这些方面（例如，NMDA 间接作用于小胶质细胞，可影响其形态，但不会诱导定向运动）5,7因此，在研究化合物、基因突变或病理状态对小胶质细胞的影响时，对小胶质细胞形态可塑性的三个组成部分进行表征至关重要。本文描述了一种研究小胶质细胞突起向局部化合物源（此处为ATP或5-HT）定向生长的方法。
研究小胶质细胞突起趋化性的模型有多种：三维环境中的原代培养6,18,19、急性脑切片6,13,15&#160;以及活体成像3,13。其中，活体研究方法最能保持小胶质细胞的生理状态。然而，对深层脑区进行活体成像需要复杂的外科手术操作，因此通常仅限于表层皮质区域。使用小胶质细胞原代培养是最简便的技术，可在动物使用数量有限的情况下测试大量实验条件。但该方法无法获得与活体内相同的细胞形态，且细胞会失去与神经元和星形胶质细胞的生理相互作用。急性脑切片则介于上述两种方法之间，是一种折中方案。该模型使研究人员能够研究那些在活体内难以到达或高分辨率成像的脑区结构，并可用于研究新生期阶段的脑组织切片，而经颅显微镜技术通常仅用于成年个体。此外，该方法还可在使用较少动物的前提下，实现实验的重复，并实时观察局部药物应用所产生的效应。然而，急性脑切片的一个问题是细胞存活时间较短（仅数小时），特别是来自出生两周以上小鼠的脑切片，且小胶质细胞形态可能随时间发生改变21,22。
本文介绍了一种制备出生至两个月龄的幼年及成年 Cx3cr1GFP/+ 小鼠急性脑切片的方案，可在数小时内保持小胶质细胞的形态和运动能力。随后，我们描述了如何利用这些脑切片研究小胶质细胞突起向三磷酸腺苷（ATP）或5-羟色胺（5-HT）等化合物的趋化性反应。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;用于移液器准备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>克拉克硼硅酸盐薄壁毛细管</td><td>哈佛仪器</td><td>30-0065</td><td>硼硅酸盐薄壁毛细管（无细丝），外径1.5 mm，内径1.17 mm，长度75 mm，每包225支</td></tr><tr><td>DMZ 通用拉马</td><td>Zeitz Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>氯化胆碱</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1 M 氯化镁溶液（MgCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 SigmaUltra &gt;99.0%（KCl）</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>MilliQ</td><td></td><td>所有溶液</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于切片制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2个200 mL结晶皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 mL Pyrex烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antlia-3C 数字蠕动泵</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td><td>小鼠灌注与双光子成像腔室灌注（aCSF）</td></tr><tr><td>Carbogen 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Air Liquide France Industrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dolethal</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal 50 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>滤纸（Whatman）</td><td>Sigma</td><td>WHA1001042</td><td>Whatman 定性滤纸，1 级（孔径：11&amp;micro;M</td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锐利</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-60</td><td></td></tr><tr><td>食品盒，直径10 cm，高8 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶水（氰基丙烯酸乙酯）</td><td>Loctite</td><td>超级胶水 3 代强力柔韧型</td><td></td></tr><tr><td>海马体解剖刀（刮匙）</td><td>Fine Science Tools</td><td>10099-15</td><td>最大的肢体必须成90度角&amp;deg;</td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊（弯型）</td><td>Moria</td><td>MC31</td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁纸</td><td>THOR LABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙网筛</td><td></td><td></td><td>直径7厘米</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72000</td><td>对于切片机</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片界面固定装置</td><td></td><td></td><td>自制，3D打印文件见补充材料</td></tr><tr><td>手术剪 - 锐头</td><td>精细科学工具</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>720-2709</td><td>型号：HM 650V（振动切片机）</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td>设定为32 &amp;deg;C（第一次回收步骤）</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于切片成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;times; 25倍，数值孔径0.95，水浸物镜</td><td>徕卡显微系统（德国）</td><td>HCX Irapo</td><td></td></tr><tr><td>配备共振扫描器（8 kHz）和两个HyD混合探测器的2光子MP5直立显微镜</td><td>徕卡显微系统（德国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antlia-3C 数字蠕动泵</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td><td>用于2光子成像室的aCSF灌流</td></tr><tr><td>Carbogen 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Air Liquide France Industrie</td><td>I1501L50R2A001</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra2 钛宝石激光器</td><td>Coherent（德国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管，宽口</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>例如：232-11</td><td>5.8 mL，带鳍状尖端，但我们将其截短（约7 cm），使口径为4 mm</td></tr><tr><td>发射滤光片 SP680</td><td>徕卡显微系统（德国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含525/50发射滤光片和560二向色滤光片的荧光立方体（用于荧光收集）</td><td>徕卡显微系统公司（德国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>装有50 mL ACSF的玻璃烧杯，用于维持脑片的持续灌流</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热系统</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>自动加热控制器 TC-324B</td><td>以保持灌注液温度在32 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>灌流室</td><td></td><td></td><td>自制，3D打印文件见补充材料</td></tr><tr><td>切片架（&quot;竖琴&quot;)</td><td></td><td></td><td>自制：由铂金制成的发夹，两个分支通过平行的尼龙线连接</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于切片刺激 &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;prime;三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma</td><td>A-26209</td><td>现配：实验当天配制 1 mg/mL (3 mM) 储存液，4 ℃ 保存 &amp;deg;C（数小时）并在使用前立即稀释</td></tr><tr><td>荧光素（可选）</td><td>Sigma</td><td>F-6377</td><td>使用于 1 &amp;micro;M 终浓度</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Luigs and Neumann</td><td>SM7</td><td>连接至微移液器支架</td></tr><tr><td>微量移液器架</td><td></td><td></td><td>与电生理学相同</td></tr><tr><td>盐酸血清素</td><td>Sigma</td><td>H-9523</td><td>50 mM 储存液的等分试样（溶于 H）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 保存在 -20 &amp;deg;C. 500 &amp;micro;实验当天配制的 M 溶液。</td></tr><tr><td>5 mL 注射器（无针头）</td><td>泰尔茂医疗产品</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>透明管</td><td>Fischer Scientific</td><td>11750105</td><td>圣戈班高性能塑料&amp;trade; Tygon&amp;trade; E-3603 非DEHP管路</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于图像分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td>Schindelin, J. 等, Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td></tr><tr><td>冰冷</td><td>巴斯德研究所</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org</td><td>de Chaumont, F. 等. Nat. Methods (2012)</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-GFP 小鼠</td><td>Jung 等，2000</td><td></td><td>雄性或雌性，P3至2月龄；我们已将这些小鼠回交至129sv背景。</td></tr><tr><td>CX3CR1creER-YFP 小鼠</td><td>Parkhurst 等，2013</td><td></td><td>雄性或雌性，出生后第3天至2月龄；我们已将这些小鼠在129sv遗传背景下进行了回交。</td></tr></tbody></table>

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对atp或5-羟色胺的趋化反应

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

小胶质细胞是大脑中常驻的固有免疫细胞，它们不断利用其长突起扫描周围环境，并在稳态受到干扰时迅速发生形态学改变。例如，激光损伤可在数分钟内诱导小胶质细胞突起朝向损伤部位的定向生长，这一现象也称为&#34;定向运动性&#34;。类似效应也可通过局部递送三磷酸腺苷（ATP）或5-羟色胺（5-羟基色胺[5-HT]）实现。本文描述了一种在幼年和成年小鼠急性脑片中诱导小胶质细胞突起朝向ATP或5-HT局部施加部位定向生长的实验方案，并利用双光子显微镜对这一趋化吸引过程进行时间序列成像。同时提出了一种使用免费开源图像分析软件进行定量分析的简便方法。急性脑片研究仍面临的一个挑战是细胞维持生理状态的时间有限，且该时间随动物年龄增长而缩短。因此，本方案强调了一些旨在提高小胶质细胞在数小时内（尤其是成年小鼠脑片中）存活率的技术改进措施，包括灌流液成分优化、气-液界面式孵育 chamber 以及配备双通道灌流系统的成像 chamber。

本方案描述了一种在幼年或成年（至少两个月龄以内）小鼠的急性脑切片中诱导、观察和定量小胶质细胞突起朝向局部施加的化合物（例如ATP或5-HT）定向生长的方法。为了使成年动物的脑切片在数小时内保持健康状态，本方案采用了两种工具，分别在两个步骤中优化细胞存活。首先，界面式切片槽（图1）中的界面切片架可在切片完成后改善切片的保存状态。其次，记录槽（图2）配备灌流系统，可在成像过程中使人工脑脊液（aCSF）同时从切片的上方和下方流过。此处使用的记录槽尺寸设计为适配标准显微镜，其外形与传统的浴槽插入件类似（外径为62 mm）；但由于其模型可从补充材料中下载，因此设计可根据需要调整，以适配其他尺寸的切片槽。需要注意的是，每个槽均由两个完全匹配的部件组装而成，无需使用胶水，中间夹有一层拉伸的聚酰胺网。
为了在小范围内递送 A...

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

小胶质细胞是大脑中常驻的固有免疫细胞，它们通过其细长的突起持续监测周围环境，一旦环境稳态受到破坏……

为了全面表征小胶质细胞表型，必须同时研究其基础运动性和趋化性运动。本方案可用于通过双光子成像技术，在小鼠脑切片中利用定制的3D打印接口和灌流室检测小胶质细胞的趋化性运动。本实验操作由本实验室的博士研究生Fanny Etienne和博士后研究员Vincenzo Mastriolia进行示范。解剖前至少30分钟，开始将70毫升胆碱人工脑脊液（choline aCSF）在冰上通气。加入150毫升32摄氏度、含碳氧混合气体（carbogen）的胆碱aCSF。将一个带有磁力搅拌子的200毫升结晶皿放入密封的食品盒中，并向皿内加入200毫升aCSF。将一个3D打印的界面切片架放置在培养皿上方，并去除结晶皿中多余的液体，直至仅剩一层薄薄的溶液覆盖在界面载片架的网格上。在食物盒底部加入几毫米的aCSF，并用碳合气（carbogen）对液体进行鼓泡。然后，在持续通入碳合气的同时封闭密封盒，以创建一个湿润、含有95%氧气和5%二氧化碳的界面培养室。收获后，将脑组织置于经 aCSF 浸润的滤纸上，根据所需的切片角度分离出目标脑区。对于冠状切片，将脑组织的尾侧面向下放置并用胶固定在连接振动切片机切块装置的 10 厘米培养皿上，再将切块装置置于充满冰块的大腔室内的振动切片机储液槽中。向培养皿中加入冰冻的胆碱 aCSF，并使用振动切片机切出厚度为 300 微米的脑片，每次刀片通过后，用直径为 4 毫米的一次性移液管收集每一片脑片。每片切片获取后，在32摄氏度的胆碱aCSF中恢复约10分钟，然后将切片转移至镜片清洁纸上，纸面上预先滴加一滴胆碱aCSF。随后吸除多余的胆碱aCSF，并用刮铲将切片转移至界面式孵育室的网格上，使其在此环境中至少恢复30分钟。开始记录前30分钟，将蠕动泵连接至定制的记录室，该记录室具备顶部和底部灌流功能，以优化组织切片的氧合状态和存活率，并用50毫升超纯水清洗整个灌流系统。清洗循环结束后，开始用50毫升盛放在玻璃烧杯中的aCSF对记录室进行灌流，该aCSF需持续通入碳合气（carbogen）；使用一次性宽口移液管将第一片待成像的脑片转移至烧杯中，以去除滤纸。当脑片沉入烧杯底部后，将其转移至记录室，并将脑片固定器置于脑片上，以最大限度减少灌流液流速引起的脑片移动。使用明场照明，在5至10倍放大倍数下定位目标脑区。然后，使用25倍物镜和0.35倍水浸镜头调整视野位置。利用荧光照明定位荧光标记的小胶质细胞，并用含有目标化合物（终浓度）的10微升aCSF回填移液管。将移液管尖端朝下并轻轻振荡，以去除尖端内可能存在的气泡，随后将装填好的移液管安装至移液管架上，该移液管架连接一个5毫升注射器，推杆置于5毫升刻度位置，并将整个装置固定在三轴显微操作器上。轻轻将移液管向切片方向移动，同时控制并调节物镜，直至移液管尖端轻轻接触切片表面。现在调节激光器，并将显微镜切换至多光子模式。确保成像腔室避光，并打开非扫描探测器。设置增益，并使用带有颜色编码上限的查找表，以避免图像中像素饱和。然后开始记录，总时长至少为30分钟；在开始5分钟后，用5秒时间缓慢推动注射器活塞，从5毫升位置推至1毫升位置，将化合物施加到切片上。进行图像分析时，首先在目标文件上使用ImageJ进行z轴投影和漂移校正。然后，在 Icy 中打开修改后的文件，并在注射位点中心绘制一个直径为 35 微米的圆形感兴趣区域。使用该感兴趣区域重新运行视频，以确保其位置准确。接着，使用感兴趣区域强度变化插件测量该区域内随时间变化的平均强度，并将结果保存为 xls 文件。本方案可用于检测不同化合物（如ATP或5-羟色胺）所诱导的反应。尽管ATP注射会引发荧光增强，但在大多数ATP注射后，由于组织形变，荧光会出现立即的轻微下降，数分钟后恢复。兴趣区域的大小也会影响定量结果：增大直径可降低实验间的变异性，但会降低检测到的反应的准确性和幅度。在特定时间点评估小胶质细胞反应，可用于不同化合物之间的统计学比较，或用于检测添加至灌注液中的特定拮抗剂的作用效果。为了在三维空间中量化细胞运动性，需注意可能需要调整z轴步进间隔和采集采样率，以满足分析要求。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

微胶质过程对急性脑片 atp 或血清素的双光子成像

我们描述了一种用于反复观察小鼠小胶质细胞和循环单核细胞的方法 体内...

一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术 体内 神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

来源：Etienne, F. et al. 急性脑切片中通过双光子成像观察小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化性。J. Vis. Exp.

双光子显微镜用于研究小胶质细胞突起在小鼠脑切片中向化合物的趋化性

来源： Maruoka, H., et. al. 清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。J. Vis. Exp. (2022)...

在清醒小鼠中同步成像小胶质细胞动态与神经元活动

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内...

小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGluu 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS...

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

我们描述了一种在小鼠前脑器官型脑片培养物中实现基因编码的基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK细胞类型特异性表达的实验方案。此外，我们展示了如何利用该传感器对神经元和星形胶质细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。...

使用基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK对小鼠脑组织切片中细胞内ATP进行成像

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

序列双光子断层成像（STPT）是一种结合双光子成像、自动载物台控制和切片机切片技术，用于以三维形态对大体积组织进行成像的技术。本文介绍了一种应用于狨猴脑组织的STPT实施方案，旨在更深入地理解其结构特征。...

用于神经解剖学分析的整个狨猴脑串行双光子断层成像

学习利用双光子显微镜对小鼠急性脑片中的微胶质细胞进行实时成像，以研究ATP和血清素等信号分子诱导的方向性运动。该方法为神经免疫学研究提供了重要的技术框架。

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

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