通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含RNA（TERRA）的癌细胞克隆构建

该方法有助于回答有关端粒的关键问题，例如酵母端粒非编码RNA TERRA的定位，以及我能够确定其来源于端粒本身还是反式作用的其他染色体区域。该技术的主要优势在于，它使研究人员能够在活细胞中可视化来自单个端粒的TERRA分子的表达。本次实验操作将由我实验室的两名研究生Claudio Oss Pegorar和Nicole Bettin进行演示。首先，根据文本方案培养AGS细胞。

当细胞生长至50%至60%融合度时，用表达sgRNA Cas9的载体和MS2盒进行转染。次日，将培养基更换为含有新霉素的培养基。随后，向96孔板的每孔中加入10 µL 0.25%胰蛋白酶。

使用显微镜和标记笔，在培养皿中标记出每个可见克隆的位置。用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）替换新霉素培养基，使液体在克隆表面形成一层薄层。使用含有5微升胰蛋白酶的10微升移液器，缓慢将胰蛋白酶释放到克隆上。

让胰蛋白酶作用一分钟以使细胞脱落。用枪头刮取细胞集落，并将其吸入枪头中。随后，将集落中的细胞转移至96孔板的一个孔中。

将培养板在室温下孵育五分钟。然后向孔中加入150微升选择性培养基。接着，向三个96孔板的每个孔中加入100微升明胶。

将培养板在室温下孵育30分钟，并用PBS洗涤培养板两次。当细胞克隆达到90%融合度时，吸去培养板各孔中的培养基，并用PBS洗涤培养板。然后向每孔加入30 µL胰蛋白酶，于37°C孵育5分钟。

接下来，向每个孔中加入 70 微升选择性培养基。通过反复吹打使细胞分散。取 30 微升混合液转移至含有 120 微升选择性培养基的明胶化 DNA 板的孔中。

然后将30 µL混合物转移至含有50 µL培养基的明胶包被冻存板中。将DNA放入培养箱，使细胞在37°C条件下培养至90%融合度。此后，向冻存板的每个孔中加入80 µL预冷的冻存培养基。

用封口膜密封培养板，盖上盖子，并用铝箔纸包裹培养板。然后将培养板置于 -80 摄氏度保存。当 DNA 板中的克隆达到 90% 汇合度时，用 PBS 洗涤培养板两次。

然后用 50 µL 裂解缓冲液裂解细胞。用封口膜覆盖板孔，盖上盖子，并用保鲜膜包裹整块板。随后，将板在 37 °C 下孵育过夜。

第二天，向每个孔中加入 100 微升乙醇氯化钠溶液，在室温下静置 6 小时或过夜以沉淀 DNA。然后将板倒置，并用 200 微升 70% 乙醇每孔洗涤三次。向板的每个孔中加入 20 微升 RNase A 溶液，在 37 摄氏度孵育 1 小时。

此后，取3 µL基因组DNA进行PCR扩增，并设置PCR仪程序。根据文本方案，将PCR阳性克隆在6孔板中培养。当克隆细胞融合度达到90%时，用PBS洗涤细胞，每孔加入250 µL含蛋白酶K的裂解缓冲液。

使用细胞刮刀刮取细胞，并将裂解液转移至1.5毫升离心管中。在37°C条件下孵育裂解液16小时。向裂解液中加入1毫升乙醇，并剧烈振荡。

根据文本方案，让克隆在F-12K培养基中生长。当细胞达到70%融合度时，向细胞中加入表达Cre的腺病毒。感染后48小时，将细胞分种到三个10厘米的培养皿中。

然后培养第三套培养皿用于细胞冻存和RNA提取。首先，将TERRA-MS2克隆和野生型AGS细胞接种至玻璃底培养皿中。随后向培养基中加入Polybrene和表达MS2-GFP的逆转录病毒。

24 小时后弃去含有逆转录病毒的培养基，向细胞中加入不含酚红的新鲜培养基。最后，使用倒置显微镜和高灵敏度相机，选择合适的物镜和光圈对细胞进行成像。本方案中构建并成像了在单个端粒附近带有 MS2 序列标签的癌细胞克隆。

使用PCR筛选新霉素抗性克隆。将阳性克隆进行培养并裂解，以提取基因组DNA并进行Southern印迹分析。对PCR和Southern印迹分析均呈阳性的克隆，用表达CRE-GFP的腺病毒进行感染，以去除MS2盒中含有的新霉素基因。

在确认新霉素抗性基因已被消除后，提取各克隆的RNA，检测TERRA-MS2转录本的表达情况。为了通过共聚焦显微镜在活细胞中观察TERRA-MS2转录本，将筛选出的克隆感染表达MS2-GFP融合蛋白的逆转录病毒。在选定的克隆中，通过共表达MS2-GFP融合蛋白和与mCherry荧光蛋白融合的端粒结合蛋白TRF2，可在活细胞中利用共聚焦显微镜同时观察TERRA-MS2转录本和端粒结构。

在进行该实验操作时，务必尽可能选择单个克隆，而非混合的克隆群体。完成该操作后，可采用其他方法（如染色体铺展上的DNA FISH），以在固定细胞中观察MS2盒的整合情况。该技术建立后，有望为端粒领域的研究人员探索活体人细胞中单个端粒TERRA分子的细胞定位提供新的途径。

请务必注意，操作病毒载体和放射性材料可能存在极大的不确定性。进行本实验时，应始终采取预防措施，例如穿戴实验服、手套，并使用有机玻璃屏蔽板以尽量减少辐射暴露。