Name: 从活细胞中的单端粒表达的癌症细胞克隆的生成, 以可视化含有端粒重复的 rna terra (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解如何在活细胞中可视化单个端粒来源的TERRA转录本。本方案使用AGS癌细胞和MS2标记系统，通过CRISPR-Cas9技术实现单端粒TERRA的实时成像，为端粒生物学研究提供新工具。

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我们感谢特伦托大学CIBIO先进影像中心以及维也纳马克斯·F·佩鲁茨实验室（MFPL）生物光学显微镜设施的工作人员。本研究工作获得了Mahlke-Obermann基金会以及欧盟第七框架计划（研究、技术发展与示范项目）的资助，项目编号为609431，授予EC。EC还获得了意大利教育大学与研究部（MIUR） Rita Levi Montalcini博士后奖学金的支持。

1 . 新霉素抗性克隆的筛选
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（每毫升培养基0.5单位）和链霉素（0.2 &#181;g 每毫升培养基）于 37 &#176;C 和 5% CO₂2以 1:10 的摩尔比将 sgRNA/Cas9 表达载体与 MS2 盒式元件共同转染至汇合度为 50–60% 的细胞中21. 
	注意：在平行实验中，通过转染表达GFP的载体来验证转染效率（即， Cas9-GFP 载体）。转染效率应达到至少 60-70%。</li>
	<li>次日，将培养基更换为含有0.7 mg/mL新霉素的培养基 &#181;g/mL 终浓度（选择性培养基）。 
	注意：转染后的第二天将细胞分装并接种至选择性培养基中，可加快筛选进程。所有未转染的细胞将立即死亡。若转染在6孔板中进行，则每孔在60%汇合度时约含有0.7 × 10⁶个细胞。6&#160;细胞，次日可将细胞从单孔转移至含选择性培养基的10 cm培养皿中进行传代。</li>
	<li>将细胞置于选择性培养基中培养7-10天，每1至2天更换一次培养基，直至可见单个克隆。</li>
	<li>细胞克隆的挑选
	<ol>
		<li>准备一个96孔板，每孔含有10 &#181;每孔加入0.25%胰蛋白酶L。 
		注意：若预计挑选的克隆数超过96个，请准备两块96孔板。</li>
		<li>使用显微镜观察10 cm培养皿，用记号笔在皿底对每个可见克隆的位置进行标记，每个点对应一个待挑选的菌落。</li>
		<li>更换培养基，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS），仅需在克隆表面形成一层薄液膜，避免细胞在挑取克隆过程中干燥。</li>
		<li>使用10挑取单个菌落 &#181;L 移液器。将含有 5 的吸头连接 &#181;向克隆中加入适量胰蛋白酶，缓慢释放胰蛋白酶使其局限在克隆区域。作用1分钟使细胞脱落，然后用移液枪头轻轻刮取克隆，并将细胞吸至枪头中。 
		注意：在该操作过程中，将培养皿略微倾斜一侧以减少待挑选克隆周围 PBS 的体积，可避免胰蛋白酶在克隆周围被稀释，从而有助于挑选操作。使用克隆环也有助于挑取单个克隆。</li>
		<li>将菌落中的细胞放入含有10 μL培养基的96孔板的一个孔中 &#181;0.25% 胰蛋白酶 L</li>
		<li>室温孵育 5 分钟，然后用 150 &#181;L 选择性培养基（Ham's F-12K (Kaighn's) 培养基，添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（每毫升培养基 0.5 单位）、链霉素（0.2 &#181;g 每毫升培养基，并含有浓度为 0.7 的新霉素 &#181;g/mL 
		注意：在孵育期间可同时挑选其他克隆。建议尽可能多地挑选克隆，挑选的克隆数量越多，越有可能鉴定出阳性克隆。</li>
		<li>待所有克隆挑取并转移至96孔板后，将细胞置于含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（0.5单位/毫升培养基）、链霉素（0.2 &#181;g 每毫升培养基，并含有浓度为 0.7 的新霉素 &#181;g/mL&#160;37℃ &#176;C 和 5% CO₂2，直至达到90%汇合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆的分离
	<ol>
		<li>准备三块经明胶包被的96孔板，每孔加入100 &#181;每孔加入 L 培养明胶，室温孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。这些培养板将用于 DNA 提取（DNA 板）和克隆冻存（冻存板）。 
		注意：明胶可促进细胞和DNA在孔中的附着。特别是，在DNA提取和洗涤步骤（下文将讨论）期间，明胶包被有助于DNA黏附于孔底。在克隆分选操作过程中，建议使用多通道移液器。</li>
		<li>当克隆细胞达到90%融合度时，从96孔板的每孔中吸除培养基，用PBS洗涤，每孔加入30 μL胰蛋白酶 &#181;每孔加入 0.25% 胰蛋白酶 L，于 37℃ 培育 5 分钟 &#176;C. 
		注意：克隆的生长速度各不相同，且取决于每个克隆挑选的细胞数量。因此，该步骤将在不同克隆陆续达到90%汇合度的数天内分批进行。</li>
		<li>加入 70 &#181;每孔加入适量选择性培养基，通过在孔内反复吹打使细胞团块分散，然后转移30 &#181;100 分之 L &#181;加入120微升至预先装有凝胶化DNA的培养板中 &#181;每孔加入 L 的选择性培养基，并加入 30 &#181;L 到预装有 50 的明胶化冷冻板 &#181;L 培养基（不含筛选剂）</li>
		<li>将 DNA 板放入培养箱中，使细胞在 37 °C 下生长 &#176;C 和 5% CO₂2 直至90%汇合度。</li>
		<li>加入80 &#181;将1 mL预冷的新鲜配制的2倍冻存液（80% FBS和20%二甲基亚砜（DMSO））加入冻存板的每孔中，用70%乙醇喷洒的封口膜覆盖在板上以密封各孔，盖上盖子，并用铝箔纸包裹整个冻存板。将冻存板置于-80 ℃条件下保存。 &#176;C.</li>
		<li>加入90 &#181;每孔加入适量选择性培养基至原96孔板中，该孔板含有已传代的克隆，继续培养直至获得PCR筛选结果。此孔板将用作备份板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 新霉素抗性克隆的筛选
<ol>
	<li>从96孔DNA板中提取DNA。
	<ol>
		<li>当 DNA 培养板中的克隆生长至 90% 汇合度时，用 PBS 洗涤 2 次，然后加入 50 &#181;L 裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.5，10 mM EDTA，10 mM NaCl，0.5% SDS 和 1 mg/mL 蛋白酶 K）。用封口膜覆盖板子，密封每个孔，盖上盖子，再用保鲜膜包裹，置于 37 ℃ &#176;C 过夜。</li>
		<li>加入100 &#181;加入 100 µL 冷乙醇（Et-OH）/NaCl 溶液（100% 乙醇中含 0.75 M NaCl）至各孔，室温下沉淀 6 小时或过夜。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
		<li>倒置培养板以去除 Et-OH/NaCl 溶液，并用 200 μL 洗涤液洗涤 3 次 &#181;每孔加入 L 的 70% 乙醇。</li>
		<li>加入25 &#181;在蒸馏水中加入 RNAse A 溶液，终浓度为 L，37℃孵育 &#176;1 小时，37°C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 3 &#181;L 的基因组 DNA 用于 PCR 扩增。使用在新霉素抗性基因和 15q 亚端粒区内部结合的引物，对所选克隆进行 PCR 筛选。采用标准的聚合酶酶和 PCR 方案进行 PCR 扩增。21. 
	注意：MS2引物（MS2-subtel15q-primer-S和MS2 primer AS）及CTR引物（CTR prime S和CTR primer AS）的PCR反应条件如下：98 &#176;C，20 秒，作为变性步骤，然后进行 34 个循环：98 &#176;C 10 秒，58&#176;C 20 秒，72 &#176;C 15 秒，使用聚合酶酶在 25 &#181;L反应混合液（参见 材料表。引物序列见于 表 1.</li>
	<li>在琼脂糖凝胶上进行PCR反应，并使用标准的凝胶回收程序从阳性克隆中回收获得的PCR条带（参见 材料表 用于凝胶回收试剂。</li>
	<li>对凝胶回收的PCR产物进行DNA测序分析，以确认MS2序列的存在21. 
	注意：测序分析可使用PCR筛选所用的引物进行。</li>
	<li>PCR阳性克隆的Southern印迹筛选
	<ol>
		<li>将经PCR和测序筛选呈阳性的克隆（来自原始96孔板的备份板）接种于6孔板中，使用添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（0.5单位/毫升培养基）、链霉素（0.2 &#181;g/mL 培养基）并含有 0.7 mg/mL 新霉素 &#181;g/mL&#160;37℃ &#176;C 5% CO2. 
		注意：或者，如果部分克隆已丢失，可从冻存板中选择一块进行复苏（参见方案 2.6）。</li>
		<li>当克隆在6孔板中达到90%融合度时，用PBS洗涤细胞，并加入250 &#181;含有 0.5 的裂解缓冲液 L &#181;每孔加入蛋白酶K。</li>
		<li>使用细胞刮刀刮取细胞，并将裂解液转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>37℃孵育 &#176;16 小时，4°C</li>
		<li>加入1 mL 100%乙醇，剧烈振荡，于-20℃放置至少2小时或过夜，使DNA沉淀 &#176;C. 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
		<li>在 4 °C 下以 13,400 x g 离心 &#176;室温下以70%乙醇洗涤沉淀。弃去上清液后，将沉淀在室温下晾干。也可使用真空浓缩仪。</li>
		<li>将DNA沉淀重悬于50 μL水中。 &#181;含 RNAse A 的 1 升蒸馏水，37 ℃孵育 1 小时 &#176;C.</li>
		<li>消化 5-10 &#181;使用 NcoI 和 BamHI 限制性内切酶（两次独立的消化反应）对 100 微克基因组 DNA 进行消化 &#181;37℃孵育消化反应，在L反应体系中进行 &#176;C 过夜。</li>
		<li>运行 4 &#181;在琼脂糖凝胶（0.8% 琼脂糖）上进行消化产物的电泳，以确认完全消化。</li>
		<li>加入1/10体积的3 M、pH 5.2乙酸钠溶液和2体积的100%乙醇至限制性酶切反应体系中，于-20℃孵育至少2小时或过夜&#176;C 以沉淀 DNA。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
		<li>在 4 °C 下以 13,400 x g 离心 &#176;室温下离心20分钟，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。将沉淀在室温下空气干燥。或者，可使用真空浓缩仪干燥。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 20 &#181;加入适量蒸馏水，并将消化后的 DNA 加载至 0.8% 琼脂糖凝胶上。 
		注意：为了获得更好的DNA消化片段分辨率，应制备至少15 cm长的凝胶，并在低电压下过夜电泳 &#820;30 伏特）。电泳装置应进行优化。</li>
		<li>次日，使用DNA标记试剂（如溴化乙锭）对凝胶进行染色，浓度为1 &#181;L/10 mL 终浓度，室温孵育 30 分钟，使用凝胶成像仪拍摄凝胶照片，并将尺子置于凝胶旁。</li>
		<li>将DNA转移至尼龙膜，并使用标准方法用特异性针对MS2序列的探针进行膜杂交21.</li>
		<li>解冻两个冻存板中其中一个经PCR、DNA测序和Southern印迹鉴定为阳性的克隆（见下一步）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆的解冻
	<ol>
		<li>准备一个15 mL离心管，其中含有5 mL预热的Ham's F-12K（Kaighn's）培养基，添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（0.5单位/毫升培养基）和链霉素（0.2 &#181;每克培养基需加入 g（每毫升培养基）以解冻每个克隆。</li>
		<li>从-80℃取出一个冻存板&#176; 并加入100 &#181;将预热的 F12K 完全培养基加入含有待复苏阳性克隆的孔中。 
		注意：此操作应迅速进行，每解冻一个克隆后，应立即将96孔板放置于干冰上，以确保其他克隆保持冷冻状态。若需从同一96孔板中解冻多个克隆，此步骤尤为重要。</li>
		<li>将细胞转移至含有5 mL培养基的15 mL离心管中，在室温下以800 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸弃培养基，将细胞重悬于 500 &#181;将预热的完全F12K培养基加入各克隆中，每克隆转移至12孔板中的单个孔内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消除整合在15q亚端粒区MS2盒中的新霉素抗性基因
	<ol>
		<li>让克隆在完全F12K培养基中从12孔板扩增至10 cm培养皿中生长。 
		注意：除非另有说明，培养基中不应添加新霉素。</li>
		<li>将表达 Cre 的腺病毒加入到 10 cm 培养皿中处于 70% 汇合度的细胞中，培养基为 10 mL 完全 F12K 培养基。 
		注意：使用表达 Cre-GFP 的腺病毒可评估感染效率，感染效率应接近 100%。复制缺陷型腺病毒在培养传代数次后将丢失。</li>
		<li>感染后48小时，将细胞分至三个10 cm培养皿中。其中两个培养皿用于验证新霉素基因的去除：一个培养皿通过在含新霉素的培养基中培养细胞进行负筛选验证，另一个培养皿用于Southern印迹分析。</li>
		<li>培养第三皿含有克隆的细胞，用于细胞冻存和RNA提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过RT-qPCR验证TERRA-MS2转录本的表达
<ol>
	<li>在确认新霉素基因被移除后，使用有机溶剂（苯酚和异硫氰酸胍溶液）从TERRA-MS2克隆中提取总RNA21.
	<ol>
		<li>将从10 cm培养皿中提取的RNA重悬于100 μL中 &#181;二乙基焦碳酸酯（DEPC）水 L</li>
		<li>运行 3 &#181;在含1%甲醛的1×3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）变性凝胶上电泳1 μL RNA，以检测RNA的浓度和完整性。同时使用分光光度计分析RNA浓度。</li>
		<li>处理 3 &#181;g RNA，使用60单位DNAse I酶进行DNAse I处理 &#181;L 最终反应体积。</li>
		<li>在37℃下孵育反应1小时 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录反应与qPCR分析
	<ol>
		<li>向无核酸酶的微量离心管中加入以下组分：2 &#181;1 L 的 &#181;M TERRA 特异性引物，1 &#181;L 的 dNTP 混合物（各 10 mM），6 &#181;经DNAse I处理的RNA的L（对应于） &#820;300 ng RNA）。将体积调至 13 &#181;L 与 4 &#181;DEPC 水 L 
		注意：对于每个待分析的RNA，应准备第二个含有相同试剂的试管，但使用参考特异性引物代替TERRA特异性引物。</li>
		<li>将混合物加热至 65 &#176;5分钟内降至室温，并在冰上孵育至少1分钟。</li>
		<li>通过短暂离心收集各管中的内容物，并加入4 &#181;5X RT酶缓冲液L，1 &#181;0.1 M 二硫苏糖醇（DTT），1 &#181;L（4单位）RNase抑制剂，以及1 &#181;L 逆转录酶（参见 材料表).</li>
		<li>将样品在 42 ℃ 孵育 &#176;60 分钟，然后使用 2 &#181;用于 qPCR 分析的 RT 反应的 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备qPCR反应体系，终体积为20 μL &#181;L 由 10 组成 &#181;2 微升 2x qPCR 预混液，2 &#181;cDNA模板L，1 &#181;L 的正向引物（10 &#181;M），1 &#181;L 反向引物（10 &#181;M）和6 &#181;升水</li>
	<li>使用标准方案在热循环仪中进行qPCR反应21.</li>
</ol>
4. 表达 MS2-GFP 的逆转录病毒的制备
<ol>
	<li>为生成表达 MS2-GFP 的逆转录病毒，将 80% 汇合度的 phoenix 包装细胞转染含有表达 MS2-GFP 融合蛋白的逆转录病毒载体（pBabe-MS2-GFP PURO）以及一个 环境 基因表达载体（如 pCMV-VSVG），两种载体的摩尔比为 4:1。</li>
	<li>次日，将培养基（含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM）更换为含有10 mM丁酸钠的新鲜培养基。</li>
	<li>在37℃孵育8小时 &#176;C，5% CO2然后更换为新鲜的培养基，用于收集病毒。</li>
	<li>48 小时后，从 phoenix 细胞中移除含有逆转录病毒的培养基。该培养基可直接用于 TERRA-MS2 克隆的感染；若如此操作，需将培养基通过 0.45 μm 滤器过滤。 &#181;m 滤器，加入聚比烯（30 &#181;g/mL 终浓度）并加入细胞中（在此情况下，本方案继续进行至步骤 5）。或者，可通过向 50 mL 离心管中加入 1/5 体积th 50% PEG-8000/900 mM NaCl 溶液的体积，并在 4 ℃下过夜孵育 &#176;在旋转轮上。</li>
	<li>次日，于 2,000 x g 离心 30 分钟以沉淀逆转录病毒颗粒，弃上清，将沉淀重悬于不含血清的 F12K 培养基中。 
	注意：病毒颗粒可在1/100体积中重悬th 原始上清液体积的一部分。应进行感染测试，以确定有效感染细胞所需的逆转录病毒的最小体积。</li>
</ol>
5. 活细胞中 TERRA-MS2 转录本的可视化
<ol>
	<li>将 TERRA-MS2 克隆细胞和野生型 AGS 细胞接种于玻璃底培养皿中。在感染当天，向培养基中加入聚凝胺（终浓度为 30 µg/mL）和表达 MS2-GFP 的逆转录病毒。</li>
	<li>24 小时后，弃去含病毒的培养基，更换为不含酚红的新鲜培养基。</li>
	<li>在倒置显微镜下使用合适的显微镜设置对细胞进行分析。采用高数值孔径（1.4X）的 100X 或 60X 物镜和高灵敏度相机（EMCCD）进行成像。使用环境控制系统，在成像过程中维持样品温度为 37 °C 和 5% CO2&#160;。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益

本文介绍一种生成含MS2序列的人类癌细胞克隆的方法，其中MS2序列已整合至15q亚端粒区域。利用这些克隆，可通过共表达MS2-GFP融合蛋白，利用荧光显微镜检测由15q亚端粒转录的MS2标记的TERRA分子。该方法使研究人员能够在活细胞中研究来自单个端粒的TERRA动态行为21。在本实验方案中，TERRA-MS2克隆选自AGS细胞系，该细胞系是研究TERRA的一个理想模型系统，因为TERRA在人类胃癌样本中的表达水平上调24。然而，本文所述方案可经调整后适用于其他细胞系中TERRA-MS2克隆的筛选。原则上，通过使用特异性的MS2表达盒和CRISPR策略，可将MS2序列整合至除15号染色体端粒以外的其他亚端粒区域。本方法中采用Cas9切口酶（nickase）和双导向RNA，以提高整合的特异性22。采用该策略，在AGS细胞中预计可鉴定出约2%的阳性克隆。也可尝试测试其他类型的Cas9酶，以提高克隆筛选的成功率25。此外，为最大化克隆筛选效率，需特别注...

长链非编码RNA TERRA从染色体的端粒近端区域转录，其转录方向朝向染色体末端，并在端粒重复序列区域内终止1,2因此，TERRA 转录本的5'端包含由亚端粒区衍生而来的序列，并以端粒重复序列（在脊椎动物中为UUAGGG）结尾3TERRA 被认为在端粒处的异染色质形成中发挥重要作用4,5DNA复制6促进染色体末端之间的同源重组7,8,9，调控端粒结构10端粒长度稳态2,11,12,13此外，TERRA 转录本与小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）中大量端粒外位点相互作用，从而调控广泛的基因表达14与这些证据一致，RNA 荧光 原位 杂交（RNA-FISH）分析表明，仅有一部分TERRA转录本定位于端粒1,2,15此外，有报道称TERRA可在小鼠细胞中形成定位于X和Y染色体的核内聚集体2,16这些发现表明，TERRA 转录本在细胞核内经历复杂的动态变化。解析 TERRA 分子的动态特性将有助于阐明其功能及作用机制。
MS2-GFP 系统已被广泛用于在多种生物的活细胞中可视化 RNA 分子17,18。该系统先前已被用于标记并可视化酿酒酵母（S. cerevisiae）中的单个端粒 TERRA 分子12,19。利用该系统，最近的研究发现酵母 TERRA 转录本在双相生长转换后期定位于细胞质中，提示 TERRA 可能具有细胞核外功能20。我们近期已使用 MS2-GFP 系统在癌细胞中研究单个端粒的 TERRA 转录本21。为此，我们采用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将 MS2 序列整合至单个端粒（15号染色体长臂端粒，以下简称 Tel15q），并获得了表达 MS2 标记的内源性 Tel15q TERRA 的克隆（TERRA-MS2 克隆）。通过共表达一种与 GFP 融合的 MS2 RNA 结合蛋白（MS2-GFP），该蛋白可识别并结合 MS2 RNA 序列，从而实现在活细胞中对单个端粒 TERRA 转录本的可视化21。本方案的目的是详细描述生成 TERRA-MS2 克隆所需的各个步骤。
为构建TERRA-MS2克隆，需将MS2表达盒整合至15q端粒的亚端粒区，位于TERRA启动子区域及其转录起始位点的下游。该MS2表达盒包含一个两侧带有lox-p位点的新霉素抗性基因，其在15q亚端粒区的整合通过CRISPR/Cas9系统完成22。转染MS2表达盒后，筛选单克隆，并通过PCR、DNA测序和Southern印迹法验证表达盒在亚端粒区的正确整合。对阳性克隆感染表达Cre重组酶的腺病毒，以去除表达盒中的筛选标记，仅保留MS2序列和一个lox-p位点于15q亚端粒区。通过RT-qPCR验证来自Tel15q的MS2标记TERRA转录本的表达。最后，通过逆转录病毒感染在TERRA-MS2克隆中表达MS2-GFP融合蛋白，从而利用荧光显微镜观察MS2标记的TERRA转录本。使用端粒重复序列特异性探针，可通过RNA-FISH和活细胞成像清晰检测到TERRA转录本1,2,15,23。这些方法可在单细胞分辨率下提供TERRA分子总体定位的重要信息。在单一亚端粒区域含有MS2序列的克隆构建成功后，研究人员将能够研究活细胞中单个端粒来源的TERRA转录本的动态行为，从而有助于阐明TERRA的功能及其作用机制。

<table><tbody><tr><td>AGS细胞</td><td>-</td><td>-</td><td>Christian Baron（Universit&amp;eacute; 德蒙特&amp;eacute;等）</td></tr><tr><td>F12K 营养混合物 1X</td><td>GIBCO</td><td>21127022</td><td>AGS细胞培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>CORNING</td><td>MT25005CI</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>CORNING</td><td>30-002-CI</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>GIBCO</td><td>21068028</td><td>phoenix细胞培养基</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>用于凤凰细胞转染</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）和逆转录病毒沉淀</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>用于Phoenix细胞转染（HBS溶液）</td></tr><tr><td>1×胰蛋白酶EDTA溶液</td><td>CORNING</td><td>59430C</td><td>用于细胞传代</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190250</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>细胞冻存液组分（80% FBB 和 20% DMSO）</td></tr><tr><td>G-418 硫酸二氢盐</td><td>福麦迪亚</td><td>G4185</td><td>筛选药物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>明胶溶液 生物试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>96孔DNA板的封板与冻存</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher BioReagents</td><td>10376743</td><td>基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71729</td><td>基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM2546</td><td>基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>RNA酶A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12091021</td><td>DNA 提取过程中的 RNA 降解</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>DNA凝胶制备</td></tr><tr><td>Atlas ClearSight</td><td>Bioatlas</td><td>BH40501</td><td>用于在琼脂糖凝胶中检测DNA和RNA样品的染色试剂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP28184</td><td>DNA沉淀</td></tr><tr><td>乙酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td>用于在3M浓度、pH 5.2条件下进行DNA沉淀</td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>从琼脂糖凝胶中提取PCR片段以进行新霉素阳性克隆的PCR筛选</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>AMBION</td><td>15596018</td><td>用于RNA提取的有机溶剂</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89836</td><td>基因组DNA从RNA中的降解&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dNTPs 混合物</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>用于逆转录和PCR反应</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>707265ML</td><td>用于RT反应</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>用于以1:1000稀释度使水中的RNase失活</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EO0381</td><td>RNase 抑制剂</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9381</td><td>RNA凝胶的制备</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td>变性RNA凝胶的制备（含1% PFA的1x MOPS）</td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>逆转录反应</td></tr><tr><td>Pfu DNA聚合酶（重组）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EP0501</td><td>PCR反应</td></tr><tr><td>2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td><td>PCR BIOSYSTEMS</td><td>PB 20.14</td><td>qPCR 反应</td></tr><tr><td>Cre-GFP 腺病毒</td><td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td><td>1174-HT</td><td>用于感染 TERRA-MS2 克隆以去除 neomycn 基因</td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td>用于促进Phoenix细胞中逆转录病毒颗粒的产生</td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>逆转录病毒颗粒的沉淀</td></tr><tr><td>35&amp;micro;玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>用于TERRA-MS2克隆的活细胞成像分析</td></tr></tbody></table>

通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含rna（terra）的癌细胞克隆构建

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

端粒被转录产生含有端粒重复序列的长链非编码RNA（TERRA），据认为其在端粒生物学中发挥重要作用，包括异染色质形成和端粒长度稳态的调控。最新研究发现，TERRA分子还可与染色体内部区域相互作用，从而调控小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中的基因表达。与此证据一致，RNA荧光 原位 杂交（RNA-FISH）分析表明，仅有一部分TERRA转录本定位于染色体末端。深入理解TERRA分子的动态行为将有助于阐明其功能及作用机制。本文介绍了一种利用MS2-GFP系统在癌细胞中标记并可视化单个端粒TERRA转录本的方法。为此，我们提供了一项实验方案，以AGS人胃癌细胞系为例，构建稳定克隆，使其在单一亚端粒区整合MS2序列。当带有MS2标签的端粒转录产生TERRA时，会表达出带有MS2标签的TERRA分子；通过共表达与GFP融合的MS2 RNA结合蛋白（MS2-GFP），可在活细胞荧光显微镜下观察到这些分子。该方法使研究人员能够研究癌细胞中单个端粒来源TERRA分子的动态变化，并可推广应用于其他细胞系。

关键词：TERRA转录本，端粒，MS2-GFP系统，活细胞成像，RNA-FISH，AGS细胞系，染色体末端，单分子标记

图 1 展示了实验策略的总体概述。图中显示了在 AGS 细胞中生成 TERRA-MS2 克隆的主要实验步骤及相应的时间安排（图 1A）。第 1 天，将 MS2 插入片段（cassette）和表达 sgRNA/Cas9 的载体共转染至 6 孔板的多个孔中（如 图 1B 所示）。两条不同的 15q 端粒近端特异性引导 RNA 序列被克隆至表达 Cas9 切口酶的 pX335 载体中，生成两种 sgRNA-pX335 载体，并与 MS2 插入片段共同转染。6 孔板中的一个孔可转染表达 GFP 的载体，以验证转染效率。第 2 天，细胞经胰酶消化后，从单个孔转移至含筛选培养基的 10 cm 培养皿中。第 3 天更换培养基，此时大多数未转染的细胞已死亡。细胞在筛选培养基中持续培养，直至可见单克隆形成并可用于挑取。在此...

本文介绍一种在单个亚端粒区域插入MS2序列标签以生成癌细胞克隆的实验方案。该方法基于MS2-GFP系统，可在活细胞中实现对单个端粒来源的端粒重复序列包含RNA（TERRA）内源性转录本的可视化观察。

通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含RNA（TERRA）的癌细胞克隆构建

端粒被转录后产生含有端粒重复序列的长链非编码RNA（TERRA），据推测在……中发挥重要作用

该方法有助于回答有关端粒的关键问题，例如酵母端粒非编码RNA TERRA的定位，以及我能够确定其来源于端粒本身还是反式作用的其他染色体区域。该技术的主要优势在于，它使研究人员能够在活细胞中可视化来自单个端粒的TERRA分子的表达。本次实验操作将由我实验室的两名研究生Claudio Oss Pegorar和Nicole Bettin进行演示。首先，根据文本方案培养AGS细胞。当细胞生长至50%至60%融合度时，用表达sgRNA Cas9的载体和MS2盒进行转染。次日，将培养基更换为含有新霉素的培养基。随后，向96孔板的每孔中加入10 µL 0.25%胰蛋白酶。使用显微镜和标记笔，在培养皿中标记出每个可见克隆的位置。用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）替换新霉素培养基，使液体在克隆表面形成一层薄层。使用含有5微升胰蛋白酶的10微升移液器，缓慢将胰蛋白酶释放到克隆上。让胰蛋白酶作用一分钟以使细胞脱落。用枪头刮取细胞集落，并将其吸入枪头中。随后，将集落中的细胞转移至96孔板的一个孔中。将培养板在室温下孵育五分钟。然后向孔中加入150微升选择性培养基。接着，向三个96孔板的每个孔中加入100微升明胶。将培养板在室温下孵育30分钟，并用PBS洗涤培养板两次。当细胞克隆达到90%融合度时，吸去培养板各孔中的培养基，并用PBS洗涤培养板。然后向每孔加入30 µL胰蛋白酶，于37°C孵育5分钟。接下来，向每个孔中加入 70 微升选择性培养基。通过反复吹打使细胞分散。取 30 微升混合液转移至含有 120 微升选择性培养基的明胶化 DNA 板的孔中。然后将30 µL混合物转移至含有50 µL培养基的明胶包被冻存板中。将DNA放入培养箱，使细胞在37°C条件下培养至90%融合度。此后，向冻存板的每个孔中加入80 µL预冷的冻存培养基。用封口膜密封培养板，盖上盖子，并用铝箔纸包裹培养板。然后将培养板置于 -80 摄氏度保存。当 DNA 板中的克隆达到 90% 汇合度时，用 PBS 洗涤培养板两次。然后用 50 µL 裂解缓冲液裂解细胞。用封口膜覆盖板孔，盖上盖子，并用保鲜膜包裹整块板。随后，将板在 37 °C 下孵育过夜。第二天，向每个孔中加入 100 微升乙醇氯化钠溶液，在室温下静置 6 小时或过夜以沉淀 DNA。然后将板倒置，并用 200 微升 70% 乙醇每孔洗涤三次。向板的每个孔中加入 20 微升 RNase A 溶液，在 37 摄氏度孵育 1 小时。此后，取3 µL基因组DNA进行PCR扩增，并设置PCR仪程序。根据文本方案，将PCR阳性克隆在6孔板中培养。当克隆细胞融合度达到90%时，用PBS洗涤细胞，每孔加入250 µL含蛋白酶K的裂解缓冲液。使用细胞刮刀刮取细胞，并将裂解液转移至1.5毫升离心管中。在37°C条件下孵育裂解液16小时。向裂解液中加入1毫升乙醇，并剧烈振荡。根据文本方案，让克隆在F-12K培养基中生长。当细胞达到70%融合度时，向细胞中加入表达Cre的腺病毒。感染后48小时，将细胞分种到三个10厘米的培养皿中。然后培养第三套培养皿用于细胞冻存和RNA提取。首先，将TERRA-MS2克隆和野生型AGS细胞接种至玻璃底培养皿中。随后向培养基中加入Polybrene和表达MS2-GFP的逆转录病毒。24 小时后弃去含有逆转录病毒的培养基，向细胞中加入不含酚红的新鲜培养基。最后，使用倒置显微镜和高灵敏度相机，选择合适的物镜和光圈对细胞进行成像。本方案中构建并成像了在单个端粒附近带有 MS2 序列标签的癌细胞克隆。使用PCR筛选新霉素抗性克隆。将阳性克隆进行培养并裂解，以提取基因组DNA并进行Southern印迹分析。对PCR和Southern印迹分析均呈阳性的克隆，用表达CRE-GFP的腺病毒进行感染，以去除MS2盒中含有的新霉素基因。在确认新霉素抗性基因已被消除后，提取各克隆的RNA，检测TERRA-MS2转录本的表达情况。为了通过共聚焦显微镜在活细胞中观察TERRA-MS2转录本，将筛选出的克隆感染表达MS2-GFP融合蛋白的逆转录病毒。在选定的克隆中，通过共表达MS2-GFP融合蛋白和与mCherry荧光蛋白融合的端粒结合蛋白TRF2，可在活细胞中利用共聚焦显微镜同时观察TERRA-MS2转录本和端粒结构。在进行该实验操作时，务必尽可能选择单个克隆，而非混合的克隆群体。完成该操作后，可采用其他方法（如染色体铺展上的DNA FISH），以在固定细胞中观察MS2盒的整合情况。该技术建立后，有望为端粒领域的研究人员探索活体人细胞中单个端粒TERRA分子的细胞定位提供新的途径。请务必注意，操作病毒载体和放射性材料可能存在极大的不确定性。进行本实验时，应始终采取预防措施，例如穿戴实验服、手套，并使用有机玻璃屏蔽板以尽量减少辐射暴露。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

从活细胞中的单端粒表达的癌症细胞克隆的生成, 以可视化含有端粒重复的 rna terra

本方案描述了从肌肉或皮肤组织中分离活细胞并建立成肌细胞和成纤维细胞原代培养体系的技术。同时介绍了一种使这些细胞系永生化的方法。总体而言，这些方案为获取和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。...

从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

端粒和端粒酶在衰老和肿瘤发生中发挥着关键作用。本实验方案的目标是展示如何构建两种可诱导的小鼠端粒酶敲入等位基因，并说明如何利用这些模型研究组织退化/再生以及癌症。...

利用小鼠可诱导端粒酶等位基因研究组织退变/再生与癌症

本文介绍了一种长期延时显微镜方法，用于纵向追踪单个细胞对抗癌治疗药物的反应。...

透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

我们报道了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的生殖腺和胚胎中进行荧光原位杂交（FISH）的简明实验流程，用于观察和定量重复序列。...

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我们成功将标准的端粒重复扩增方案（TRAP）检测改造为可用于微滴数字聚合酶链式反应。这种新检测方法称为ddTRAP，具有更高的灵敏度和定量能力，可更有效地检测多种人类细胞中的端粒酶活性，并进行更可靠的统计分析。...

液滴数字TRAP（ddTRAP）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

本方案描述了一种从悬浮生长的癌细胞中生成胞质杂交细胞的技术，可用于研究线粒体在肿瘤发生过程中的作用。...

利用癌细胞系生成线粒体杂交细胞

我们介绍一种研究肿瘤细胞从肺转移灶重新扩散的方法，该方法包括一种选择性光转化肺转移灶的手术方案，随后在三级器官中鉴定重新扩散的肿瘤细胞。...

利用光转换技术追踪肺转移灶中肿瘤细胞的播散

本报告介绍了一种生物工程技术，用于设计和构建新型人工剪接因子（ASFs），以特异性调控哺乳动物细胞中靶基因的剪接过程。该方法可进一步拓展，用于构建多种人工因子，以操控RNA代谢的其他方面。...

在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

了解如何在活细胞中可视化单个端粒来源的TERRA转录本。本方案使用AGS癌细胞和MS2标记系统，通过CRISPR-Cas9技术实现单端粒TERRA的实时成像，为端粒生物学研究提供新工具。

通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含RNA（TERRA）的癌细胞克隆构建

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