Name: 爆炸性神经损伤对压生啮鼠中脑动脉的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解爆炸性创伤性脑损伤后离体加压啮齿动物大脑中动脉的血管反应性检测方法。该技术可分离爆炸暴露对脑动脉的直接与间接影响，为研究脑血管损伤机制及开发保护性治疗策略提供重要实验平台。

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本研究作为摩迪创伤性脑损伤转化研究项目团队工作的一部分完成，并获得了美国陆军医学研究与物资司令部-国防部资助（项目编号：W81XWH-08-2-0132）。

所有实验方案均经德克萨斯大学医学分部机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该机构为经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施。
1. ABS 爆炸损伤动物准备
<ol>
	<li>开启机械式啮齿类动物呼吸机，并将呼吸频率设置在每分钟 40–45 次。</li>
	<li>打开温控加热毯，并在其表面贴上一块蓝色垫巾。</li>
	<li>将呼吸机管路连接至呼吸机。</li>
	<li>准备气管插管滑板、喉镜、长头镊子、导丝、气管插管，以及用 0.05 mL 1% 盐酸利多卡因浸泡过的棉签。将上述物品整齐摆放在蓝色垫巾上。</li>
	<li>确认啮齿类动物麻醉“气泡”室、呼吸机、空气室和异氟烷室的管路均已牢固连接并插入相应的插口或接口。麻醉气泡室的夹子应处于打开状态；呼吸机的夹子应处于关闭状态。</li>
	<li>在空气室上，将室内空气旋钮设置为 2 L/min，氧气旋钮设置为 1 L/min。</li>
	<li>打开异氟烷开关，并将旋钮调节至 4% 体积浓度混合气体。</li>
	<li>启动计时器，将一只年轻的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠（约 3 月龄，体重 350–400 g）放入麻醉气泡室中，持续 4–6 分钟。</li>
	<li>在 2 分钟时点称重大鼠体重。</li>
	<li>通过轻轻夹捏后肢足趾确认大鼠是否完全麻醉。若未观察到足趾回缩反应，则将室内空气流量调低至 1 L/min，氧气调至 0.4 L/min，异氟烷调至 2% 体积浓度混合气体。</li>
	<li>开启直肠遥测温度监测仪。</li>
	<li>打开通向呼吸机的夹子，同时关闭通向麻醉气泡室的夹子。</li>
	<li>将大鼠从麻醉气泡室中取出，并放置于气管插管滑板上。</li>
	<li>进行气管插管操作：将喉镜插入动物口腔，使用长头镊子将舌头移开，用利多卡因浸泡过的棉签轻轻擦拭咽喉内壁，然后将带有气管插管的导丝轻柔地插入大鼠气管中。</li>
	<li>完成插管后，将呼吸机管路末端连接至气管插管外端，观察并确认大鼠呼吸平稳且无呼吸困难。</li>
	<li>将气管插管固定就位，注意打结时避免压迫舌头。</li>
	<li>在直肠遥测温度探头上涂抹白色凡士林，然后将其直接插入尾部下方。</li>
	<li>从样本室中取出 ABS 样本托盘，并置于加热灯下预热，以便后续将大鼠放置于托盘上。</li>
	<li>从大鼠眼睛上方开始，向下至耳间区域，剃除头皮毛发。</li>
	<li>用剪刀将标准尺寸的泡沫耳塞从底部中心沿直线剪至圆顶端，分为两个完全相同的半片。将每半片先沿耳道插入耳尖，直至接触鼓膜。</li>
	<li>监测直肠温度。当温度达到 37 °C 时，即可准备将大鼠装入 ABS 样本托盘。</li>
	<li>将大鼠固定在 ABS 样本托盘上。断开气管插管与呼吸机管路的连接，迅速而轻柔地将大鼠从托盘顶部滑入，引导头部穿过头固定装置开口及橡胶颈圈。重新连接呼吸机管路至气管插管，检查橡胶颈圈是否牢固但不过紧地贴合颈部，并确认大鼠处于侧卧俯卧位（图 3）。</li>
	<li>关闭异氟烷，并断开呼吸机管路与气管插管的连接。</li>
	<li>将装有麻醉后大鼠的 ABS 样本托盘锁紧并固定于 ABS 样本室中。</li>
	<li>每隔 3 秒使用长头镊子轻轻夹捏后肢足趾，直至出现回缩反射反应。</li>
</ol>
2. ABS 爆震装置准备与爆震性颅脑损伤诱导
注意：第2.1–2.10步通常与第1.1–1.22步同时完成，以便在大鼠装入并固定到样本室后，能够立即进行冲击伤处理。
<ol>
	<li>松开液压手动泵（图4A）的旋钮，以释放驱动腔（图4B）中残留的被困空气，并使腔体与其密封处松动。</li>
	<li>松开围绕驱动腔周围的全螺纹杆（图4D）上的帽形螺母（图4C），并将驱动腔向左滑动，远离膨胀腔（图4E）。</li>
	<li>完全拆下位于驱动腔顶部的两根全螺纹杆及其对应的帽形螺母，以便将聚酯薄膜片放置于驱动腔与膨胀腔之间。</li>
	<li>将四片预先裁切并测量好的（30 cm 长，20 cm 宽，0.004 in. 厚）聚酯薄膜片在顶部边缘叠放整齐，并使用一段 2.54 cm 的美纹纸胶带将其固定在一起（形成聚酯薄膜“膜”）。再用另一段胶带，将聚酯薄膜膜的顶部边缘牢固地粘贴在膨胀腔顶部，并覆盖驱动腔与膨胀腔之间的开口中心位置（图4F）。</li>
	<li>通过重新安装驱动腔顶部的两根全螺纹杆，并用手拧紧围绕腔体的所有帽形螺母，将驱动腔固定在聚酯薄膜膜上。</li>
	<li>将附件钢块紧贴液压手动泵块和驱动腔，直至其稳固就位。</li>
	<li>拧紧液压手动泵旋钮，并通过观察液压表上压力值保持恒定，确认驱动腔保持加压且无泄漏。</li>
	<li>在ABS爆震装置计算机上打开用于记录ABS爆震装置压力波形的触发采集文件。</li>
	<li>略微松开压缩空气罐（图4G）的主旋钮，使气道轻微开启。</li>
	<li>操作液压手动泵，直至压力表指针达到红色箭头位置，指示所需的腔内压力水平约为 5,000 psi。</li>
	<li>将麻醉后的动物以侧卧姿势固定在ABS样品托盘（图4H）上（图3），并将样品托盘锁入ABS样品腔（图4I）中。</li>
	<li>使用长镊子每隔 3 秒轻轻夹捏动物后肢足掌，直至引发回缩反射反应。</li>
	<li>在ABS爆震装置计算机上已打开的采集页面点击开始。</li>
	<li>当屏幕上出现“采集中”窗口时，按下并持续按住ABS爆震装置的触发器，直至爆震发生，聚酯薄膜膜破裂，向大鼠施加ABS爆震损伤（20.9 psi ±1.14，138 kPa ±7.9）。爆震发生后立即启动第二个计时器，记录损伤后经过的时间（以分钟和秒计）。</li>
	<li>将大鼠从ABS样品托盘中取出，放回蓝色垫板和加热毯上，使其完全仰卧，以评估翻正反射抑制情况。</li>
	<li>记录翻正反射恢复的时间。观察第二个计时器，记录大鼠从仰卧位连续三次翻转至俯卧位所需的时间（以分钟和秒计）。随后将大鼠放回麻醉气泡室中。</li>
	<li>松开液压手动泵旋钮，以便驱动腔松动并移动。</li>
	<li>拧紧压缩空气罐的主旋钮，以关闭气道。</li>
</ol>
<img alt="啮齿类动物空气暴露系统示意图；气流，样本室；研究装置，动物实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：大鼠在ABS样本托盘上及ABS内部的放置方式。 研究动物在ABS内的方向与朝向。放入ABS后，动物呈横卧俯卧位，其头部背侧表面与冲击波方向（红色箭头）垂直。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="激波管装置；压缩空气钢瓶、样品室、波形抑制器；压力动态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4： 高级爆轰模拟器（ABS）激波管装置示意图。 ABS的主要组成部分。A = 液压手动泵；B = 驱动室；C = 顶紧螺母；D = 全螺纹杆；E = 膨胀室；F = 聚酯薄膜膜片安装位置；G = 压缩空气钢瓶；H = 样品托盘；I = 样品室。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 啮齿类动物大脑中动脉PSS溶液的制备
注意：通常在执行步骤 1.1–1.22 的同时，一并完成步骤 3.1–3.3，以便使 PSS 溶液准备好供使用。
<ol>
	<li>配制并混合1,000 mL生理盐溶液（PSS），其成分为：130 mM NaCl；4.7 mM KCl；1.17 mM MgSO4∙7H2O；5 mM葡萄糖；1.5 mM CaCl2；15 mM NaHCO3。</li>
	<li>用含21% O2和5% CO2、其余为N2的混合气体平衡PSS溶液，当溶液pH值达到7.4时即可使用。 
	注意：所有气体均来自压缩气瓶，浓度如上所述。</li>
	<li>用配制好的PSS溶液填充储液瓶和管路，并将剩余溶液冷藏保存。</li>
</ol>
4. 啮齿类动物大脑中动脉段的提取
<ol>
	<li>记录翻正反射持续时间后，将大鼠放回麻醉气室。关闭通向呼吸机的夹子，打开通向气室的夹子。开启异氟烷至4%体积浓度混合气体，将大鼠置于气室内2–3分钟，直至深度麻醉。</li>
	<li>大鼠麻醉后，打开通向呼吸机的夹子，关闭通向麻醉气泡室的夹子。将异氟烷浓度调至2%的体积混合比，然后将其从气泡室中移出。将大鼠俯卧于保温毯上，并将呼吸机管路末端重新插入气管插管的外端。</li>
	<li>在bTBI损伤后立即进行30或60分钟的机械通气，呼吸频率维持在40–45次/分钟，同时以2%体积混合气体维持麻醉。</li>
	<li>在完成30或60分钟的存活时间后，将异氟烷浓度提高至体积比4%，深度麻醉5–6分钟。立即使用专用于啮齿类动物的断头器进行断头处死。 
	注意： 在这些实验中，我们在动物翻正反射恢复后，仍保持其处于麻醉状态并进行机械通气，直至断头处死。如果研究需要更长的存活时间点，则应在动物从麻醉中苏醒前给予镇痛剂。 </li>
	<li>小心地将脑组织从颅骨中取出。使用#10手术刀片，从剃净毛发的头皮顶部开始，沿中线向下至枕骨髁，做一条长约1.5英寸、深达骨层的垂直切口。</li>
	<li>使用小型骨钳切开并分离头皮皮肤与颅骨。</li>
	<li>使用大型骨钳切割并取出包绕脑组织的枕骨、顶间骨及额骨的下半部分。</li>
	<li>使用手术刮匙在脑组织脱离周围颅骨后，小心地将其从颅腔中取出。 
	注意： 分离大脑与颅骨时需格外小心，避免过度牵拉、急拽或牵扯大脑中动脉的细小节段，以免其从颅壁上受到不必要的损伤。</li>
	<li>将收获的脑组织放入盛有预冷PSS溶液的小型玻璃培养皿中，培养皿直接置于实心冰块上。</li>
	<li>仔细移除起始于威尔氏环的左侧和右侧大脑中动脉，继续向侧方和背侧移除约4–5 mm的血管段。</li>
	<li>使用显微镊子轻轻清除长约4–5 mm的收集到的MCA节段上的结缔组织。</li>
	<li>将MCA安装到动脉血管造影仪上。用第一根玻璃微移液管（直径≈70 µm）并用10-0尼龙缝线固定。</li>
	<li>用PSS轻柔灌注管腔，以清除管腔内残留的血液及其他内容物。</li>
	<li>用第二根微移液管穿刺各血管段远端，避免牵拉大脑中动脉（MCA）血管段，并用10-0尼龙缝线固定。</li>
	<li>成功安装大脑中动脉（MCA）段后，将灌流 chamber 置于倒置显微镜载物台上，以放大观察血管。显微镜配备有视频摄像机、显示器以及经光学测微计校准的视频标尺，用于测量动脉直径。</li>
	<li>将每个血管段及其周围的动脉浴槽用持续循环的PSS填充，并将PSS温度从室温逐渐升至 37 °C 并用含21% O₂的气体混合物平衡2 和5% CO2 在N的平衡中2.</li>
	<li>将连接至微移液管的储液瓶抬升至适当高度，使大脑中动脉（MCA）节段在50 mmHg压力下平衡60分钟。位于微移液管与储液瓶之间的压力传感器将监测MCA节段内的跨壁压力，以指示达到目标50 mmHg压力的时刻。</li>
	<li>平衡期结束后，通过调节储液瓶的高度，将血管内压力升高至100 mmHg。</li>
	<li>递送 30 mM K+ （用于确认血管收缩） 通过 管腔灌注液并测量动脉直径。约10分钟后，给予10-5 M Ach（用于血管扩张）并测量动脉直径。</li>
	<li>观察血管舒张反应。降低储液瓶高度，将血管内压力从100 mmHg降至80 mmHg。使大脑中动脉（MCA）节段平衡10分钟。测量动脉直径。</li>
	<li>将血管内压力从80 mmHg降低至60 mmHg。使大脑中动脉（MCA）节段平衡10分钟。测量动脉直径。</li>
	<li>将血管内压力从60 mmHg降低至40 mmHg。使大脑中动脉（MCA）节段平衡10分钟。测量动脉直径。</li>
	<li>将血管内压力从40 mmHg降低至20 mmHg。使大脑中动脉（MCA）节段平衡10分钟。测量动脉直径。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与所有实验方案和操作说明一样，本研究中的特定实验步骤必须尽可能准确、精确地执行。在对大鼠进行初次插管后，必须确认其呼吸平稳且无困难。若将气管插管误插入食管而非气管，会导致大鼠呼吸费力、出现喘鸣、出血，并因麻醉气体无法有效输送至肺部而引起苏醒。
在将聚酯薄膜膜片粘贴至驱动腔与膨胀腔之间开口的中心位置时，必须确保膜片居中并对整个开口区域完全覆盖39,41。若膜片在开口处未对准，将导致驱动腔漏气、膜片破裂所需压力下降，从而无法实施冲击损伤实验。正确安装辅助钢块并将其紧密贴合于液压手动泵模块和驱动腔同样至关重要，同时需拧紧液压手动泵旋钮，并确认驱动腔保持加压且无泄漏。钢块的正确放置可使驱动腔与膨胀腔紧密闭合，从而通过聚酯薄膜膜片在腔体开口处以及驱动腔与膨胀腔之间形成必要的密封。
在进行大脑中动脉（MCA）血管分离前的准备过程中，用含21% O2 和5% CO2、余量为N2 的混合气体对PSS溶液进行通气，可使溶液达到平衡状态，并有助于实现工作用PSS溶液所需的中性生理pH值21,33,34。
在恒定压力下平衡各片段 60 分钟21,32,33,34 这一步骤极为必要，因为该步骤允许血管段在首次初级加压过程中达到最大扩张后发生收缩。这一现象表明出现了自发性张力，是健康动脉的特征性表现。32,33,34尽管其他研究中曾采用不同的压力水平进行节段平衡33,34,42，本研究及Mathew的研究 等21，Golding 等35 和 Golding 等人43 在50 mmHg下对血管段进行平衡。平衡过程中，收集的血管段压力可维持在40 mmHg–100 mmHg之间。32 在该实验步骤中，允许在规定压力参数范围内进行一定程度的灵活调整，但最终需通过一小时的平衡期来确认动脉健康状况，以确保实验的继续进行。
在取出脑组织以及从大脑动脉环上分离左侧和右侧大脑中动脉（MCA）节段时，必须格外小心，以保持这些血管的完整性，这可能是整个实验方案中最关键的步骤。使用咬骨钳时刺破脑组织、在取出过程中撕裂或过度牵拉血管节段，或在将脑组织从颅骨中挖出时意外用手术刮匙牵拉血管，最终都会导致获取的大脑中动脉遭到破坏，造成无法使用的血管节段，并使该套动脉无法继续使用，最终导致该实验动物的全部实验无效。
尽管测量大脑中动脉节段对扩张性或收缩性刺激的脑血管反应 离体 在体内冲击或爆炸性创伤性脑损伤（TBI）后收集样本已取得一定成功，但该方法仍存在若干困难和/或局限性。其中，研究TBI对脑血管循环影响时较为显著的复杂性之一，在于难以将TBI对血管的直接效应与受伤脑组织释放的各种物质和成分所引发的间接效应明确区分开来。44这种可能的困惑可通过分析来避免 离体条件下对获取的、灌注的和/或加压的脑中动脉（MCA）进行血管收缩和血管舒张反应的研究。为了减少脑动脉在体内暴露于局部释放的实质内血管活性物质的时间（直至死亡前），在创伤性脑损伤（TBI）后直接采集脑动脉，可减轻此类长期暴露效应的程度。对分离的MCA进行离体研究，还可通过使用特定受体激动剂、拮抗剂或公认的血管损伤媒介，为分析创伤性血管损伤机制提供可能，而这些手段在体内研究中难以实现同等效率或分辨力的观察。因此，该离体方法可与药物的离体暴露相结合，以检测由此产生的肌源性反应（即血管段因管内或管外药物暴露所引发的血管收缩或舒张）。
其他局限性包括在取出脑组织后粗糙或仓促地剥离大脑中动脉（MCA），可能导致血管过早撕裂，从而使其无法使用。此外，在动物安乐死后，若在血管采集及将其置于预先配制的PSS溶液之间间隔数分钟以上，也可能导致血管失去活性。本方案中所述的在爆震性创伤性脑损伤（bTBI）后检测MCA肌源性反应的方法，若规范操作并严格遵循步骤，从开始到结束需耗时数小时；试图缩短实验所需时间可能导致实验失败。然而，该方法在正确实施的情况下可完成 体外实验，且所用仪器和设备的成本显著低于活体高分辨率磁共振（MR）成像45,46 或常规多普勒超声/血流速度测量技术47,48,49 也用于血管研究。
轻度爆炸性创伤性脑损伤（bTBI）与脑血管在血管内压力降低时舒张反应受损相关，这一发现可能与既往报道的爆炸暴露后出现的血管痉挛6,7以及血管平滑肌细胞（VSMC）过度收缩50有关，最终可能导致相对脑灌注减少等现象。此外，爆炸引起的脑血管正常舒张反应受损，若合并战斗作业中常见的动脉低血压，可能进一步加剧脑灌注的下降。
这些结果表明，爆炸性创伤性脑损伤（bTBI）会导致介导动脉血管调控的机制发生改变。尽管已观察到伤后至少一小时内急性期脑血管功能受损，表现为动脉肌源性反应对血管内压力降低的响应能力下降，但目前关于bTBI后急性期的相关信息仍存在空白。明确bTBI对脑血管系统及脑组织造成的物理和生化功能缺陷，有助于在损伤后尽快评估治疗和/或康复干预的效果。

与冲击所致的类似（即, 非冲击性创伤性脑损伤（non-blast TBI）相比，冲击所致创伤性脑损伤（bTBI）与脑血管损伤相关1 以及对二氧化碳分压（PaCO₂）变化等事件的脑血管代偿反应受损2)2,3,4 和氧气（PaO2)5此外，爆炸暴露已在动物中引起脑动脉血管痉挛6 以及bTBI患者7,8. 尽管临床TBI9 和流体冲击损伤（FPI）10,11,12 与动脉血压变化引起的脑血管反应受损相关（即, 压力自身调节9,10,11,12，关于bTBI对脑血管压力自动调节能力的影响，目前仍存在不确定性。
脑循环通过对体循环动脉压的变化作出反应，以维持向代谢活跃的脑组织持续供应氧气和营养物质13,14,15,16一种独特的稳态形式：自身调节17,18,19 当器官在血流（灌注）压力或其他生理或病理刺激发生变化的情况下仍能维持恒定的血流量时，即发生该现象。20. 脑动脉会根据血压、一氧化氮（NO）、血液黏度和动脉血二氧化碳分压（PaCO₂）的变化发生收缩或舒张2 和PaO2等。4,11,16,21动脉肌源性反应指的是此类收缩或舒张。肌源性血管反应最早由 Bayliss 描述22 当灌注压升高时表现为血管收缩，灌注压降低时表现为血管舒张，这是脑血流自身调节的主要机制之一。14,17这种血管反应是收缩性组织（如血管平滑肌细胞，VSMCs）对牵张和/或管腔及壁张力变化作出反应的固有特性。23,24,25,26,27,28,29. 当动脉被拉伸时（例如, 在血管内压力升高期间，血管平滑肌细胞收缩24,25,26,28.
研究阻力血管的实验 离体实验通常采用两种方法之一来检测分离出的小阻力血管的药理学和生理学特性：环状悬挂法和灌注加压法。环状悬挂血管制备方法需将两根细丝从管腔内穿过血管节段，以固定该血管段。通过测量等长张力下金属丝所受的力，可评估血管平滑肌细胞（VSMC）的收缩反应。然而，该技术存在某些局限性，其中最显著的是在金属丝穿过血管腔时，内皮层不可避免地受到损伤30 以及被分离血管段所承受的不同程度的牵拉，进而导致血管壁扩张，最终影响血管对药理学试剂的敏感性31采用去血管外膜加压血管制备方法，利用一种由两个独立腔室组成的血管造影仪，每个腔室中放置一条从单只动物获取的中脑动脉（MCA）。将微移液管插入血管段的两端，用缝线将血管段近端固定于微移液管上，并以生理盐溶液（PSS）轻柔灌注管腔，以清除血液及其他物质。随后用缝线固定远端。跨壁压或管腔内压力通过调节连接至各微移液管的两个储液罐的高度来设定，使每个储液罐相对于对应血管段处于适当高度，但两个储液罐彼此之间高度不同。32,33,34,35,36压力传感器置于储液器和微移液管沿线，用于测量灌注压力，同时使用配备显示器、摄像机和放大器的倒置显微镜放大血管，以便测量大脑中动脉（MCA）的外径。尽管两种方法均有价值，但套管插管加压血管制备法能更真实地模拟生理状态，使所研究的血管更接近其原有状态 体内 条件32,37.
不同类型冲击的影响（即, 非爆炸性颅脑损伤对脑血管反应的影响此前已在脑动脉节段中开展研究21,35,36,38采用与本研究所述相似的离体大脑中动脉（MCA）血管采集、固定和灌注方案，先前的研究已成功用于探究创伤性脑损伤（TBI）后脑血管功能障碍的相关机制。Golding 等34 通过控制性皮质撞击（CCI）损伤，检测了重度创伤性脑损伤（TBI）后成年雄性Long-Evans大鼠大脑中动脉（MCA）的内皮介导舒张功能。在另一项研究中，Golding 等36 研究脑血管对低血压或CO的反应性2 在收获经历轻度 CCI 大鼠的 MCA 后。Yu 等38 分析了过氧亚硝酸盐清除剂是否能改善成年雄性Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉节段在经受FPI后对血管内压力降低的舒张反应，而Mathew等人21 研究中度中心性FPI后获取的MCA对低血压的肌源性反应。
为了进一步验证这一假设，即爆炸性创伤性脑损伤（bTBI）与非爆炸性创伤性脑损伤类似，会导致脑血管反应性受损，我们通过在离体条件下测定孤立且加压的大鼠大脑中动脉（MCA）节段对血管内压力降低所引发的肌源性舒张反应，来检验导致自动调节功能受损的机制。图1) 采用高级爆炸模拟器（ABS）冲击管模型对经历轻度bTBI的大鼠进行采集（图2 和 图3）（参见 Rodriguez 等39 表1）利用直接输送至驱动腔的压缩空气来产生类似Friedlander的40 超压和欠压波（参见 Rodriguez 等39 图1A).
<img alt="脑动脉网络示意图；突出显示大脑中动脉；脑循环研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：大脑中动脉（MCA）的位置。 大鼠脑腹侧视图，突出显示大脑中动脉（MCA）相对于大脑后动脉（PCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）、基底动脉（BA）和颈总动脉（CCA）的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示用于气流分析的风洞装置的流体动力学实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：高级爆炸模拟器（ABS）激波管装置。 本研究中所有实验动物的原发性爆炸伤均通过该ABS装置产生。1 = 驱动室；2 = 扩展室；3 = 样本室；4 = 反射波抑制器；黄色星标 = 样本托盘。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>高级爆震模拟器 (ABS)</td><td>Dyn-FX Consulting, Ltd. 和 ORA, Inc.</td><td>N/A</td><td>用于诱导原发性爆震损伤的模拟爆震冲击管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠&amp;nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>实验动物</td></tr><tr><td>血管张力测定仪</td><td>Living Systems Instrumentation, Inc.</td><td>Arteriograph</td><td>离体动脉的固定及管腔直径测量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大型骨剪</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>Friedman Rongeur</td><td>从颅骨中取出脑组织</td></tr><tr><td>小型骨剪</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>Boynton Rongeur</td><td>从颅骨中取出脑组织</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>氯化钙</td><td>制备啮齿类动物大脑中动脉生理盐溶液 (PSS)</td></tr><tr><td>耳塞</td><td>3M</td><td>Foam Ear Plugs 1100 Class AL&amp;nbsp;</td><td>在爆震设备中防止鼓膜损伤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>D-[+]-葡萄糖</td><td>制备啮齿类动物大脑中动脉生理盐溶液 (PSS)</td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Piramal Enterprises Limited&amp;nbsp;</td><td>异氟烷，USP</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>氯化钾</td><td>制备啮齿类动物大脑中动脉生理盐溶液 (PSS)</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>硫酸镁</td><td>制备啮齿类动物大脑中动脉生理盐溶液 (PSS)</td></tr><tr><td>显微镊</td><td>Buxton Biomedical Inc.</td><td>显微打结镊，180 mm</td><td>从颅骨中取出脑组织</td></tr><tr><td>聚酯薄膜片 (Mylar 片)</td><td>德克萨斯美术用品公司</td><td>Mylar</td><td>爆震过程中用于积聚压缩空气的膜材</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>氯化钠</td><td>制备啮齿类动物大脑中动脉生理盐溶液 (PSS)</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>碳酸氢钠</td><td>制备啮齿类动物大脑中动脉生理盐溶液 (PSS)</td></tr><tr><td>尼龙缝合线</td><td>Ethicon</td><td>10-0 Ethilon 黑色单股尼龙缝合线 5&quot; (13 cm)</td><td>离体动脉的固定及管腔直径测量&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 号手术刀片</td><td>Bard-Parker</td><td>10 号不锈钢手术刀片</td><td>从颅骨中取出脑组织</td></tr><tr><td>外科刮匙</td><td>Delmaks Surgico</td><td>骨水泥刮匙&amp;nbsp;</td><td>从颅骨中取出脑组织</td></tr><tr><td>体温计&amp;nbsp;</td><td>Physitemp Instruments, Inc.,&amp;nbsp;</td><td>Thermalert 监测体温计</td><td>监测实验动物的核心体温&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>容量呼吸机&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Inc.</td><td>小型动物呼吸机</td><td>维持插管实验动物呼吸的恒定与平稳</td></tr><tr><td>水循环毯</td><td>Gaymar Industries, Inc.&amp;nbsp;</td><td>Mul-T-Pad 温控治疗垫</td><td>维持实验动物的体温&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

爆炸所致神经创伤对加压啮齿类动物大脑中动脉的影响

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

尽管已有研究探讨了爆炸暴露对组织病理学和行为的影响，但针对爆炸对脑血管效应的研究相对较少。冲击（即, 非冲击性创伤性脑损伤（non-blast traumatic brain injury, TBI）已知会降低人类和实验动物脑血管的压力自动调节能力。本研究检验了如下假设：与撞击所致TBI类似，爆炸所致创伤性脑损伤（blast-induced traumatic brain injury, bTBI）也会损害脑血管反应性。为此，通过使用高级爆炸模拟器（Advanced Blast Simulator, ABS）冲击管对大鼠实施轻度bTBI后，检测其大脑中动脉（middle cerebral arterial, MCA）节段在血管内压力降低时的肌源性舒张反应。成年雄性Sprague-Dawley大鼠被麻醉、气管插管并机械通气，随后分为假手术bTBI组（Sham bTBI，除无爆炸损伤外其他操作和麻醉条件相同）或轻度bTBI组。大鼠被随机分配接受假手术bTBI或轻度bTBI处理，并在损伤后30分钟或60分钟处死。bTBI后立即评估翻正反射（righting reflex, RR）抑制时间；在预定时间点完成安乐死后，取出脑组织，分离单个MCA节段，进行固定并加压。当灌注于动脉节段内的管腔压力从100 mmHg逐步以20 mmHg为梯度降至20 mmHg时，测量并记录MCA的直径变化。随着管腔压力降低，假手术bTBI组MCA直径显著且持续地高于基线水平，而bTBI组的MCA舒张反应则显著减弱p &#60; 0.05），表现为bTBI组记录到的MCA直径减小、功能受损。此外，bTBI组的RR抑制也显著（p &#60; 0.05）高于假手术bTBI组。假手术bTBI组获取的大脑中动脉（MCA）表现出典型的对管腔内压力降低的血管舒张特性，而bTBI后获取的MCA在压力降低时表现出显著受损的肌源性血管舒张反应，该异常反应在bTBI后至少持续60分钟。

所有实验动物的平均bTBI超压为20.9 psi ±1.14（138 kPa ±7.9）。经ABS bTBI冲击波暴露的大鼠，其翻正反射（RR）抑制的平均持续时间（5.37 min ±2.1）与对照组相比未见显著延长（p 0.36，bTBI组与假手术组相比）低于假手术组（5.10 分钟 ±1.6）。
在假手术30分钟组和60分钟组中，随着管腔内压力从100 mmHg降低至20 mmHg，大脑中动脉（MCA）直径均较基线水平增大。与相应的假手术组相比，在爆炸暴露后，观察到的30分钟（p = 0.01，bTBI组对假手术组）和60分钟（p = 0.02，bTBI组对假手术组）ABS bTBI组在持续降低血管内压力时，MCA的扩张反应显著减弱（图5）。有关这些结果的更详细讨论，请参见Rodriguez 等人的研究39。
这些研究发现，在轻度bTBI后30和60分钟，轻度bTBI显著损害了大脑中动脉（MCA）节段在血管内压力降低时的脑代偿性扩张反应，而本研究中使用的轻度冲击波水平导致的呼吸抑制持续时间（<30秒）与假手术损伤大鼠相似。
采用软件进行统计分析。通过计算每个管腔内压力水平（80、60、40 和 20 mmHg）相对于基线（100 mmHg）的变化百分比，评估血管壁对管内压力变化的肌源性反应。使用非配对 Student's t 检验评估 bTBI 组与假手术组基线之间的差异。采用单因素重复测量方差分析（ANOVA）Dunnett 多重比较检验和 Bartlett 方差齐性检验，评估 bTBI 组与假手术组之间大脑中动脉（MCA）舒张反应的差异。
由于重复检验导致统计效能降低，因此在MCA实验中的每个特定压力点进行比较时（例如, 在100至80 mmHg或60至40 mmHg等范围内未进行相关研究。显著性水平设定为 p ≤ 0.05 水平。文中、引用的表格及图示中的所有数据均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。
<img alt="血管内压力与大脑中动脉直径关系图；假手术组与bTBI组随时间变化的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：bTBI对大脑中动脉（MCA）响应血管内压力降低的影响。 在爆炸暴露后，与假手术组（n = 12）相比，30分钟（p = 0.01，bTBI vs. 假手术）和60分钟（p = 0.02，bTBI vs. 假手术）bTBI组（n = 6/组）对血管内压力逐步降低的舒张反应表现出血管舒张功能受损，且显著减弱。在30分钟和60分钟假手术组中，当管腔内压力从100 mmHg降低至20 mmHg时，MCA直径均高于基线水平。数据以均值±标准误表示。*p &lt; 0.05，与假手术组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于在采用冲击管（也称为高级爆炸模拟器，ABS）设备诱导原发性爆炸性脑损伤（bTBI）后，通过分离并加压的大鼠大脑中动脉（MCA）血管段进行离体血管反应性测定的实验方案。

尽管已有研究探讨了爆炸暴露对组织病理学和行为的影响，但针对爆炸对大脑的……研究却较少

该方法有助于解答爆炸性创伤性脑损伤是否会导致脑血管损伤，以及其影响范围是否延伸至血管肌源性反应受损的问题。通过离体加压动脉制备技术，我们能够将爆炸暴露对脑动脉的直接效应与因脑部受到爆炸影响而产生的间接效应区分开来。离体加压动脉制备可用于研究多种疾病或病理状态下的血管功能，包括中风、高血压以及糖尿病。我们研究的目标是确定能够维持脑循环功能、从而保护大脑免受出血有害影响的治疗方法。今天演示实验操作的是我们实验室的助理主任Maggie Parsley以及首席研究技术员Yaping Zeng。准备高级爆震模拟器（ABS）时，使用一段2.54厘米长的美纹纸胶带，沿四层堆叠的预裁聚酯薄膜（Mylar）顶部边缘进行固定。使用另一段胶带，将聚酯薄膜（Mylar膜）的上边缘固定在膨胀室顶部，位置位于驱动室与膨胀室之间开口的正上方。重新安装膨胀室顶部的两根全螺纹杆，并用手拧紧环绕腔室的所有帽状螺母，使驱动室紧压在Mylar膜上。拧紧液压手动泵旋钮，并观察液压压力表显示稳定的压力阈值，以确认驱动室内保持加压且无泄漏。然后打开记录ABS爆震装置压力波形的触发采集文件，该文件位于ABS爆震装置的计算机中。为准备对麻醉大鼠实施损伤，使用长柄镊子将舌头拨至一侧，并用浸有利多卡因的棉签轻轻擦拭咽喉内壁，随后轻柔地将带有气管插管的导丝插入气管。插管成功后，将呼吸机管路的一端连接至气管插管的外端，并观察确认大鼠呼吸平稳且无呼吸困难。接下来，从样本室中取出ABS样本托盘，并在加热灯下预热托盘。在托盘预热的同时，剃除从眼睛上方至两耳之间的头皮顶部毛发，并使用剪刀将标准尺寸的泡沫耳塞从底部到圆头端沿垂直方向切成两个相同的半片。然后将切好的半片耳塞分别插入耳尖，先沿耳道插入，直至接触鼓膜。将呼吸机管路从气管插管上移除，迅速但轻柔地将大鼠滑入标本托盘的顶端，小心引导其头部穿过头固定装置的开口和橡胶颈圈。当大鼠就位后，重新将呼吸机管路插入气管插管，并确认橡胶颈圈已牢固但不过紧地固定在颈部周围，且大鼠呈侧卧俯卧位。随后，将装有麻醉大鼠的ABS标本托盘锁紧并固定到ABS标本腔内，并每隔三秒用长镊子轻轻夹捏大鼠后肢足趾，直至引发回缩反射反应。在ABS爆震装置计算机上打开的采集页面点击“开始”，然后在采集窗口中按住并持续按下ABS爆震装置的触发器，直至爆炸发生，使Mylar膜破裂并完成ABS爆震损伤的施加。爆炸发生后立即启动第二个计时器，记录损伤后大鼠恢复自主体位所需的时间（以分钟和秒为单位），随后将大鼠仰卧放置于蓝色垫上并进行保温，以评估其翻正反射抑制情况。为暴露大脑中动脉，使用10号手术刀片从剃净毛发的头皮顶端至枕骨髁处，做一条中线方向长约1.5英寸、深达颅骨的垂直切口，并使用小型咬骨钳将头皮组织从颅骨表面分离并撑开。使用大型骨钳切除并取出包绕脑组织的枕骨、顶间骨以及额骨的下半部分，然后用外科刮匙在脑组织脱离周围骨质后小心地将其从颅骨中剥离。将获取的脑组织置于含有冰冷生理盐溶液（PSS）的小型玻璃培养皿中，并将培养皿放置于解剖显微镜下冰块上。在显微镜下仔细分离并去除左侧和右侧大脑中动脉（MCA），起始于威尔氏环，向后外侧延伸约四至五毫米。使用显微镊子轻轻清理所采集的MCA血管段，并将动脉安装至血管张力测定仪上。用玻璃微移液管（直径70微米）插管每个血管段的近端，并用10-0尼龙缝线固定微移液管。用PSS轻柔灌注管腔以清除任何残留血液，再用第二根微移液管插管每个血管段的远端，注意不要拉伸动脉组织。用另一组10-0尼龙缝线固定微移液管，并将血管造影装置置于配备相机和显示器的倒置显微镜载物台上。将连接至微移液管的储液瓶提升至适当高度，使大脑中动脉（MCA）血管段在50毫米汞柱压力下平衡60分钟。平衡期结束后，将储液瓶调节至不同高度以检测血管的舒张反应，降低储液瓶高度使管内压力降至80毫米汞柱，并让血管段平衡10分钟。随后，依次将管内压力进一步降至60、40和20毫米汞柱，每次压力变化后均让血管段充分平衡。在此代表性图表中，Y 轴表示动脉直径，即在 100 毫米汞柱基线压力下直径的百分比变化。X 轴显示测试动脉舒张反应时的不同血管内压力。假手术损伤组的 MCA 直径在基线以上增加，并随着管腔内压力从 100 毫米汞柱降低至 20 毫米汞柱而持续正常舒张。相比之下，在观察的30分钟和60分钟爆炸所致创伤性脑损伤组中，大脑中动脉对血管内压力持续降低所引发的舒张反应在爆炸暴露后显著减弱，表明其对压力降低的脑血管舒张反应能力受到明显损害。血管的提取、回收、固定和灌注技术极为复杂，进行这些操作时应格外精细，谨慎操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

爆炸性神经损伤对压生啮鼠中脑动脉的影响

来源：Logsdon, A. F., 等。用于啮齿类动物闭合性轻度创伤性脑损伤临床前评估的低强度冲击波模型。J. Vis. Exp.

在小鼠模型中诱导闭合性轻度创伤性脑损伤

脑灌注监测已被证明可提高缺血性卒中模型的准确性。技术难题常常限制了这一脑血管研究重要工具的应用。本视频展示了一种优化的系统，可在大鼠大脑中动脉内栓塞过程中实现单部位或多部位的血流动力学监测。...

改良的大鼠大脑中动脉内栓塞卒中模型脑灌注监测系统

我们介绍一种高度可重复的啮齿类动物主要脑血管永久性闭塞的方法。该技术可实现极小的周围组织损伤、最少的失血量、较高的长期存活率，以及与人类临床人群相符的稳定梗死体积。...

永久性脑血管阻塞 通过 双结扎与横断

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在老年大鼠中实施永久性远端大脑中动脉联合颈总动脉闭塞以研究伴有持续性功能障碍的皮层缺血

本文介绍了一种用于研究轻度至中度创伤性脑损伤神经生物学和病理生理学效应的啮齿类动物爆炸冲击波模型方案。我们建立了一种由气体驱动的台式装置，配备压力传感器，可稳定且可重复地产生爆炸所致的轻度至中度创伤性脑损伤。...

用于啮齿类动物闭合性轻度创伤性脑损伤临床前评估的低强度冲击波模型

本方案描述了一种在同一批啮齿类动物脑样本上测量缺血性脑损伤三个最重要参数的新技术。仅使用一个脑样本在伦理和经济成本方面具有显著优势。...

在一组啮齿类动物脑样本中同时测量卒中后脑水肿、梗死区域及血脑屏障破坏

本文介绍了利用小鼠产生重复低强度爆炸暴露的方法。...

在小鼠中模拟高强度重复低级别爆炸暴露

本方案描述了一种大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，该模型在不造成损伤的情况下保留了脑血管的解剖结构。...

一种不损伤脑血管解剖结构的大鼠中动脉闭塞/再灌注模型

本方案描述了一种定制的超压空气系统，旨在诱导小鼠闭合式中枢神经系统（CNS）损伤，包括眼部、脑部和脊髓创伤。本方案的目标是为研究人员提供一个框架，以便轻松地根据其特定的中枢神经系统创伤研究需求对系统进行调整和扩展。...

中枢神经系统局灶性封闭系统损伤装置

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。...

大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

了解爆炸性创伤性脑损伤后离体加压啮齿动物大脑中动脉的血管反应性检测方法。该技术可分离爆炸暴露对脑动脉的直接与间接影响，为研究脑血管损伤机制及开发保护性治疗策略提供重要实验平台。

爆炸所致神经创伤对加压啮齿类动物大脑中动脉的影响

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