细菌中无机聚磷酸盐的检测

无机多磷酸盐是细菌应激反应的关键元素。但是，在细菌中提取和测量聚丙烯的较旧方法是复杂和劳动密集型的。该技术的主要优点是，它允许在各种不同细菌物种中快速、敏感和廉价地定量聚丙烯。

这个程序将由我实验室的本科生艾莉亚·波赫雷尔演示。首先，在37摄氏度的酶诱导介质中生长乳酸杆菌，无需震动。在1.5毫升微离心管中分离一毫升这种隔夜培养物，以收获足够的细胞，总共产生50至100微克的细胞蛋白。

从细胞颗粒中完全去除上流液，然后加入250微升GITC解液缓冲液，通过涡流重新暂停。在95摄氏度下孵育10分钟，以细胞。将酸盐储存在 80 摄氏度。

首先，在GITC解液缓冲液中准备每毫升BSA含有零、1、2和4毫克的BSA标准。5微升解冻、混合良好的细胞落酸和5微升的BSA标准，将孔分离在一个清晰的96孔板中。在每个井中加入 195 微升布拉德福德试剂，并在板读卡器中测量 595 纳米的吸光度。

通过与手稿中概述的 BSA 标准曲线进行比较，计算每一井中的蛋白质量。要确定每个样品中的蛋白质总量，请将结果值乘以 05。要开始聚磷酸盐萃取，将250微升95%乙醇添加到每个GITC落水样品中，并加入涡流混合。

将这种混合物移入放置在1.5毫升离心管中的二氧化硅膜旋转柱。在 16，100 g 时离心 30 秒。丢弃流经并加入 750 微升的三盐酸盐、氯化钠、EDTA 和乙醇混合物。

在 16，100 gs 时离心 30 秒。丢弃流经，以 16，100 gs 离心旋转柱两分钟。将柱放在干净的 1.5 毫升微模糊管中。

加入150微升50毫摩尔pH8三盐酸盐，在室温下孵育5分钟。在8000g下离心两分钟，使聚丙烯的息肉。首先制定标准，在50毫摩尔pH8三盐酸盐中制备含有零、5、50或200微摩尔磷酸钾的标准。

各磷酸盐标准的100微升和100微升提取的聚P样品进入透明96井板的单独井中。准备一个主混合物，每个样品，包含30微升的5X ScPPX反应缓冲液，19微升水，和一个微升的纯化ScPPX。

在37摄氏度下孵育15分钟。在检测当天，通过将检测溶液基座的9.12毫升与88毫升的一摩尔抗坏血酸混合，准备新的检测溶液，并允许其在使用前达到室温。在 96 井板的每个样品和标准中添加 50 微升检测解决方案。

为了允许颜色发展，在室温下孵育板约两分钟。使用板读卡器测量 882 纳米的吸光度，并比较磷酸钾标准曲线，计算每个样品的磷酸盐浓度。然后将磷酸盐浓度转换为每个细胞中多P衍生磷酸盐的纳米摩尔，并使细胞多聚P含量正常化为总细胞蛋白，如手稿中所述。

野生型大肠杆菌，一种克阴性细菌，生长在LB中，没有产生多聚一类。但是，当生长在莫姆斯，产生约192纳米摩尔聚P每毫克总蛋白质。缺乏多P激酶的大肠杆菌三角洲ppk突变体在这两种介质中都没有产生聚丙烯。

一种缺乏外氨甘油酶的增量ppx突变体产生的聚丙烯与野生型的聚丙烯数量大致相同。而在磷酸盐运输中存在缺陷的三角洲磷酸突变体产生的聚丙烯比野生型的聚丙烯明显少。野生型L.reuteri，一种在 MEIC 介质中一夜之间生长的克阳性细菌，每毫克总蛋白累积约 51 纳米摩尔聚丙烯。

缺乏多聚P激酶的L.reuterippk1空突变体含有不到一半这个量。ppk1 null 突变体中多边蛋白的这种存在可能是由于 L.reuteri 含有第二个聚氨酯激酶。分枝杆菌smegmatis菌株SMR 5，生长在哈特曼斯-德邦特介质在没有乙醇的情况下累积约141纳米摩尔聚丙烯每毫克总蛋白。

而乙醇处理导致三倍的增长。按照此程序，可以执行丙烯酰胺凝胶电泳，以评估聚P链长度的差异。尝试此过程时，避免常见错误。

请记住，避免在微蒂板孔中产生气泡，在从柱体切换到微管时，注意将样品转移到适当的管中。不要忘记，使用 GITC 和强酸可能很危险，执行此过程时应始终佩戴适当的防护设备。