检测细菌中的无机多聚磷酸盐

无机多聚磷酸盐是细菌应激反应中的关键组分。但以往提取和测定细菌中多聚磷酸盐（polyP）的方法复杂且耗时耗力。本技术的主要优势在于，能够快速、灵敏且低成本地定量多种不同细菌物种中的多聚磷酸盐水平。

该实验步骤将由我实验室的本科生 Arya Pokhrel 演示。首先，在不含半胱氨酸的苹果酸酶诱导培养基中，于 37 摄氏度静置培养罗伊氏乳杆菌过夜。取 1 毫升过夜培养物，置于 1.5 毫升微量离心管中离心，以收集足够量的细胞，获得总计 50 至 100 微克的细胞蛋白。

完全去除细胞沉淀中的上清液，然后加入250 µL GITC裂解缓冲液，通过涡旋振荡重悬细胞。在95 °C下孵育10分钟以裂解细胞。将裂解液储存于-80 °C。

首先，配制含有 0、1、2 和 4 毫克/毫升 BSA 的 BSA 标准品，溶于 GITC 裂解缓冲液中。取 5 微升已解冻并充分混匀的细胞裂解液，以及 5 微升 BSA 标准品，分别加入透明 96 孔板的不同孔中。每孔加入 195 微升 Bradford 试剂，然后在酶标仪中于 595 纳米处测定吸光度。

根据手稿中所述的 BSA 标准曲线，计算每个孔中的蛋白含量。为确定每个样本中的总蛋白量，将所得数值乘以 05。开始多聚磷酸盐提取时，向每个 GITC 裂解的样本中加入 250 微升 95% 乙醇，并涡旋混匀。

将此混合物用移液器转移至置于1.5毫升离心管中的硅胶膜离心柱中。在16,100 g条件下离心30秒。弃去滤过液，加入750微升三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、EDTA和乙醇的混合液。

在16,100 ×g下离心30秒。弃去流出液，将吸附柱在16,100 ×g下离心2分钟。将吸附柱置于一支干净的1.5毫升微量离心管中。

加入150微升50毫摩尔、pH 8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），在室温下孵育5分钟。通过在8,000 g离心2分钟洗脱聚磷酸盐（polyP）。首先配制标准品，其中含有0、5、50或200微摩尔的磷酸钾，溶于50毫摩尔、pH 8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）中。

将每种磷酸盐标准品各100微升以及提取的polyP样品各100微升分别加入透明96孔板的不同孔中。按每份样品配制主混合液：30微升5X ScPPX反应缓冲液、19微升水和1微升纯化的ScPPX。向96孔板的每个孔中加入50微升该主混合液。

在37摄氏度下孵育15分钟。在检测当天，通过将9.12毫升检测溶液基础液与88毫升1摩尔抗坏血酸混合，配制新鲜的检测工作液，并在使用前使其恢复至室温。向96孔板中的每个样品和标准品孔中加入50微升检测溶液。

为使颜色充分显色，在室温下孵育反应板约两分钟。使用酶标仪在882纳米波长处测定吸光度，并通过与磷酸钾标准曲线比较，计算各样品的磷酸盐浓度。随后将磷酸盐浓度转换为每份细胞裂解液中来源于聚磷酸盐（polyP）的磷酸盐纳米摩尔数，并根据文中所述方法，将细胞内polyP含量归一化至总细胞蛋白量。

在LB培养基中培养的野生型大肠杆菌（E.coli），一种革兰氏阴性细菌，不产生聚磷酸盐（polyP）；但在MOPS培养基中培养时，每毫克总蛋白可产生约192纳摩尔的polyP。缺乏聚磷酸激酶的E.coli delta ppk突变株在两种培养基中均不产生polyP。

缺乏外切多聚磷酸酶的Δppx突变株产生的多聚磷酸盐（polyP）量与野生型大致相同。而磷酸盐转运缺陷的ΔphoB突变株产生的polyP量则显著低于野生型。野生型罗伊氏乳杆菌（L.reuteri），一种在MEIC培养基中过夜培养的革兰氏阳性细菌，每毫克总蛋白约积累51纳摩尔的polyP。

缺乏 polyP 激酶的 L.reuteri ppk1 缺失突变株所含 polyP 不足该含量的一半。ppk1 缺失突变株中仍存在 polyP 可能是由于 L.reuteri 含有第二种 polyP 激酶。在 Hartmans-de Bont 培养基中无乙醇条件下培养的耻垢分枝杆菌 SMR5 菌株，每毫克总蛋白积累约 141 纳摩尔的 polyP。

尽管乙醇处理导致了三倍的增加。按照此步骤操作后，可进行丙烯酰胺凝胶电泳以评估聚磷酸链长度的差异。在尝试该步骤时，应避免常见错误。

请注意避免在微量滴定板孔中产生气泡，从离心柱转移样本至微量离心管时，务必小心确保样本转入正确的管中。请勿忘记，使用异硫氰酸胍（GITC）和强酸具有潜在危险性，进行本实验操作时应始终佩戴适当的个人防护装备。