Name: 原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习原子力显微镜成像技术，用于研究核小体结构与动力学特性，包括CENP-A着丝粒核小体的单分子水平定量分析。该方法可在生理条件下实现纳米级高分辨率直接可视化。

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作者贡献：YLL 和 MSD 设计了项目；MSD 构建了核小体；MSD 和 ZS 进行了原子力显微镜实验及数据分析；所有作者共同撰写并修改了手稿。

1. 单核小体的连续稀释组装
<ol>
	<li>生成并纯化一段约400 bp的DNA底物，该底物包含一个偏心的Widom 601核小体定位序列。55 
	注意：为了限制双核小体的非预期形成，位于定位序列两侧的每条“臂”长度不应超过约150 bp。
	<ol>
		<li>使用质粒pGEM3Z-601及设计的引物，通过PCR扩增底物DNA。对于本实验中使用的423 bp底物（其臂长分别为122 bp和154 bp），采用正向引物（5’-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3’）和反向引物（5’-ACAGCTATGACCATGATTAC-3’）。</li>
		<li>将含有反应混合物的试管加入预热至 95 的 PCR 仪中 &#176;C. 初始变性：95℃下5分钟；随后进行33个循环的下列程序 &#176;C：95℃下变性30秒 &#176;C，49℃下退火30秒 &#176;C，72℃延伸35秒 &#176;C. 设置72℃的最终延伸步骤 &#176;C，持续10分钟，紧随33个循环之后。</li>
		<li>使用市售PCR纯化试剂盒从PCR混合物中纯化DNA。从PCR纯化柱洗脱DNA时，使用10 mM Tris缓冲液（pH 7.5）替代试剂盒提供的洗脱缓冲液。 
		注意：在纯化步骤之间应格外小心，避免缓冲液的交叉转移。被污染的洗脱液可能在测定DNA浓度时导致问题，和/或改变核小体组装混合物的起始盐浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过测量纯化后DNA在260 nm处的吸光度来确定DNA浓度。
	<ol>
		<li>使用10 mM Tris pH 7.5洗脱缓冲液在紫外-可见分光光度计上采集空白对照。然后测定纯化DNA的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浓度确定后，取25 pmol纯化的DNA加入0.6 mL离心管中，置于真空离心浓缩仪中，直至溶液几乎不可见，通常需要30分钟至1小时。 
	注意：DNA底物现已准备好用于核小体组装。否则，本实验方案可在此暂停，将DNA于-20℃保存 &#176;C，直至使用。</li>
	<li>将含有 25 pmol DNA 的微量离心管置于冰上，并依次加入核小体组装组分 表1，按所列顺序添加。所有组分加完后，将混合物从冰上取出，在室温（RT）下孵育30分钟。 
	注意：在计算达到 2 M 终浓度所需的 NaCl 时，必须考虑储备组蛋白缓冲液中的盐含量。15,56</li>
	<li>通过连续稀释法将混合物的2 M盐浓度降低至200 mM，以组装核小体。57
	<ol>
		<li>用注射器吸取100 &#181;含10 mM Tris（pH 7.5）的稀释缓冲液L置于注射泵上。</li>
		<li>将注射器针头穿过微量离心管盖上的预穿孔，确保与组装混合物接触图1).</li>
		<li>以 0.75 的速率运行注射泵 &#181;L/min，持续 120 分钟。 
		注意：所得的100 &#181;L 溶液含有 250 nM 核小体和 200 mM NaCl。</li>
		<li>将混合物转移至10 K MWCO透析装置中，用200 mL预冷（4 °C）的透析缓冲液进行透析 &#176;C) 低盐缓冲液（含10 mM Tris pH 7.5、0.25 mM EDTA和2.5 mM NaCl），4℃孵育1小时 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为评估核小体组装的组蛋白含量，按照先前所述方法制备含有15%分离胶和6%浓缩胶的不连续SDS-PAGE凝胶30.
	<ol>
		<li>分装 10 - 20 &#181;将 L 的核小体储备液加入微量离心管中，加入 4x Laemmli 上样缓冲液，使其工作浓度为 1 - 2x。58</li>
		<li>作为对照，在另一个微量离心管中重复此制备步骤1 - 2次 &#181;g 组蛋白储备液。将样品在 95 &#176;约 5 分钟，4 ℃</li>
		<li>将样品加样至凝胶中相邻的泳道。在未使用的泳道中加入上样缓冲液，以促进条带均匀迁移。</li>
		<li>以65 V电压电泳，直至染料前沿通过浓缩胶。当到达分离胶时，将电压升至150 V，继续电泳至染料前沿完全迁出凝胶。</li>
		<li>拆卸电泳装置，并将凝胶轻轻转移至装有dd H₂O的染色容器中2O. 将凝胶在轻柔振荡下静置5分钟。用新鲜的dd H₂O重复此过程两次。2每次使用 O。 
		注意：本实验方案中使用的考马斯亮蓝染色无需典型的考马斯亮蓝染色固定步骤（参见 材料表）如果使用其他考马斯亮蓝试剂，请根据需要调整固定步骤。</li>
		<li>去除最后一次漂洗的水，加入足量染色液以覆盖凝胶。在轻柔振荡条件下使凝胶染色至少1小时。 
		注意：染色过程中，可将染色容器置于任何能够促进染液在凝胶表面流动，同时保持凝胶完全浸没于液体中的装置上。</li>
		<li>从容器中移除染色剂，并用dd H₂O冲洗凝胶2O. 更换 dd H2O，并在轻微振荡下浸泡凝胶30分钟。（凝胶应呈现如图所示的外观） 图2，组蛋白条带分离清晰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将核小体在4℃下保存 &#176;C，直至使用。 
	注意：在这些条件下储存时，核小体可保持数月稳定。本实验方案可在此暂停。</li>
</ol>
2. 用于核小体静态原子力显微镜成像的云母表面功能化
<ol>
	<li>按照所述方法，用去离子水配制50 mM 1-(3-氨基丙基)硅杂恶烷（APS）储备液。30 将该溶液以 1 mL 分装液在 4 ℃ 下保存 &#176;C，直至使用。 
	注意：这些分装样品可在 4 ℃ 下保存超过一年 &#176;C.59</li>
	<li>将50 μL APS原液溶于15 mL去离子水中，配制1:300的工作液用于云母片修饰 &#181;50 mM APS 母液 15 mL dd H₂O2O. 
	注意：该工作液可在室温下保存数天。</li>
	<li>从高质量云母片上切割出 1 × 3 cm 的云母条（参见 材料表 用于此处所用的云母。
	<ol>
		<li>检查该云母片放入比色皿时是否可对角放置。使用尖头镊子、刀片或透明胶带剥离云母层，直至两面均新鲜剥离且厚度约为 0.1 mm（图3A). 立即将云母片放入盛有APS的比色皿中，孵育30分钟（图3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将云母片转移至装有dd H₂O的比色皿中2O，并浸泡30秒（图3C在氩气流下将APS-mica条的两面完全干燥。 
	注意：可使用无纺聚酯纤维和纤维素洁净室擦拭布（推荐擦拭布详见材料部分）帮助吸除云母边缘在干燥过程中的水分。</li>
	<li>使用干燥的云母条进行样品制备。否则，将云母片保存在洁净、干燥的比色皿中（图 3D). 
	注意：当环境潮湿时，建议在真空中额外储存1-2小时。本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
3. 用于静态原子力显微镜成像的 APS-云母上核小体样品的制备
<ol>
	<li>将双面胶带贴在多个磁性样品托上，并将其放置在旁边。</li>
	<li>将APS-mica基底切割成所需尺寸（本实验所用MM型原子力显微镜为1 × 1 cm的正方形）。将切割后的基底片放入洁净的培养皿中，并保持加盖保存。</li>
	<li>制备组装好的核小体的三种稀释液（终浓度分别为 0.5、1.0 和 2.0 nM），使用 0.22 &#181;m 过滤缓冲液，含 10 mM HEPES（pH 7.5）和 4 mM MgCl2. 
	注意：为尽量减少在低终浓度下核小体的损失，稀释操作应逐次进行，并在核小体沉积到APS-云母表面前立即完成。</li>
	<li>加入5-10 &#181;在 APS-云母片中央加入稀释后的核小体样品 L，孵育两分钟。用 2–3 mL 去离子水轻轻冲洗样品2以去除所有缓冲液成分。每次加入约0.5 mL的dd H₂O后2O使用后，轻轻摇晃云母片以去除多余的冲洗水。 
	注意：建议使用一次性注射器进行此冲洗步骤。</li>
	<li>在沉积的样品上用洁净的氩气轻柔吹拂使其干燥。 
	注意：样品现已准备好进行成像，或可储存于充满氩气的真空柜或干燥器中。按照上述方法制备并储存的样品在制备一年后成像仍无质量损失。本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
4. 核小体的静态原子力显微镜成像
<ol>
	<li>将原子力显微镜（AFM）探针安装到探针 holder 上。使用弹簧常数约为 40 N/m、共振频率在 300 至 340 kHz 之间的探针（参见材料表中列出的所用悬臂梁）。</li>
	<li>将第 3 节中制备的样品小心地安装到 AFM 样品台上，避免接触样品表面。</li>
	<li>调整激光位置，使其照射在悬臂梁上，直到信号总和达到最大值，并调节垂直和横向偏转值接近零。</li>
	<li>调节 AFM 探针以确定其共振频率，调整驱动振幅，并将成像尺寸设置为 100 × 100 nm。点击“engage”按钮开始接近样品。</li>
	<li>接近完成后，逐步优化振幅设定点，直至样品表面清晰可见。将扫描尺寸增大至 1 × 1 µm，分辨率提高至 512 × 512 像素。依次点击 capture 按钮和 engage 按钮，开始图像采集。 
	注意：图 4 中的图像展示了此类样品成像时预期获得的平滑背景。</li>
	<li>为分析核小体样品，使用 AFM 仪器配套的分析软件打开所采集的图像。
	<ol>
		<li>使用多项式基线扣除或类似功能对图像进行平整处理。</li>
		<li>设置颜色标尺，使最低值对应最小高度，最高值对应最大高度。记录每幅图像的这些数值，后续步骤中将需要用到。 
		注意：若未使用这些数值，后续分析中的高度数据将不准确，核小体核心的截面图将显示为等高平台，而非实际的高度变化。</li>
		<li>以原始尺寸将图像导出为 .tiff 格式。取消勾选任何包含边框或比例尺的保存选项。</li>
		<li>使用具备轮廓长度测量功能的分析软件打开图像。</li>
		<li>设置 x、y 和 z 轴的比例，使其与图像匹配。</li>
		<li>作为内部长度校准，测量并记录一条游离 DNA 从一端到另一端的轮廓长度。利用这些测量值生成直方图，并用正态（高斯）分布进行拟合。将峰值中心（xc）除以该 DNA 模板的碱基对长度。 
		注意：该数值为图像特异性的纳米米到 DNA 碱基对的转换因子。</li>
		<li>为保持一致性，测量并记录每个核小体两条臂从臂的游离末端至核心中心的轮廓长度（图 5A）。</li>
		<li>对每个核小体核心，从一对相互垂直的核心截面测量中获取两个半高全宽（FWHM）值（图 5B）。取两个 FWHM 测量值的平均值，并将该平均值的一半从每条核小体臂的测量长度中减去，以校正从 DNA 出入点到核心中心之间被计入但不属于臂长的部分。</li>
		<li>将每条臂的长度除以计算得到的校准因子（步骤 4.5.6），得到以 DNA 碱基对表示的臂长。</li>
		<li>通过从去折叠模板的总碱基对长度中减去核小体臂长之和，计算 DNA 缠绕程度。将这些值绘制成直方图，并用正态（高斯）分布拟合峰形，以获得核小体群体的平均缠绕碱基对数。</li>
		<li>根据测得的截面数据计算核小体的平均高度。将该值绘制成直方图，并用正态（高斯）分布拟合峰形，以获得核小体群体的高度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 核小体动力学的延时原子力显微成像
<ol>
	<li>将原子力显微镜（AFM）探针安装到探针 holder 上。可使用弹簧常数约为 0.1 N/m、共振频率为 7–10 kHz 的探针（参见材料列表中所用的悬臂梁）。</li>
	<li>使用双面胶带将一块 1 × 1 cm 的 APS-云母片固定在磁性载片上，并将该载片安装至原子力显微镜仪器中。</li>
	<li>将核小体稀释至 1 nM 浓度，溶于经 0.22 µm 滤膜过滤的成像缓冲液中，缓冲液组成为 10 mM HEPES（pH 7.5）和 4 mM MgCl2。</li>
	<li>取 5–10 µL 稀释后的核小体溶液滴加于云母片中心，孵育 2 分钟。随后用 20 µL 成像缓冲液冲洗样品两次。第二次冲洗后，在表面保留一滴成像缓冲液。</li>
	<li>使用顶视摄像机定位探针，并手动接近样品表面，直至探针距离表面约 100–500 µm。</li>
	<li>加入额外的成像缓冲液，以填充探针与表面之间的空隙。在此示例中，约 50 µL 成像缓冲液足以填满该空隙。寻找探针的共振峰。</li>
	<li>启动计算机控制的探针接近表面程序。接近完成后，先以 1–2 µm 的扫描范围成像，从中选择一个约 500 nm 的目标区域。选定目标区域后，将数据采集密度调整为 512 × 512 像素。</li>
	<li>调节设定点电压和驱动振幅参数以优化图像质量。可采用自由振幅不超过 10 nm、扫描速率约为 2 Hz 的条件来获取高质量图像。使用时间序列原子力显微镜捕获的核小体动力学示例见图6。</li>
</ol>
6. 核小体动力学的高速时间分辨原子力显微成像
注意：以下方案适用于由安藤团队（日本金泽市金泽大学）开发的高速原子力显微镜（HS-AFM）仪器。60
<ol>
	<li>为液体成像制备APS云母。
	<ol>
		<li>使用玻璃棒-扫描仪胶水将玻璃棒固定在原子力显微镜（AFM）扫描仪台上（参见材料表）。静置干燥至少10分钟。</li>
		<li>从较大的云母片上 punch 出直径为1.5 mm、厚度约为0.1 mm的圆形云母片。使用高速原子力显微镜（HS-AFM）专用的云母-玻璃棒胶水（参见材料表）将该云母片粘附至HS-AFM的玻璃棒上，并静置干燥至少10分钟，期间避免触碰。使用压力敏感胶带剥离云母层，直至胶带上出现平整的新鲜解理面。</li>
		<li>将1 µL的50 mM APS储备液加入99 µL的dd H2O中，配制成500 µM的APS溶液。取2.5 µL该溶液滴加至新鲜解理的云母表面，静置功能化30分钟。 
		注意：为防止功能化过程中表面干燥，可将50 mL锥形离心管的盖子内放置一片湿润的滤纸，然后罩在扫描仪上。用于液体成像的APS储备液稀释倍数比静态成像少3倍，以控制动力学速率至AFM可观测的范围。</li>
		<li>用20 µL的dd H2O分多次（每次约3 µL）冲洗云母表面。每次冲洗后，将无纺布擦拭纸置于云母边缘彻底去除残留水分。最后一次冲洗后，在表面保留约3 µL的dd H2O，静置至少5分钟，以去除非特异性结合的APS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将探针装入HS-AFM探针夹持器中，并将夹持器放置在AFM扫描台上，使探针朝上。先用约100 µL的dd H2O冲洗夹持器，随后用0.22 µm过滤的核小体成像缓冲液（含10 mM HEPES pH 7.5和4 mM MgCl2）冲洗两次，每次约100 µL。</li>
	<li>完成冲洗后，向腔室中加入约100 µL核小体成像缓冲液，使探针完全浸没。调节悬臂位置，使其被激光照射到。用过滤的核小体成像缓冲液冲洗APS云母表面，共20 µL，每次约4 µL。</li>
	<li>取1 µL核小体组装储备液，加入250 µL过滤的核小体成像缓冲液中，得到终浓度为1 nM的核小体溶液。取2.5 µL该稀释液滴加至云母表面，静置2分钟。随后用约4 µL核小体成像缓冲液冲洗表面两次。最后一次冲洗后，保持表面覆盖成像缓冲液。 
	注意：若在滴加核小体样品后不进行冲洗，表面将迅速变得过度密集。</li>
	<li>将扫描仪和样品倒置放置在探针夹持器上方，使样品面向下。开始接近时，使用自动接近功能，设定振幅As接近自由振荡振幅A0。 
	注意：理想情况下As = 0.95 A0，但若操作谨慎，A0的82%也可正常工作。</li>
	<li>调节设定点，直至表面被良好追踪。 
	注意：为最小化AFM探针向核小体样品传递的能量，应保持悬臂振幅较小，最佳振幅可低至1 nm。</li>
	<li>设置成像区域约为150 × 150 nm至200 × 200 nm，数据采集速率约为每帧300 ms。 
	注意：此成像尺寸通常足以同时捕捉多个核小体的动力学行为。若表面颗粒密度较低，可能需要调整这些参数。建议的帧率足以捕捉如DNA环化、滑移和解缠绕等核小体动力学过程（详见下文“代表性结果”部分）。</li>
</ol>
7. 利用时间序列原子力显微镜捕获的核小体动力学分析
<ol>
	<li>将高速原子力显微镜（HS AFM）数据类型（.asd）图像转换为 .tiff 图像。
	<ol>
		<li>使用原子力显微镜系统的分析软件，通过平面或线性函数对图像进行平整处理，直至背景具有均匀的对比度。</li>
		<li>将图像对比度（颜色标尺）设置为自动。 
		注意：出于展示目的可手动调整对比度，但不得用于图像分析。手动调整会导致转换后图像中的高度细节丢失。</li>
		<li>将选定范围的图像保存为 .mov 文件。保存前请取消勾选标尺和边框选项。 
		注意：不得对帧内含有标尺的图像进行分析。标尺会改变图像尺寸，导致测量结果不准确。</li>
		<li>使用合适的软件（参见材料表）将 .mov 文件转换为 tiff 图像。转换时使用的帧率应与创建 .mov 文件时的帧率相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行臂长轮廓测量时，在支持此类测量的软件中打开图像（参见材料表）。
	<ol>
		<li>将图像尺寸设置为与其原始采集尺寸一致。</li>
		<li>测量每个核小体臂从臂末端到核小体核心中心的轮廓长度，并将测量值记录在电子表格中（图4A）。</li>
		<li>在核小体解旋后的帧中测量未缠绕DNA底物的长度。该数据用于特定视频的 nm/bp 比例校准，以进行核小体缠绕计算。</li>
		<li>采集两条核小体核心的截面轮廓和两条裸露DNA的截面轮廓（图4B）。</li>
		<li>将截面轮廓导入电子表格软件，并通过从轮廓中所有数据点减去最低 z 值的方式对曲线进行归一化处理。</li>
		<li>计算每条截面轮廓的高度和半高全宽（FWHM），并对每帧中的两条轮廓值取平均。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从各核小体臂长中减去一半的 FWHM 值，然后以散点图形式绘制，并同时绘制臂长总和的计算值。
	<ol>
		<li>根据核小体解旋后帧中DNA的测量结果，计算DNA的平均轮廓长度。</li>
		<li>通过将游离DNA的平均轮廓长度除以DNA底物的碱基对长度，确定 nm/bp 校准因子。使用该值计算每一帧中的核小体缠绕程度，具体方法见第5.12节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方案相当直接，并能提供高度可重复的结果，尽管有几个重要问题需要强调。功能化的APS云母是获得可靠且可重复结果的关键基底。APS云母具有高稳定性，这是该基底的一个重要特性，允许提前制备成像基底，并可在制备后至少两周内使用。59,61 然而，若使用胶水将云母固定在金属载片上，胶水蒸气可能会损坏表面。因此，建议按照本方案（第2节）所述，使用双面胶带固定云母。在必须使用胶水的情况下（例如，某些用户在液体成像时将云母粘附于金属圆片上），推荐采用以下改进步骤，该步骤源自第6.1.3节中针对HS-AFM成像样品制备的描述：先将云母粘接到金属圆片或其他固体材料上，在胶水固化后进行解理。用氩气吹扫云母表面，以去除可能残留的胶水蒸气。随后可用透明胶带对云母进行解理，并将APS工作液滴加至新鲜解理的云母条表面，溶液用量取决于云母条的尺寸。让APS反应30分钟。为尽量减少蒸发，应在湿润的培养皿中进行反应。具体操作如下：将实验室擦拭纸浸湿后置于培养皿底部，再将一个5 mm厚的塑料圆片放在湿纸上，然后将带有粘附云母的金属圆片放置于塑料圆片上，避...

在真核细胞中，DNA 高度压缩并组织成染色体。1 染色体内的第一级 DNA 组织形式是核小体的组装，其中 147 bp 的 DNA 紧密缠绕在组蛋白八聚体核心周围。2,3 核小体颗粒在长链 DNA 分子上组装形成染色质阵列，随后进一步折叠，最终形成高度压缩的染色体结构。4 染色质的解聚使得关键的细胞过程（如基因转录和基因组复制）能够接触到游离的 DNA，这表明染色质是一个高度动态的系统。5,6,7 理解 DNA 在不同染色质层次上的动态特性，对于阐明分子水平上的遗传过程至关重要，因为这些过程中的错误可能导致细胞死亡或癌症等疾病的发生。8 染色质的一个重要特性是核小体的动力学行为。9,10,11,12 这些颗粒的高度稳定性使其能够通过晶体学技术进行结构表征。2 然而，这些研究缺乏对核小体动态细节的揭示，例如 DNA 从组蛋白核心解缠的机制；而这一动态路径正是转录和复制过程所必需的。7,9,13,14,15,16 此外，一类被称为重塑因子的特殊蛋白质已被证明可促进核小体颗粒的解聚17；然而，核小体本身的内在动力学才是推动整个解聚过程的关键因素。14,16,18,19
单分子技术，如单分子荧光19,20,21、光镊（光阱）13,18,22,23 和原子力显微镜（AFM）10,14,15,16,24,25,26，在理解核小体动力学方面发挥了关键作用。在这些方法中，AFM 具有若干独特且吸引人的优势。AFM 能够对单个核小体以及更长的核小体阵列进行可视化和表征27。通过 AFM 图像，可以测量核小体结构的重要特征，例如缠绕在组蛋白核心上的 DNA 长度10,14,26,28；这一参数对于表征核小体解缠动力学至关重要。以往的 AFM 研究表明，核小体是高度动态的体系，DNA 可以从组蛋白核心上自发解缠14。当在水溶液中以延时成像模式操作 AFM 时，可直接观察到 DNA 从核小体上的自发解缠过程14,26,29。
高速时间分辨原子力显微镜（HS-AFM）仪器的出现使得在毫秒时间尺度上直接观察核小体解缠绕过程成为可能14,15,24。近期针对着丝粒特异性核小体的HS-AFM16,30研究揭示了与经典核小体相比，着丝粒核小体具有若干新特征。着丝粒核小体由着丝粒构成，后者是染色体上对染色体分离至关重要的一个小区域31。与常规染色质中的经典核小体不同，着丝粒核小体的组蛋白核心包含CENP-A组蛋白而非组蛋白H332,33。由于这种组蛋白的替换，着丝粒核小体中的DNA缠绕长度约为120 bp，而经典核小体为约147 bp；这一差异可能导致着丝粒核小体阵列与经典核小体阵列在形态上存在显著差异34，提示着丝粒染色质的动力学行为较常规染色质更为活跃。HS-AFM研究中观察到的着丝粒核小体所展现的新动态特征16,30，充分体现了该单分子技术在直接可视化核小体结构与动态特性方面的独特优势。本文末尾将简要讨论并图示这些特征。上述进展得益于核小体AFM成像新实验方案的开发以及对现有方法的改进。本文所述实验方案的目标是使这些激动人心的单分子AFM核小体研究进展能够被所有希望在其染色质研究中应用这些技术的研究人员所掌握。文中描述的许多技术不仅适用于核小体研究，还可用于其他感兴趣的蛋白质和DNA系统的探究。此类应用的若干实例可见于相关文献35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49，而AFM在各类生物分子系统研究中的前景则已在综述中有所阐述29,50,51,53,54。

<table><tbody><tr><td>质粒 pGEM3Z-601</td><td>Addgene，马萨诸塞州剑桥</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>IDT，爱荷华州科拉尔维尔</td><td>定制订购</td><td>(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'</td></tr><tr><td>DreamTaq 聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>EP0701</td><td>200 单位的目录编号</td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen，德国希尔登&amp;nbsp;</td><td>28104</td><td>50 单位的目录编号</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>10708976001</td><td>250 g 的目录编号</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>15576028</td><td>500 g 的目录编号</td></tr><tr><td>(CENP-A/H4)2，重组人源</td><td>EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆</td><td>16-0010</td><td>50 µg 的目录编号</td></tr><tr><td>H2A/H2B，重组人源</td><td>EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆</td><td>15-0311</td><td>50 µg 的目录编号</td></tr><tr><td>H3 八聚体，重组人源</td><td>EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆</td><td>16-0001</td><td>50 µg 的目录编号</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置套件，10K MWCO，0.1 mL</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>69574</td><td>10 个装置的目录编号</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>S9888-500G</td><td>500 mg 的目录编号</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5&amp;nbsp;mL 离心滤膜&amp;nbsp;</td><td>Millipore-sigma，密苏里州伯灵顿</td><td>UFC501008</td><td>8 个装置的目录编号</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>258148-25ML</td><td>25 mL 的目录编号</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>T0377-25G</td><td>25 g 的目录编号</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>11667289001</td><td>1 kg 的目录编号</td></tr><tr><td>过硫酸铵 (AmmPS)&amp;nbsp;</td><td>伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯</td><td>1610700</td><td>10 g 的目录编号</td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1</td><td>伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯</td><td>1610158</td><td>500 mL 的目录编号</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯</td><td>1610800</td><td>5 mL 的目录编号</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 用 4x Laemmli 蛋白上样缓冲液</td><td>伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯</td><td>1610747</td><td>10 mL 的目录编号</td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>M6250-10ML</td><td>10 mL 的目录编号</td></tr><tr><td>ageRuler 预染蛋白 Marker&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>26616</td><td>500 µL 的目录编号</td></tr><tr><td>Bio-Safe&amp;trade; 考马斯亮蓝染色液</td><td>伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯</td><td>1610786</td><td>1 L 的目录编号</td></tr><tr><td>无纺洁净室擦拭布：TX604 TechniCloth&amp;nbsp;</td><td>TexWipe，北卡罗来纳州凯尔纳维尔</td><td>TX604</td><td></td></tr><tr><td>云母片（Muscovite Block Mica）</td><td>AshevilleMica，弗吉尼亚州纽波特纽斯</td><td>Grade-1</td><td></td></tr><tr><td>氨基丙基三烷氧基硅烷 (APS)</td><td>按文献22所述方法合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>H4034-25G</td><td>25 g 的目录编号</td></tr><tr><td>透明胶带（Scotch Tape）</td><td>Scotch-3M，明尼苏达州圣保罗</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TESPA-V2 原子力显微镜探针（用于静态成像）</td><td>Bruker AFM Probes，加利福尼亚州卡马里奥</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSNL-10 原子力显微镜探针（用于标准时间序列成像）</td><td>Bruker AFM Probes，加利福尼亚州卡马里奥</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aron Alpha 工业级强力胶</td><td>Toagosei America，俄亥俄州西杰斐逊</td><td>AA480</td><td>2 g 管装的目录编号</td></tr><tr><td>MgCl₂</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>M8266-100G</td><td>100 g 的目录编号</td></tr><tr><td>Millex-GP 滤器，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>SLGP05010</td><td>10 个装置的目录编号</td></tr><tr><td>BL-AC10DS-A2 原子力显微镜探针（用于高速原子力显微镜，HS-AFM）</td><td>奥林巴斯，日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化合物 FG-3020C-20&amp;nbsp;</td><td>FluoroTechnology Co., Ltd.，日本爱知县春日井市鹿ケ谷&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化合物 FS-1010S135-0.5&amp;nbsp;</td><td>FluoroTechnology Co., Ltd.，日本爱知县春日井市鹿ケ谷&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiMode 原子力显微镜</td><td>Bruker-Nano/Veeco，加利福尼亚州圣塔芭芭拉</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速时间序列原子力显微成像系统</td><td>安藤俊夫，金泽大学纳米生命科学研究所，日本金泽市额田町</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

染色质是由核小体亚基组成的长链结构，是一种动态系统，使得真核细胞中DNA复制和转录等关键过程得以进行。核小体的动态特性为复制和转录机器提供了接触DNA的途径，并在染色质功能的分子机制中发挥关键作用。单分子研究技术（如原子力显微镜（AFM）成像）极大地促进了我们对核小体结构与动态功能的理解。本实验方案描述了利用高分辨率AFM成像技术研究核小体结构与动态特性的具体步骤。该方案以着丝粒核小体的AFM数据为例进行说明，其中组蛋白H3被其同源蛋白着丝粒蛋白A（CENP-A）所取代。方案首先采用连续稀释法组装单核小体。用于核小体成像的云母基底需经氨基丙基硅杂环（APS-云母）功能化处理，该基底的制备对AFM可视化核小体至关重要，文中也提供了详细的基底制备流程。沉积在APS-云母表面的核小体首先通过静态AFM成像，以获取核小体群体的静态图像。通过分析这些图像，可测量核小体周围DNA缠绕长度等参数，该分析过程亦有详细说明。文中还描述了在液体环境中进行时间序列AFM成像的步骤，该高通量时间序列AFM技术每秒可捕获多个核小体动态过程的图像帧。最后，介绍了对核小体动态行为的分析方法，可用于对动态过程进行定量表征，并附有实例说明。

首先采用连续稀释组装法（图1）制备单核小体，用于原子力显微镜（AFM）成像实验。制备的核小体随后通过非连续SDS-PAGE进行检测（图2）。接下来，使用APS对云母表面进行功能化修饰，使核小体能够被捕获至表面，同时保持背景平滑，以实现高分辨率成像（图3）。将核小体沉积在APS修饰的云母表面，并通过静态AFM成像进行观察。为控制组装与沉积过程，制备了H3单核小体并进行静态AFM成像。H3单核小体的图像（图4A）展示了沉积前瞬间的核小体群体状态，证实核小体已成功组装。2 nM的核小体沉积浓度在表面实现了核小体和DNA颗粒的均匀分布，几乎未观察到聚集或拥挤现象。
在H3对照组核小体组装成功的基础上，接下来将所述方法应用于CENP-A核小体的研究。该样品的静态原子力显微镜成像（图4B）显示，CE...

本文介绍了一种利用静态和时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术在单分子水平上表征核小体颗粒的实验方案。所述的表面功能化方法可实现对核小体结构及其动态行为在纳米尺度下的高分辨率捕捉。

染色质是由核小体亚基组成的长链结构，是一种动态系统，能够实现DNA复制和转录等关键过程……

该方案利用了原子力显微镜（AFM）的全部主要特性，而这些特性是其他单分子技术所不具备的。因此，我们能够在纳米尺度上解析核小体的结构。尤为重要的是，核小体的直接可视化是在生理条件下完成的。利用我们的原子力显微镜技术，我们近期揭示了着丝粒核小体的独特性质，这些性质可能在整条着丝粒的功能中发挥重要作用。本文所展示的方法目前在我们实验室中被用于研究与淀粉样蛋白聚集体形成相关的蛋白质自组装过程。这类蛋白质聚集体可引发多种严重疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森病等。这些简单的制备方法也适用于其他蛋白质-DNA复合物，包括诸如DNA复制机器之类的大体系，尽管需要进行一些修改。为了利用静态和时间序列原子力显微镜在单分子水平上表征核小体颗粒，首先需按照随附的文字实验方案对核小体进行纯化、组装和验证。接下来，准备静态原子力显微镜成像所需的云母表面。首先，用去离子水配制50 mM的APS储备液。将该溶液分装成每份1 mL，于4°C保存，直至使用时取出。从储备液中，通过将50微升的50微摩尔APS储备液溶解于15毫升去离子蒸馏水中，制备用于云母修饰的工作浓度APS溶液。混匀溶液后，取部分溶液注入比色皿中。接着，从高质量云母片上切割出1厘米×3厘米的云母条。将云母片对角线方向放入比色皿中，检查其是否合适。然后将云母层层剥离，直至两侧均呈新鲜剥离状态，且云母片厚度约为0.1毫米。立即将云母片放入盛有APS的比色皿中，孵育30分钟。将云母片转移至盛有去离子蒸馏水的比色皿中，浸泡30秒。随后，使用氩气彻底干燥APS云母条的两面。将双面胶带贴在多个磁性样品托上，并将其放置在旁边备用。然后，将 APS 云母基底切割成 1 厘米 × 1 厘米的正方形，并将其置于洁净的培养皿中覆盖保存。接着，使用孔径为 0.22 微米的滤膜过滤缓冲液（含 10 毫摩尔 HEPES 和 4 毫摩尔氯化镁，pH 7.5）配制组装好的核小体的三种不同稀释浓度。为减少核小体的损失，在较低终浓度条件下，应在沉积到 APS 云母基底前逐次进行稀释，并立即使用。取每种核小体样品五到十微升，滴加在APS云母片的中心位置，静置孵育两分钟。随后，用两到三毫升去离子蒸馏水轻轻冲洗样品，以去除缓冲液成分。最后，在氩气轻柔气流下将样品干燥。首先，在原子力显微镜（AFM）装置的探针支架上安装一个探针。然后，将第一个样品小心地放置在AFM载物台上，注意避免接触样品表面。调整激光位置使其对准悬臂，直到信号总和达到最大值，并调节垂直和横向偏转值至接近零。然后，调节原子力显微镜（AFM）探针以找到其共振频率，调整驱动振幅，并将图像尺寸设置为100乘以100纳米。设置完成后，单击“engage”按钮开始接近样品。当接近过程完成后，逐步优化振幅设定值，直至清晰观察到样品表面。然后，将扫描尺寸增大至1微米×1微米，分辨率提高至512×512像素。最后，点击采集按钮以开始图像获取。使用玻璃棒扫描仪胶水将玻璃棒固定到原子力显微镜（AFM）扫描仪载台上。静置干燥至少10分钟。在此期间，从较大的云母片上打孔制备直径为1.5毫米、厚度为0.1毫米的圆形云母片。使用高速原子力显微镜（AFM）云母玻璃棒专用胶将该云母片粘附至高速AFM的玻璃棒上，并静置至少10分钟使其完全干燥，期间避免触碰。然后，使用对压力敏感的胶带从云母上剥离层片，直至在胶带上观察到一个剥离良好的层。接下来，将1微升50毫摩尔的APS储备液溶于99微升去离子蒸馏水中，配制成500微摩尔的APS溶液。取2.5微升该溶液滴加到新近剥离的云母表面，静置30分钟使表面完成功能化。孵育结束后，用三微升去离子蒸馏水多次冲洗云母片表面。每次冲洗后，将无纺布擦拭纸置于云母片边缘，彻底去除残留水分。最后一次冲洗后，在表面加入三微升去离子蒸馏水，静置至少五分钟，以去除任何非特异性结合的APS。接下来，将探针放入高速原子力显微镜（AFM）样品 holder 中，并将 holder 放置在 AFM 样品台上，使针尖朝上。先用 100 µL 去离子蒸馏水冲洗 holder，随后用 0.22 µm 滤膜过滤的核小体成像缓冲液冲洗两次，每次 100 µL。完成冲洗后，向腔室中加入 100 µL 核小体成像缓冲液，浸没针尖。调节悬臂位置，直至其被激光照射到。随后，用过滤的核小体成像缓冲液对APS云母片进行五次冲洗，每次使用四微升。取一微升核小体组装原液，加入250微升过滤的核小体成像缓冲液中稀释，得到终浓度为一纳摩尔的核小体溶液。取2.5 µL该稀释液滴加于表面，静置2分钟。用4 µL核小体成像缓冲液冲洗表面两次，以避免过度密集。最后一次冲洗后，使表面保留成像缓冲液覆盖。将扫描仪和样品放置在探针架顶部，使样品朝下。开始接近时，使用自动接近功能，设定点振幅接近自由振荡振幅。调节设定点，直到表面被良好追踪。然后，将成像区域设置为约 150 × 150 纳米至 200 × 200 纳米，数据采集速率约为每成像帧 300 毫秒。作为组装与沉积的对照，制备 H3 单核小体并使用静态原子力显微镜（AFM）进行成像。该图像展示了核小体群体在沉积前瞬间的状态，证实核小体已成功组装。在H3对照组装成功的基础上，接下来将所述方法应用于CENP-A核小体的研究。该样品的静态原子力显微镜成像结果显示其组装成功。通过静态原子力显微镜图像，可对单核小体的高度和螺旋圈数进行表征。通过游离DNA臂之间的夹角以及游离DNA臂的长度来确定单个核小体中DNA的缠绕圈数。相比之下，核小体的时间序列原子力显微镜成像可用于直观展示核小体整体的自发解缠绕行为。随着核小体DNA缠绕圈数的减少，也可观察到核小体核心体积相应减小。除了常规的时间序列成像外，高速时间序列原子力显微镜（AFM）还可用于研究标准时间序列成像难以捕捉的更复杂的核小体动态过程。该技术能够在长时间内记录动态变化，这对于可视化持续1200帧的CENP-A核小体核心的长距离易位过程至关重要。该技术在捕获CENP-A核小体核心从一个DNA底物罕见转移至另一个DNA底物的过程中也发挥了关键作用。快速的图像捕获速率使得这一动态事件的可视化成为可能，因其仅需数帧即可完成。在广泛的染色质领域中，存在一系列重要问题，涉及组蛋白变体liger组蛋白以及组蛋白扩增在染色质动力学中的作用。所有这些问题均可通过我们的技术得到解答。

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Biochemistry

生物化学

原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用

在本视频中，我们演示了利用静态原子力显微镜观察组装好的核小体。这种高分辨率成像技术可用于研究核小体的结构。...

利用静态原子力显微镜观察和表征组装的核小体

在本视频中，我们展示了高速时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术，用于研究核小体复合物的动态过程。当AFM探针扫描核小体表面时，可检测核小体高度的变化，并记录DNA随时间解缠绕的过程。...

高速时间序列原子力显微镜捕捉核小体动态

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使用峰值力定量纳米力学性能成像对红光光感受器进行原子力显微镜观察

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。...

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

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使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

本文展示了利用光热非共振轻敲（PORT）技术观察生物分子相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统局限性，并探究了在三叉星DNA结构组装成像中的潜在改进方法。...

高速原子力显微镜成像技术用于DNA三点星形结构自组装的光热非共振轻敲模式研究

本文介绍了一种用于重建含核小体的DNA系链以进行单分子相关力与荧光显微镜检测的详细实验流程。此外，还描述了若干后续实验，可用于观察染色质相互作用蛋白的结合行为，并分析核小体物理性质的变化。...

原位核小体组装用于单分子关联力与荧光显微镜技术

我们提出了一种三色染色质单分子定位显微镜（SMLM）染色与分析方案，可实现常染色质、异染色质和RNA聚合酶II（RNAP...

一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

利用Bio3D-web研究蛋白质序列-结构-动力学关系

学习原子力显微镜成像技术，用于研究核小体结构与动力学特性，包括CENP-A着丝粒核小体的单分子水平定量分析。该方法可在生理条件下实现纳米级高分辨率直接可视化。

利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

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