原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用

该协议利用AFM的所有主要特性，不具有其他单分子技术。因此，我们能够在纳米尺度上解析核体结构。重要的是，在生理条件下直接对核糖体进行可视化。

使用我们的AFM技术，我们最近揭示了中分核体的独特特性，这些特性可以在整个百分位体的功能上发挥作用。显示的方法目前在我们的实验室中应用，以研究与淀粉样体聚合体形成相关的蛋白质的自组装。这些蛋白质聚集物引发阿尔茨海默氏和帕金森氏症等破坏性疾病的发展。

简单的制备方法也适用于其他蛋白质-DNA复合物，包括大型系统，如DNA复制机制。虽然需要一些修改。为了使用静态和延时原子力显微镜来描述单个分子水平的核体粒子，首先进行纯化、组装和验证原子体，如随附的文本协议所述。

接下来，为静态 AFM 成像准备云母表面。为此，首先在去维化水中准备一个五十毫摩尔的 APS 库存溶液。将溶液的一毫升等分在摄氏四度，直到需要。

从库存溶液中，通过溶解 15 毫升蒸馏脱压水中 50 微摩尔 APS 库存中的 50 微升来准备用于云母改性的工作 APS 解决方案。混合溶液，然后用溶液填充一个蛋黄酱。接下来，从高品质的云母片中切一个三厘米的云母条。

检查该件在对角线放置在 cuvette 中时是否适合合。然后，云母的切割层，直到两侧都新鲜切割，片薄至0.1毫米。立即将云母片放入 APS 填充的 cuvette 中，并孵育云母 30 分钟。

将云母片转移到装满蒸馏去维水的水杯中，浸泡30秒。然后，使用 argon 完全干燥 APS 云母条的两侧。将双面胶带涂抹在几个磁性球上，并将其放在侧面。

然后，将 APS 云母基板切割为一厘米一厘米的正方形，然后用干净的培养皿盖住它们。接下来，使用含有10毫摩尔血脂和4毫摩尔氯化镁的0.22微米过滤缓冲液，在PH为7.5的PH下，对组装的核糖体进行三次稀释。为了限制核糖体的损失，在低最终浓度时，在 APS 云母沉积之前，应一次进行一次稀释。

将每个核糖体样本的5至10微升放在一个PS云母片的中心，让它们孵育两分钟。然后，用两到三毫升的蒸馏去维化水轻轻冲洗样品，以去除缓冲液分量。在浅流下干燥沉积的样品。

首先，在 AFM 设置的尖端支架上安装一个尖端。然后，将第一个样品安装在 AFM 阶段，小心不要接触样品表面。将激光定位在悬臂上，直到其总和达到最大值，并调整垂直和横向偏转值以接近零。

然后，调整 AFM 探头以查找其谐振频率，调整驱动器振幅，将图像大小设置为 100 x 100 纳米。设置后，单击接合按钮开始使用方法。方法完成后，逐渐优化振幅设定点，直到样品表面清晰可见。

然后，将扫描大小增加 1 微米 1 微米，将分辨率提高至 512 微米（512 像素）。最后，单击捕获按钮开始图像采集。使用玻璃棒扫描仪胶水将玻璃棒连接到 AFM 扫描仪阶段。

让其干燥至少 10 分钟。同时，通过从较大的云母片中冲压0.1毫米厚、直径为1.5毫米的圆形云母片。使用高速 AFM 云母玻璃棒胶将这种云母片连接到高速 AFM 上的玻璃棒上，并允许它在干燥时至少保持 10 分钟不变。

然后，使用压力敏感胶带从云母上切割层，直到在胶带上看到良好的切割层。接下来，在99微升蒸馏脱水中稀释一个微升50毫摩尔的 APS 库存，以制造 500 微摩尔 APS 溶液。将溶液的2.5微升沉积在刚切割的云母表面，使表面功能化30分钟。

孵育后，使用蒸馏的去维水冲洗云母几次，使用三微升冲洗。将无纺布抹布放在云母边缘，在每次冲洗后完全清除水。最后冲洗后，将三升微升蒸馏除臭水放在表面上，让它至少坐五分钟，以去除任何非具体装订的 APS。

接下来，将探头放在高速 AFM 支架中，将支架定位在 AFM 舞台上，尖端朝上。使用 100 微升蒸馏脱压水冲洗支架，然后冲洗两个 100 微升的 0.22 微米过滤核体成像缓冲液。冲洗完成后，在腔室中填充 100 微升的核体成像缓冲液，将尖端淹没。

调整悬臂位置，直到被激光击中。然后，使用过滤的核体成像缓冲液冲洗 APS 云母五次，每次冲洗使用四微升。将核糖体组装存量的一微升稀释成250微升的过滤核体成像缓冲液，最终核糖体浓度为一纳米摩尔。

将这种稀释剂的2.5微升沉积在表面上，让它坐两分钟。用四微升核体成像缓冲液冲洗表面两次，以避免过度拥挤。最后冲洗后，将表面覆盖在成像缓冲液中。

将扫描仪和样品放在尖端支架的顶部，使样品朝下。要开始该方法，请使用自动接近函数，其设定点振幅接近自由振荡振幅。调整设定点，直到表面被很好地跟踪。

然后，将图像区域设置为 150 到 150 纳米到 200 微克 200 纳米，每个成像帧的数据采集速率约为 300 毫秒。作为装配和沉积的控制，使用静态AFM准备和成像H3单核体。此图像提供了核糖体群的快照，因为它在沉积前的片刻存在，证实核糖体已成功组装。

随着H3控制组装的成功，提出了方法，其次应用于CENP-A核糖体的研究。该样品的静态 AFM 成像显示其组装是成功的。从静态AFM图像中可以描述单核体的高度和转弯数。

自由DNA臂和自由DNA臂的长度之间的角度都用于确定单个核糖体中DNA转数。相比之下，核子体的时间推移AFM成像可用于可视化核子体的整体自发解包行为。随着核体转数的减少，也观察到核体核心体积的相应减少。

除了常规时间推移成像外，高速时差 AFM 还可用于探测使用标准时差成像错过的更复杂的核体动力学。这种技术能够长期捕获动力学，对于在1200帧中捕获的CENP-A核体核心的远距离迁移的可视化至关重要。这项技术对于捕获CENP-A核细胞核从一个DNA基质到另一个基质的罕见转移也至关重要。

快速的图像捕获速率使此动态事件的可视化成为可能，因为它只需要几个帧完成。在广泛的染色质领域有一组重要问题，涉及胶质组蛋白的作用和色谱动力学的组蛋白放大。所有这些问题都可以使用我们的技术来回答。