Name: 重组融合蛋白在荧光蛋白酶检测平台中的应用及其凝胶内再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 23 s
Description: 学习使用荧光蛋白融合重组底物和磁性琼脂糖珠的高通量蛋白酶检测平台。该方法以HIV-1病毒蛋白酶为例，支持实时监测蛋白酶活性并促进药物研发。

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本工作部分得到了 GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT teaming” 项目以及匈牙利人力资源部高等教育机构卓越计划（在德布勒森大学生物技术主题项目框架内）的资助。作者感谢德布勒森大学逆转录病毒生物化学实验室成员在本检测方法开发过程中提供的科学帮助，以及在拍摄检测过程视频时的耐心配合（特别是出现在视频背景中的 Norbert Kassay、Krisztina Joóné Matúz 和 Vanda Toldi）。作者还特别感谢 Gedeon Richter 公司，尤其是 Zoltán Urbányi 博士，允许 Beáta Bozóki 在生物化学与分子生物学系作为客座研究人员开展工作。作者还向德布勒森大学多媒体与电子学习技术中心的 György Zsadányi、Balázs Tőgyi、Balázs Pöstényi 和 Zoltán Király 表示衷心感谢，感谢他们在音视频制作方面提供的专业协助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于对蛋白水解酶的工业和学术研究日益深入，以及对快速、经济且适用于高通量筛选（HTS）的蛋白酶检测平台的持续需求，我们开发了一种基于磁珠的荧光蛋白酶检测方法。该检测方法利用重组融合蛋白作为底物，可作为广泛使用的合成肽底物的新型替代方案。
在所开发的检测体系中，融合蛋白底物被固定在镍-螯合磁性琼脂糖珠的表面。底物的结合由融合蛋白N端的六聚组氨酸（His6）亲和标签介导，该标签与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签直接融合，以促进底物的正确折叠并增强其水溶性13。MBP之后依次为烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV PR）和目标蛋白酶的切割位点。前者可在检测中作为对照切割位点，后者则可被待研究的蛋白酶所切割。切割位点具有可替换性；通过连接方法，可将编码目标切割位点的短双链DNA序列插入表达质粒的灵活“克隆盒”中。重组融合蛋白在C端携带一个高度稳定且为单体形式的荧光蛋白标签，使得在蛋白酶解切割后释放出的荧光C端切割产物可通过终点法进行检测（图1A）。将不同缓冲液中纯化的完整荧光底物用于校准，以测定底物及切割产物的摩尔浓度。此外，在荧光测定之后，也可通过SDS-PAGE对检测组分进行分析。凝胶中可分别在电泳后直接或经凝胶内复性后，对天然（非变性）和变性的荧光蛋白进行可视化检测。该附加步骤结合传统的考马斯亮蓝染色，可有效用于验证检测结果（图1B）。
该检测流程由简单且易于操作的步骤组成，采用低体积格式，可完全适配高通量自动化环境。然而，无论手动操作还是使用自动化系统，以下检测环节均被视为关键步骤，在操作过程中需特别注意。i) 磁珠溶液的均一性。在整个检测过程中，包括纯化和洗涤步骤，均必须使用均一的磁珠溶液。特别是，蛋白酶检测的可靠性高度依赖于对磁珠固定底物（SAMB）储备液的准确分装。为提高悬浮和分散效果，建议将磁珠浓度控制在2%至10%（v/v）之间。在样品制备过程中，使用添加非离子型去污剂（如Triton X-100或Tween 20）至多2%的缓冲液，也可减少磁珠在塑料表面的黏附。若将磁珠悬液小心地加至样品管底部而非管壁，可避免磁珠在样品管壁上的黏附。在酶促反应过程中，磁珠的均一性同样至关重要，可通过孵育期间以600 rpm持续振荡样品来确保。磁珠在圆底或平底塑料器皿中可良好分散，不建议使用V型底管。因磁珠均一性不佳导致的次优结果见于图4B。ii) 反应样品的终止&#160;。该方法的另一优势在于，无需使用热变性处理或任何可能产生干扰的化学试剂即可终止酶促反应15。终止操作仅需使用常规磁性颗粒浓缩器将磁珠从反应混合物中分离即可实现。移除的反应缓冲液中含有活性酶及生成的C端荧光切割产物，而未切割的底物仍固定在磁珠上。由于反应缓冲液中存在活性酶，为确保终点检测的可靠性，分离操作需谨慎进行。在将样品管放入浓缩器前，建议先进行短暂离心。将管子放入浓缩器后，应至少等待15秒，使磁珠充分聚集。轻微来回移动分离器可能有助于磁珠的收集。请注意，在手动分离过程中，终止操作通常比反应启动耗时更长。因此，若所有样品需应用相同的孵育时间，建议在各反应启动之间设置约2分钟的记录延迟。
所述蛋白酶解检测方法的原理相对简单；然而，该系统的多功能性由其灵活且稳定的底物结构所保证。该检测方法的个别优化可能仅受限于亲和磁珠与所用条件、试剂和添加剂之间的相容性。根据制造商的方案，我们还发现底物与 Ni-NTA 磁珠表面的亲和结合在 pH ≤ 6.5 时显著减弱15。因此，建议在反应样品的同时平行设置底物空白样品，并在结果评估时考虑底物自发解离的速率。
在由于使用了与磁珠不兼容的组分或低pH条件而无法进行磁珠法检测的情况下，也可采用在溶液中对纯化的重组底物进行消化的方法。在这些情况下，可通过电泳分析反应混合物，并根据所述方案在凝胶中对蛋白质进行可视化检测。为了研究蛋白酶活性，在溶液中消化并结合凝胶内检测蛋白质的方法也可作为荧光测定法的替代工具。该设计底物系统的一个创新之处在于，在变性SDS-PAGE之后引入了凝胶内复性步骤。天然（未变性）的荧光蛋白在电泳过程中可保持其荧光性质，而变性处理会使其荧光丧失（图7B）。然而，通过从凝胶中去除SDS，可部分恢复变性蛋白的荧光。因此，使用变性条件分离反应组分不仅能够基于荧光进行鉴定，还能基于分子量进行鉴定。相较于考马斯亮蓝染色凝胶的分析，荧光凝胶检测的另一优势在于，可在凝胶中直接根据荧光轻松识别（天然或复性后的）荧光蛋白（见图7）。当在含有非荧光杂质或分子量相近的蛋白质样品中进行切割反应时，这一特性尤为重要。
使用类似设计底物的蛋白酶检测方法此前已有发表8,9,10，尽管这些方法中的目标切割位点同样位于亲和标签与荧光蛋白之间，但本文所介绍的检测系统不仅重现了已报道的设计理念，还整合了先前平台的各项优势，并进一步进行了改进：i) 利用麦芽糖结合蛋白（MBP）作为融合伴侣；ii) 引入烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶对照切割位点；iii) 使用新近设计的单体荧光蛋白（FPs）；以及 iv) 采用独特的底物校准程序。该检测方法本身被特别设计为一种安全、省时且经济高效的方式，适用于酶特异性与动力学研究，且无需昂贵的仪器设备。本方法旨在成为工业与学术研究中一种适用且经济的工具。由于表达质粒中“克隆盒”的灵活性，该系统可能适用于快速且低成本地构建重组底物文库。本文所述的检测方法可有效用于底物特异性、酶突变及抑制研究，同时也为酶动力学分析提供了一种替代方案。该检测平台（从细菌细胞裂解到动力学参数测定）可适配于高通量筛选（HTS）与自动化环境，未来有望应用于工业级蛋白酶抑制剂筛选和/或抗病毒药物开发。此外，本实验室还计划将该检测方法拓展至竞争性蛋白水解分析。在此类竞争性检测中，将同时使用两种不同的底物——每种底物均包含不同的切割位点，并融合不同的C端荧光标签——在同一酶切反应中共同孵育，以研究目标酶对特定靶序列的偏好性。此外，针对半胱氨酸蛋白酶，我们正在优化适用于96孔板的检测形式（图8），通过一系列切割位点序列经修饰的底物进行突变筛选。

由于蛋白水解酶在代谢通路及工业应用中具有重要意义，它们成为被广泛研究的酶类之一。蛋白酶在病毒感染、血液凝固调控、癌症以及心血管和神经退行性疾病中发挥关键作用，使其成为药物研发领域的重要靶点。因此，对目标蛋白酶（PR）的底物特异性和抑制剂谱进行详细表征至关重要，通常需通过快速、经济且可靠的生化检测方法来完成1,2,3。
目前，药物发现领域中用于化合物谱型分析的体外蛋白酶检测方法绝大多数为均相、基于荧光标记肽段且兼容高通量筛选（HTS）的平台4。此外，标记肽段不仅适用于文库筛选，还可作为有力工具用于测定所选底物上的酶动力学参数。在其他无法对底物进行标记的情况下，基于分离的检测方法可能为评估蛋白水解反应的动力学特性提供可行方案3。
通常，体外蛋白酶检测基于两类底物：短肽或完整蛋白质。在短肽序列的切割能够充分反映切割特性的条件下，可采用以下标准方法：(i) 检测标准蛋白底物，如氧化胰岛素B链；(ii) 测试其他蛋白酶的商业化底物；(iii) 筛选通过组合化学合成的、带荧光标记的肽库；或 (iv) 使用基因方法，例如生物展示技术5,6。除传统分类外，目前还存在其他新型底物生成平台（例如，由蛋白质组衍生的肽库构建7，或基于重组融合蛋白底物等特殊类型的基因方法8,9,10,11,12）。
上述所有底物类型和检测方法均有各自的优点和局限性，因此仍需开发能够结合和/或改进现有平台优势的检测方法。本文介绍了一种基于分离的荧光蛋白酶检测方案，该方法利用重组底物。这些融合蛋白由 His6 标签和 MBP 标签组成，二者与烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV PR）的对照切割位点融合，其后为感兴趣的底物序列，该序列直接连接至C端的荧光蛋白（FP）（图1A）。将编码感兴趣切割位点的DNA序列克隆到“克隆盒”中时，可通过单次连接反应完成，即将其插入先前由限制性内切酶线性化的表达质粒中。
<img alt="蛋白酶切割实验示意图；过程包括底物表达、切割及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图1"> 
图1：荧光蛋白酶检测法的原理。（A）图示为荧光底物及其被人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白酶切割的示意图。箭头指示HIV-1蛋白酶在基质/衣壳切割位点序列（VSQNY*PIVQ）内的切割位置。（B）荧光底物可用于通过基于镍-NTA磁珠的检测法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析酶促反应，工作流程图中展示了该过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
尽管已有文献报道过使用类似重组蛋白底物的蛋白水解检测方法——该底物包含亲和标签、蛋白酶切位点和荧光蛋白8,9,10，但本文所介绍的系统旨在整合并改进这些方法的优势。一个重要区别在于，本检测平台中的融合蛋白底物配备了麦芽糖结合蛋白（MBP），以增强蛋白可溶性13，并包含烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶的对照酶切位点。此外，这些底物采用了新一代荧光蛋白，具有高度稳定性且为单体形式，可防止底物发生聚集。除此前已发表的mTurquoise2和mApple融合形式的应用外14，本文还展示了使用含单体增强型黄色荧光蛋白（mEYFP）荧光标签的重组底物所获得的结果。由此，我们证实了该系统与其他荧光蛋白的兼容性，并展示了通过该蛋白酶检测所能获得的一些典型结果类型。
重组融合蛋白在 E. coli BL21(DE3) 细胞中表达，并作为底物用于镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）包被的磁性琼脂糖珠固定形式的检测。当目标蛋白酶切割后，C端切割产物从磁珠表面释放至上清液中。在将上清液（含有酶和切割产物）与磁珠分离后，可通过测定荧光来确定酶的切割特性。与先前描述的方法不同，本系统中底物及C端切割产物的量是基于详细的底物校准程序进行准确定量的。该检测系统可辅以对检测样品进行SDS-PAGE分析；电泳后可立即对凝胶中的荧光成分进行原位可视化检测，或分别对未变性和已变性的荧光组分进行凝胶内复性后再进行荧光成像14。
“克隆盒”的灵活性和结构设计使得多种序列能够以省时、经济的方式插入到载体中，从而促进底物文库的构建。由于所有检测步骤均可实现自动化并兼容高通量筛选（HTS），该系统尤其适用于蛋白酶特异性分析和突变研究，也可有效用于工业级蛋白酶抑制剂筛选和/或抗病毒药物开发。
可通过所开发的基于分离的检测方法测定酶动力学参数（kcat、Km）；因此，该方法适用于开展各项酶动力学测量，如时间进程、底物依赖性及抑制研究。这证明，重组融合蛋白底物可作为常用合成寡肽底物的良好替代方案，且由于其与多聚蛋白底物高度相似，能更准确地反映天然存在的酶-底物相互作用。

<table><tbody><tr><td>10K Amicon 管</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（&amp;beta;-ME）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>乙酸&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>SERVA</td><td>11404.04</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Imager HP 凝胶成像系统</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-22 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>392185</td><td></td></tr><tr><td>黑色半面积板</td><td>Greiner bio-One</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart 缓冲液（10x）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>用于质粒线性化（步骤 1.1.1）</td></tr><tr><td>Dark Reader 透射仪</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-45M</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2&amp;nbsp;磁性颗粒&amp;nbsp;浓缩器</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck-Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>上样染料，紫色（6X）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck</td><td>356350</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>高速质粒小提试剂盒</td><td>GeneAid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Jouan CR 412 离心机</td><td>Jouan</td><td>CR412</td><td></td></tr><tr><td>Labinco LD-76 旋转混合器&amp;nbsp;</td><td>Labinco</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria-Bertani 肉汤）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>MERCK eurolab 超声波清洗器</td><td>MERCK</td><td>USR54H</td><td></td></tr><tr><td>Millifuge Eppendorf 离心机</td><td>Millipore</td><td>CT10</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131L</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镍（NiSO4）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 磁性琼脂糖微珠&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>36113</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Biosan</td><td>OS-20</td><td></td></tr><tr><td>PacI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>PageBlue 蛋白染色液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>24620</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lobind 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Snijders Press-to-Mix 混合器&amp;nbsp;</td><td>Gemini</td><td>34524</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I 核酸凝胶染色剂</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Promega</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>恒温摇床</td><td>Biosan</td><td>TS-100</td><td>配备 SC-24 附件模块</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&amp;nbsp;</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>WALLAC VICTOR2 1420 多标记计数仪</td><td>Wallac Oy, Turku, Finland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用重组融合蛋白进行荧光蛋白酶检测平台及其凝胶内复性

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

由于蛋白酶在生物体的多种生物途径及致病过程中具有关键作用，因此被广泛研究；也正因如此，它们成为重要的药物靶点。我们开发了一种基于磁性琼脂糖珠的检测平台，用于研究蛋白水解活性，该平台利用重组融合蛋白作为底物。为展示该检测系统的应用，本文以人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白酶为例提供了一个实验方案。该检测平台可高效用于蛋白酶的生化表征，包括在突变、动力学、抑制或特异性研究中进行酶活性测定，也可适用于高通量底物筛选，或可适配于其他蛋白水解酶。
在此检测系统中，所使用的底物包含N端六组氨酸（His6）和麦芽糖结合蛋白（MBP）标签、烟草蚀刻病毒（TEV）和HIV-1蛋白酶的切割位点，以及C端荧光蛋白。这些底物可在大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中高效表达，并利用镍（Ni）螯合包被的磁珠轻松纯化。在检测过程中，磁珠结合底物的蛋白水解切割会释放出荧光切割片段，可通过荧光测定法进行定量检测。此外，切割反应还可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。本文还描述了一种凝胶内复性实验组分的方案，因为荧光蛋白的部分复性可使其基于分子量和荧光实现检测。

图1A展示了可被人免疫缺陷病毒1型蛋白酶（HIV-1 PR）在其特异性切割位点序列处加工的一种代表性荧光重组蛋白底物的示意图结构。图1B展示了底物的制备流程及其在蛋白酶检测中的可能应用，包括基于镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）磁珠的检测和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
为通过荧光测定法获得可靠数据，需进行校准，以确定荧光底物及切割产物的量。为此，需测量不同缓冲条件下各底物的荧光强度值，并将其与所测定浓度范围内的浓度相关联（图3）。校准曲线的斜率可用于测定实验样品中底物和切割产物的含量。校准曲线的斜率与插入底物中的切割位点序列无关（表11），因此可能适用于与同一种荧光蛋白融合的一系列底物。所有线性回归均提供放大图，以便同时扩大显示较低浓度范围（图3）。需要注意的是，校准过程必须谨慎进行，因为可靠的校准需要数据点分布合理。为此，采用两倍系列稀释法来制备校准样品，因为只有在使用足够数量的数据点覆盖整个浓度范围时，R2 值才能准确反映荧光蛋白浓度与荧光信号之间的相关性。此外，实验误差可能显著影响校准的准确性，因此可能还需对回归线进行图形化评估。
该蛋白酶检测法可进行多种酶学测定，包括考察底物浓度对反应速度的影响（图4A）。通过非线性回归分析，可利用这些数据测定酶动力学参数（例如 vmax 和 Km）。若磁珠悬浮液混合不充分或反应终止操作不当，可能导致结果不理想（图4B），从而无法用于计算可靠的酶动力学数值。
可通过该检测方法确定产物生成随时间的变化关系（图5A）（例如，在优化切割反应参数期间）。也可在抑制剂存在下检测酶活性（图5B），以确定活性酶浓度及抑制常数。采用相同方法，该检测还可用于筛选其他抑制剂的作用效果。
在研究 pH 对酶活性的影响时，该蛋白酶检测方法同样具有实用价值。图6A 以烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEV PR）为例，展示了酶活性对 pH 的依赖性，该酶具有较宽的最适 pH 范围（pH 6–9）。若研究酶活性的 pH 依赖性（或需测定具有酸性最适 pH 的酶），需注意重组底物与磁珠之间的亲和结合在弱酸性 pH 条件下可能受到限制。图6B 显示底物从磁珠上发生非特异性解离增加，可能导致检测结果出现偏差。为校正底物从磁珠上的自发解离，反应样品的测定值需用 B 样品的数值进行校正。
图7 显示，在凝胶中可通过蓝光透射照射根据荧光蛋白的颜色将其区分开来（图7A）。若需确定底物/切割片段的分子量，也可在样品制备中采用变性条件，因为荧光蛋白可在凝胶中部分复性，并通过紫外光照射（图7B）或考马斯亮蓝染色（图7C）进行检测。若分析 R 样品，则仅可观察到C端切割产物（图7C），而N端切割片段及未切割的底物仍结合于磁珠上。尽管使用了非变性条件，有时蛋白质仍可能出现部分变性（图7C），此时非变性蛋白占主导，但变性形式在样品中亦可被检测到。该现象不影响蛋白水解切割的检测，但在对非变性样品进行定量密度分析时需予以考虑。
尽管详细描述仅针对基于2 mL离心管的检测方法，但该检测方法也可适配于96孔板系统（图8），此系统已在我们的实验室成功测试（未展示）。适配于96孔板的格式同样完全兼容荧光检测和电泳分析，所获得的数据亦可依据本文所述方法进行评估。
<img alt="蛋白切割与洗脱的线性回归分析；RFU 与底物浓度关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Figure 3"> 
图 3： 标准曲线。 以两种带有不同C端荧光标签的重组底物为例，展示典型底物的标准曲线：（A 和 B）His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2，以及（C 和 D）His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP。插图展示了0–0.005 mM底物浓度范围内数据点的线性回归情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="米氏曲线；酶动力学分析，His标签蛋白，反应速率与底物浓度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图 4"> 
图 4：酶动力学参数的测定。 使用终活性浓度为 41.2 nM 的 HIV-1 PR 进行底物依赖性动力学测定。将初始反应速率对底物浓度作图，并进行米氏-门廷非线性回归分析。误差棒表示标准偏差（n = 2）。（A）以 His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mApple 融合蛋白底物为例，展示一个典型的最优结果。（B）同时展示一个典型的次优结果，即 His6-MBP-KARVL*AEAM-mTurquoise2 底物，该结果中由于 SAMB 储存液均质化不充分，导致无法准确设定底物浓度，同时因反应终止不当而产生相对较大的误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="His标签融合蛋白动力学图：浓度随时间变化曲线及对数浓度与反应速率关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图5"> 
图5时间进程与抑制研究。 (A)His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP 重组融合蛋白底物（终浓度为 0.00326 mM）由 HIV-1 PR（终活性浓度为 41.2 nM）进行切割，通过检测荧光性 PIVQ-mEYFP 蛋白水解片段的释放完成时间进程分析。实验在五个不同的时间点进行测定。误差线表示标准差（SD）n = 2). (BHis6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP 用作底物（浓度为 0.0015 mM），以测定安普那韦对 HIV-1 PR 活性的抑制作用（HIV-1 PR 总浓度为 163.8 nM）。通过绘制数据可评估半数最大抑制浓度（IC50），并基于抑制曲线计算所用 HIV-1 PR 的活性酶浓度（最终活性浓度为 41.2 nM）。误差棒表示标准差（SD）n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="酶活性与pH关系图；底物解离百分比；科学数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图6"> 
图6：研究酶活性和底物自发解离对pH的依赖性。（A）使用His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2底物（0.033 mM）测定TEV PR（终总浓度为91.42 nM）在不同pH（6.5–8.5范围）裂解缓冲液中的酶活性。误差线表示标准偏差（n = 2）。所绘制的数据此前已发表14。（B）基于底物空白样品的相对荧光强度值，利用pH在6.0–8.5范围的裂解缓冲液，研究了His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2底物（0.033 mM）从磁珠上的自发解离情况。所绘制的数据此前已发表14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HIV-1 PR 分析：荧光成像、紫外光、考马斯亮蓝染色；蛋白切割检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Figure 7"> 
图 7： 通过不同方法在凝胶中检测蛋白质。（A）经非变性样品制备后的未切割及 HIV-1 PR 消化融合蛋白底物，通过 SDS-PAGE 后蓝光透射成像可视化。切割反应采用溶液中消化方式进行。（B）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结束后立即通过紫外光照射仅能检测凝胶中的非变性蛋白；而在去除 SDS 后，先前变性的荧光蛋白部分复性并可被检测。样品来源于 Ni-NTA 磁性微珠检测系统的上清液。（C）在凝胶内复性后，也可使用考马斯亮蓝染色进行蛋白质检测。凝胶中存在的 SDS 可能导致天然蛋白的部分变性，但在天然样品中，非变性形式更为丰富。样品来源于 Ni-NTA 磁性微珠检测系统的上清液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="磁珠检测示意图；样品制备、洗涤、反应、检测；电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图8"> 
图8： 基于96孔板的检测平台适配方法。 （A） 该检测不仅可在2 mL离心管中进行，也可在96孔板的孔中进行。此处展示了利用一系列荧光底物研究一种假想蛋白酶特异性的检测应用示意图，这些底物可能包含野生型（wt）或突变型（mut-1至mut-4）的切割位点序列。实验中使用与96孔板兼容的磁性粒子浓缩器（MPC）来处理磁珠。所有标注体积均对应单个孔。为比较不同底物的切割效率，可依据反应样品经底物空白校正后的相对荧光单位（RFU）值占相应底物对照样品经底物空白校正后RFU值的百分比来评估底物转化率。 （B） 荧光测定后，检测样品的上清液也可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析；对于非变性或变性样品制备，荧光蛋白组分可分别直接分析或经凝胶内复性后再分析。每幅图中还展示了三种不同的检测样品类型：C = 底物对照，B = 底物空白，R = 反应样品。底物对照样品位于洗脱缓冲液中，而底物空白和反应样品则位于切割缓冲液中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液</td>
			<td>荧光蛋白</td>
			<td>斜率的变异系数 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切割</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切割</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表11：底物校准曲线斜率的变异系数（CV%）值。 为了检测重组蛋白底物的荧光是否依赖于插入的切割位点，分别使用一系列与mApple和mTurquoise2融合的底物（每种包含六种不同的HIV-1蛋白酶切割位点序列）在洗脱缓冲液和切割缓冲液中进行了校准实验。结果发现，所有情况下的斜率CV%值均低于15%，表明对于含有相同荧光标签的不同底物变体，可使用单一底物校准曲线来评估其测量结果。

本文介绍了近期开发的一种蛋白酶检测平台的详细操作流程，该平台利用固定在镍-氮川三乙酸磁性琼脂糖珠表面的N端六组氨酸/麦芽糖结合蛋白与荧光蛋白融合的重组底物进行检测。同时，还介绍了对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的检测样品进行凝胶内分析的方法。

蛋白酶因其在生物体多种生物途径及致病过程中的关键作用而被广泛研究，因此是重要的药物靶点。我们开发了一种基于磁性琼脂糖微珠的检测平台，用于研究蛋白水解活性，该平台采用重组融合蛋白作为底物。为展示该检测系统的应用，本文以人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白酶为例提供了一套实验方案。该检测平台可高效用于蛋白酶的生化表征，包括在突变、动力学、抑制或特异性研究中进行酶活性测定，也可适用于高通量底物筛选，或可适配于其他蛋白水解酶。在此检测系统中，所用底物包含N端六组氨酸（His6）标签和麦芽糖结合蛋白（MBP）标签、烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶和HIV-1蛋白酶的切割位点，以及C端荧光蛋白。这些底物可在大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中高效表达，并利用镍（Ni）螯合包被微珠轻松纯化。在检测过程中，固定于微珠上的底物发生蛋白水解切割，释放出荧光切割片段，可通过荧光测定法进行检测。此外，切割反应也可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。本文还描述了一种检测组分的凝胶内复性方案，因荧光蛋白的部分复性可使其基于分子量和荧光实现检测。

蛋白酶是学术界和工业界研究中最受关注的生物分子靶点之一。由于其在多种生理和病理过程中发挥重要作用，蛋白酶也成为药物发现领域的重要靶标。鉴于对蛋白酶的深入研究，开发高效、节省时间和成本且适用于高通量筛选的荧光蛋白酶检测平台的需求持续增长。本文旨在介绍一种基于分离技术、适用于高通量筛选的荧光检测平台的操作方案，该平台使用了分别融合mTurquoise2和mApple的重组融合蛋白酶底物。此外，还将展示一种对变性SDS-PAGE后的检测样品（包括底物及其酶切片段）进行凝胶内复性的方法。所有实验均以HIV-1病毒蛋白酶为例进行。表达质粒携带编码六聚组氨酸亲和标签和麦芽糖结合融合蛋白的序列，其后接烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶的对照切割位点、一个克隆盒以及C端荧光蛋白。使用PacI和NheI限制性内切酶对表达质粒进行线性化。将编码目标底物序列且经大肠杆菌密码子优化的正向与反向寡核苷酸引物进行退火处理，引物两端分别带有PacI和NheI的黏性末端。通过连接反应将退火后的引物插入线性化表达质粒中。为进行蛋白表达，将连接混合物转化至BL21(DE3)感受态细胞中。只有连接成功后，荧光蛋白才会与N端融合标签处于同一开放阅读框中。转化后数天，含有编码目标切割位点表达质粒的菌落将显示出可见荧光，无论是否使用 Dark Reader 蓝光透射仪均可观察。取 10 微升含有编码目标切割位点序列表达质粒的 BL21(DE3) 细胞甘油菌液，加入含 100 微克/毫升氨苄青霉素的 5 毫升 LB 培养基中，置于 50 毫升离心管内。将菌液于 37 摄氏度恒温振荡培养 15 小时。将5毫升细菌培养物转移至含有100微克/毫升氨苄青霉素的50毫升新鲜LB培养基中。在37摄氏度下培养细胞，使其在600纳米波长处的吸光度达到0.6至0.8。此时，通过加入IPTG诱导蛋白表达。此后，将培养物在37摄氏度下持续振荡培养三小时。培养结束后，将25毫升培养液转移至洁净的50毫升离心管中，通过离心收集细胞。弃去上清液，并将细菌细胞沉淀在-70摄氏度下保存至少一小时。含有成功表达的荧光蛋白的细胞沉淀在使用或不使用Dark Reader蓝色透射仪的情况下均表现出明显的荧光。将冷冻的细胞沉淀置于冰上，使其解冻15分钟。向沉淀中加入2 mL裂解缓冲液，并重悬细胞。随后，加入蛋白酶抑制剂，用溶菌酶和DNase处理悬浮液以解聚细胞，重悬细胞，并将悬浮液置于冰上孵育15分钟。取两份1毫升的悬浮液转移至1.5毫升微量离心管中，进行超声处理，总时长为3分钟，每次超声10秒，间歇5秒。在室温下以10,000 g离心20分钟。含有目标荧光底物的澄清细菌细胞裂解液在使用或不使用 Dark Reader 蓝光透射仪的情况下均表现出可见的荧光。所开发的蛋白酶检测流程从检测样品的制备开始。首先，将重组底物与亲和磁珠孵育，形成底物结合的磁珠（简称 SAMBs）。SAMB 经过多次洗涤后，最终通过分装制备 SAMB 储存液，由此储存液创建测定样品。通过加入蛋白酶溶液启动反应。蛋白酶切割后，蛋白水解片段被释放到上清液中。通过将磁珠与含有荧光切割产物和酶的反应缓冲液分离，终止反应。将上清液加入微孔板的孔中，通过荧光测定法测定荧光强度。使用溶于每种测定缓冲液中的纯化荧光底物生成标准曲线。测定样品中C端荧光切割产物以及所用底物的浓度时，需依据标准曲线的斜率进行。将含有新制或回收的镍-NPA磁性琼脂糖珠的离心管置于磁性粒子浓缩器中。珠子可能会黏附在微量离心管的管壁和/或管盖内。因此，将浓缩器在各个方向倒置，确保所有磁珠均被收集。移除上清液并弃去。向磁珠中加入1.8毫升裂解缓冲液，并将封闭的离心管从浓缩器中取出。通过振荡和/或倒置试管使管中的珠子悬浮，直至珠子完全均匀。将试管重新放入浓缩装置中，并在各个方向上倒置，以确保收集到所有珠子。打开试管，弃去上清液。加入含有目标底物的澄清无菌细菌裂解液，并将封闭的离心管从浓缩器中取出。将离心管倒置，直至磁珠完全均匀分散，然后在室温下缓慢旋转混匀30分钟。SAMBs无论是否使用Dark Reader蓝色透射仪，均可见明显荧光。用1.8毫升含1% Tween 20的洗涤缓冲液和裂解缓冲液将SAMBs洗涤三次。向洗涤后的SAMBs中加入裂解缓冲液，制备SAMB储存液。若使用2毫升低蛋白吸附微离心管，所加裂解缓冲液的体积最多为1.9毫升。加入缓冲液后，不要振荡或倒置离心管。盖上管盖，将离心管从浓缩器中取出。为测定样品准备2 mL的低蛋白吸附微离心管。将SAMB储存液充分混匀至完全均一，并立即取适量SAMB储存液转移至样品管中，以测定反应中待分析的底物量。建议转移的SAMB储存液体积为25至300微升，具体体积应根据各自的实验设计设定。将含有分装SAMB悬液的样品管放入浓缩仪中。小心移除 SAMB 上清液并弃去。将离心管从浓缩器中取出，小心向 SAMB 中加入反应缓冲液。所加入的反应缓冲液体积应根据具体的实验设计进行计算，但若使用 2 毫升离心管，建议将反应体系的终体积设定在 50 至 150 微升之间。盖上管盖。现在样品已准备好进行初始化。向反应样品中加入酶溶液。轻轻移动试管，小心混匀磁珠，立即将试管放入已开启振荡的恒温振荡器中。对于底物空白样品和底物对照样品，分别加入裂解缓冲液和洗脱缓冲液。在孵育结束前30秒，将样品从恒温振荡器中取出，并立即进行短暂离心。将离心管置于浓缩器上，静置15秒。可轻轻前后移动浓缩器，以促进磁性琼脂糖微球（SAMBs）的收集。打开管盖，小心将上清液转移至板或新离心管中。移液时切勿用枪头触碰浓缩的磁珠。底物对照样品以及切割程度较高的反应样品的上清液可能会显现可见荧光，无论是否使用Dark Reader蓝色透射仪均可观察到。将分离后的样品上清液各取30微升，重复转移两次至黑色半区微孔板中。使用荧光仪，并根据所用荧光蛋白选择适当的滤光片测量荧光。为纯化荧光底物，配制与前述相同溶液，弃去上清液。向 SAMBs 中加入 400 至 600 微升洗脱缓冲液，在室温下缓慢旋转试管 5 分钟。将洗脱液转移至新的低蛋白结合微离心管中。无论是否使用Dark Reader蓝色透射仪，均可观察到明显可见的荧光。纯化后，进行缓冲液置换并测定蛋白含量，随后分别使用洗脱缓冲液或切割缓冲液，对洗脱液和切割缓冲液中溶解的底物溶液进行至少八步的两倍连续稀释。将每个稀释点的30微升转移至黑色半面积微孔板中。使用与测定实验样品上清液时相同的参数，通过荧光计测量荧光。作为数据处理的示例，对编码天然Gag多蛋白前体中基质蛋白与衣壳蛋白之间切割位点的重组底物（与mTurquoise2融合的形式）进行了HIV-1蛋白酶的底物依赖性动力学测定。将校正后的相对荧光强度值对纯化底物的摩尔浓度作图，分别以裂解缓冲液或洗脱缓冲液为溶剂，进行线性回归。利用基于裂解缓冲液的标准曲线斜率，计算反应样品中C端裂解产物的摩尔浓度。同时，根据底物对照样品中洗脱底物的摩尔浓度，利用基于洗脱缓冲液的标准曲线斜率，计算反应样品中所用底物的摩尔浓度。根据C端切割片段的量计算初始反应速度，然后将其对底物浓度作图。同时通过米氏-门顿非线性回归分析确定动力学参数。在完成镍-NTA磁珠法检测后，也可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测上清液。然而，除了分析检测样品外，还可以对纯化的荧光底物和/或溶液中消化后的切割片段进行分析。对于溶液中消化，将溶解于切割缓冲液中的纯化荧光底物分装至1.5毫升微量离心管中，并向样品中加入酶溶液。根据实验设计孵育样品，并通过PAGE样品制备的步骤终止反应。进行非变性样品制备时，将待分析样品与不含还原剂的非变性上样缓冲液混合。进行变性样品制备时，将待分析样品与变性上样缓冲液混合，并在95°C下加热处理10分钟。将非变性和变性样品分别加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，进行电泳。 从电泳装置中取出凝胶盒。即使肉眼或使用 Dark Reader 蓝光透射仪观察，非变性样品在凝胶中已可见。为在透射仪上检测变性样品的荧光组分，需通过洗涤去除凝胶中的 SDS，以实现凝胶内重折叠（原位复性）。向凝胶中加入 100 毫升蒸馏水，并至少冲洗 30 分钟。将未染色的凝胶置于 Dark Reader 蓝色透射仪上，以观察荧光蛋白。这些重组荧光融合蛋白经过设计，可作为蛋白酶解测定中的底物使用。当蛋白酶在特异性切割位点进行切割后，C端荧光切割片段被释放，其荧光信号可被检测。该体系在镍-NTA磁珠检测法中的应用以及通过PAGE分析进行荧光检测的条件已利用HIV-1蛋白酶进行了优化。然而，所开发的检测平台也可适用于其他蛋白酶。在裂解缓冲液或洗脱缓冲液中溶解的纯化底物的标准曲线，以编码天然HIV无回声蛋白中基质蛋白与衣壳蛋白之间切割位点的重组底物的mTurquoise2融合形式和mEYFP融合形式为例进行展示。基于镍-NTA磁珠的检测方法是一种用于研究底物浓度对反应速率影响的有效工具，从而也可实现酶动力学参数（如Vmax和Km）的测定。图A展示了在mApple融合底物上成功进行底物依赖性活性分析后获得的理想结果。相比之下，图B展示了一个次优结果，其中SAMB储备溶液的混合不充分导致无法准确设置底物浓度，而反应样品的终止操作不当则导致相对较高的误差。该检测法同样适用于时间进程研究和抑制性研究。图A展示了HIV-1蛋白酶对mEYFP融合底物的蛋白水解切割随时间变化的情况，而图B则展示了安普那韦（amprenavir）对切割反应的抑制作用。根据抑制研究获得的数据，可同时确定活性酶浓度和抑制常数。该检测方法还可优化用于研究酶活性对 pH 的依赖性，如图 A 以烟草蚀刻病毒蛋白酶为例所示。图 B 表明了该检测方法在 pH 条件下的局限性，显示中性或微碱性 pH 与检测完全兼容，而酸性 pH 会促进底物从磁珠表面发生自发解离。本图展示了经HIV-1蛋白酶在溶液中消化后产生的纯化的完整荧光底物以及荧光C端切割片段。若样品制备过程中采用了非变性条件，则可在电泳结束后通过含SDS的聚丙烯酰胺凝胶在蓝光透射下直接检测荧光组分。不同荧光蛋白可根据其颜色加以区分。在基于磁珠的检测之后，也可通过紫外光照在凝胶中检测样品上清液中的非变性荧光蛋白。相比之下，若在样品制备过程中采用了变性条件，则变性后的蛋白质在SDS-PAGE结束后无法立即在凝胶中被检测到。然而，通过从凝胶中去除SDS，可使变性的荧光蛋白发生部分复性，从而恢复其可检测性。因此，SDS-PAGE 之后需进行凝胶内复性操作。荧光蛋白的复性能力使其不仅可以通过荧光，还可根据其分子量进行鉴定。本文演示了我们近期开发的基于磁珠的荧光蛋白酶检测平台的使用方案。我们以 HIV-1 蛋白酶的酶动力学研究为例，展示了该系统的应用。我们使用了与 mTurquoise 和 mApple 融合的重组检测底物，该底物包含蛋白酶的切割位点序列。除荧光分析外，还对检测样品进行了 SDS-PAGE 分析。我们已证明，变性的荧光蛋白在SDS-PAGE后的凝胶中可部分复性，从而可通过荧光及分子量对底物和蛋白水解片段进行鉴定。

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我们介绍一种荧光生成型肽切割检测方法，可快速筛选蛋白酶对代表病毒融合肽切割位点的肽段的蛋白水解活性。该方法也可用于蛋白质序列中任何其他氨基酸基序，以检测蛋白酶活性。...

一种用于筛选蛋白水解活性的荧光生成肽切割检测法：在冠状病毒刺突蛋白激活中的应用

本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。...

荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要，对结合动力学的研究有助于揭示蛋白质复合物的动态特性与功能。本文介绍一种利用荧光共振能量转移和停流技术来定量测定蛋白质复合物动力学参数的方法。...

利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

的 本方案旨在利用最新版本的分裂荧光素酶互补实验，在活体哺乳动物细胞中展示高尔基体驻留型III类膜蛋白之间发生的异源相互作用，这些膜蛋白具有胞质暴露的N端和/或C端。...

利用分裂荧光素酶互补实验展示高尔基体驻留型III型膜蛋白形成的异源复合物

学习使用荧光蛋白融合重组底物和磁性琼脂糖珠的高通量蛋白酶检测平台。该方法以HIV-1病毒蛋白酶为例，支持实时监测蛋白酶活性并促进药物研发。

利用重组融合蛋白进行荧光蛋白酶检测平台及其凝胶内复性

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