骨髓间充质干细胞在浆组织中的分离及与癌细胞联合培养研究其相互作用

这种方法有助于回答干细胞领域有关成人干细胞在调节癌细胞行为中的作用的关键问题。这项技术的主要优点是，它允许评估癌细胞和干细胞在体外相互作用，而无需使用生物体。这项技术具有癌症转移的潜力，因为它模型成人干细胞在癌症转移到硬组织如骨骼的促进作用。

手术的演示将由我实验室的博士后HuseyinApddik进行。首先使用无菌提取钳子从17至20岁的年轻人获得的智齿中心去除纸浆组织。将组织放入10厘米组织培养皿中，用手术刀将样品切碎成两到三毫米的碎片。

将每道菜中的碎片转移到经过六孔处理的组织培养的单个孔中，用200微升完整的DMEM覆盖每孔的组织。允许组织附着在井底，在加湿的37摄氏度和5%的CO2细胞培养箱中至少孵育两个小时。在孵育结束时，用2至2.5毫升的新鲜完整培养剂喂养组织，再培养8至9天的细胞。

当培养达到80%的汇合时，用两毫升PBS洗净每井，然后用两毫升的三辛在37摄氏度下分体细胞分离。两分钟后，停止反应与两毫升完整的DMEM每井和通过离心收集细胞。然后，每两口细胞将颗粒重新用15毫升新鲜完整培养，将细胞进入T75烧瓶中，以进行后续培养。

在至少八段之后，通过光显微镜对细胞进行可视化。牙髓干细胞应附着在培养皿上，并表现出主轴状细胞形态。对于表面标记分析，在证明三辛化后，在室温下用4%半甲醛将细胞修复20分钟，在1.5毫升管中，然后每次洗涤500微升PBS中三次清洗。

上次洗涤后，将细胞与感兴趣的适当抗体标记在100微升PBS每管4摄氏度下一小时。在孵育结束时，将细胞在PBS中清洗三次，如证明，并在每管100微升PBS中用适当的二级抗体标记细胞，在4摄氏度下30分钟。然后在PBS中清洗样品三次，然后根据标准方案通过流式细胞测量分析细胞。

为了对牙髓干细胞进行分化，在500微升完整DMEM中将10倍至4个细胞种子种子放入24孔板的单个孔中，在细胞培养培养箱中24小时孵化。第二天，用适当的分化介质替换每井的培养物，将细胞返回到培养箱，每周两次刷新该培养物，为期两周。根据标准协议，冯·科萨和阿尔西安蓝色染色可以确认差异。

经过两到四个通道，当培养物达到80%汇合时，从培养的牙髓干细胞中收集有条件的中超细胞。然后，将收集的介质离心，以清除任何废物组织材料和细胞碎屑，并在负20摄氏度下储存介质，直到使用。对于癌细胞治疗，将10倍至5个肿瘤细胞播种到12孔板的单个孔中，在37摄氏度和5%CO2下进行隔夜孵育。

第二天早上，使用无菌的200微升尖端，使每个井的划痕损伤，并立即更换每一个井的上能与含有各种浓度的调节介质的新鲜介质。然后，立即观察倒置显微镜下的划痕，并定期获取受伤培养物的图像。在分析结束时，在 ImageJ 中测量一段时间的划痕闭合。

为了评估牙髓干细胞的迁移，首先将三倍10至四个牙髓干细胞的种子到单独的24孔板插入物上，在250微升DMEM中用0.4微米孔隙，在37摄氏度下过夜孵育这些插入物。接下来，将四个肿瘤细胞的5倍10种子放入500微升DMEM的24孔板的单个孔中，在37摄氏度下进行夜间孵育。第二天早上，划伤肿瘤细胞，如证明。

用500微升的新鲜DMEM代替超级钠，并将一个牙髓干细胞种子插入到每个用新鲜培养基喂养的井中。然后立即在倒置显微镜上观察细胞，并定期对细胞进行成像，以评估牙髓干细胞迁移。为了评估牙髓干细胞与癌细胞的直接相互作用，trypsin化每个标记培养，以获得单细胞悬浮液，并通过离心收集分离细胞。

将颗粒重新填充在稀释剂 C 缓冲液中，根据制造商的说明提供，并孵育细胞室温 10 分钟。用100微升胎儿牛血清终止染色反应，通过离心收集细胞。然后将具有完整生长介质的细胞离心，然后将五倍10电镀到每井的四个牙髓干细胞和肿瘤细胞，在两毫升全培养的两毫升中以一比一的比例。

通过离心在24或48小时的孵育后收集细胞，然后用PBS清洗。然后，在5毫升的圆底流细胞学管和涡流中重新填充300微升荧光活性细胞分选缓冲液中的细胞，以分散任何细胞聚集体，然后根据标准流量细胞位分析方案分析细胞。牙髓干细胞在电镀后表现出成纤维细胞状细胞形态，并表达中层干细胞表面抗原，而不是造血细胞标记。

在适当的分化鸡尾酒应用之后，在牙髓干细胞培养物中也观察到与骨质、软骨和致生分化相关的形态和分子水平的变化。与控制性中等治疗的肿瘤细胞培养物相比，以10%和20%的调控性培养物治疗的划痕性肿瘤细胞培养物显著增加划痕闭合。与控制细胞共培养物相比，牙髓干细胞插入共培养物的分泌分子也增加了受伤肿瘤细胞的划痕闭合。

荧光显微镜分析牙髓茎和肿瘤细胞在体外细胞培养中的相互作用，揭示了一个组织良好的结构，其中肿瘤细胞在48小时后迅速增殖。在尝试此程序时，重要的是要记住将两个组织样本留在冷介质中，并立即将样品运送到实验室，以尽量减少细胞死亡。该技术开发后，为干细胞领域的研究人员探索成人干细胞癌在人类中的相互作用铺平了道路。

按照这个程序，其他方法，如免疫细胞跟踪各种干细胞和癌症类型的差异标记细胞，以回答有关成人干细胞如何与癌细胞相互作用和控制癌症转移的其他问题。不要忘记，使用人体样本可能很危险，在执行此程序时，应始终实施诸如分析传染病患者样本和获得患者书面同意等预防措施。