Name: 骨髓间充质干细胞在浆组织中的分离及与癌细胞联合培养研究其相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解牙髓间充质干细胞的分离方法及其与前列腺癌细胞的共培养技术。该体外实验方法无需活体动物即可研究干细胞与癌细胞的相互作用机制，为癌症转移研究提供重要实验模型。

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本研究由叶迪泰佩大学资助。本文中使用的所有数据和图表此前均已发表34。

在获得机构伦理委员会批准后，已取得患者的书面知情同意。
1. 牙髓干细胞的分离与培养
<ol>
	<li>在拔除后8小时内，将从17至20岁青少年中获取的智齿转移至含有完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）[低糖DMEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/两性霉素（PSA）溶液]的15 mL离心管中。转移过程中保持组织材料低温（4 °C），以避免潜在的细胞死亡。</li>
	<li>使用无菌镊子小心地从牙齿中心取出牙髓组织，将牙髓组织置于盛有冷的完全DMEM培养基的10 cm组织培养皿中，并用手术刀将其切成小块（2–3 mm）。 
	注意：所有实验操作均应在超净工作台内的无菌条件下进行。该非酶解技术此前已有应用21,22,23。</li>
	<li>将小块牙髓组织放入经组织培养处理的6孔板中，并加入200 µL完全DMEM培养基，以覆盖每一块小组织。</li>
	<li>将组织培养孔板置于37 °C、加湿空气环境（80%湿度）及5% CO2条件下孵育2小时，以促进组织贴壁。 
	注意：通过控制培养基蒸发，此步骤可延长至3–4小时。</li>
	<li>向各孔中加入适量（2–2.5 mL）的完全DMEM培养基，并在37 °C、加湿空气环境及5% CO2条件下继续孵育，以使细胞从组织块中迁移并展开。 
	注意：细胞约在4天后可见，8–9天后达到汇合状态。</li>
	<li>当细胞达到80%汇合度时，从6孔板中移除培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入2 mL胰蛋白酶。在37 °C、加湿空气环境及5% CO2的培养箱中孵育2分钟。随后加入2 mL完全DMEM培养基，再孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 x g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞传代至含有完全DMEM培养基的培养瓶中，用于后续实验。向T-75培养瓶中加入15 mL完全DMEM培养基，将两个6孔板孔中的细胞转移至一个T-75培养瓶中，并在37 °C、加湿空气环境及5% CO2条件下孵育。</li>
</ol>
2. DPSCs 的表征
<ol>
	<li>进行形态学分析。
	<ol>
		<li>在完全DMEM培养基中，将种子细胞（步骤1.6）接种于组织培养包被的培养瓶（或6孔板）中，传代培养至少8代，以观察细胞形态。</li>
		<li>在光学显微镜下观察细胞，确定成纤维细胞样形态。细胞应贴附于培养皿表面，并呈现梭形细胞形态。 
		注意：或者，可将细胞以单细胞形式在培养板中培养长达14天，以观察成纤维细胞和间充质干细胞（MSCs）特有的集落形成能力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行表面标志物分析。
	<ol>
		<li>从步骤1.7中用胰蛋白酶消化细胞。移除T-75组织培养瓶中的培养基，用2 mL PBS洗涤，加入2 mL胰蛋白酶。在37°C培养箱中孵育2分钟 37 °C 在加湿空气环境及5% CO₂条件下2然后加入2 mL完全DMEM培养基，孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>用4%多聚甲醛在室温下于1.5 mL离心管中固定细胞20分钟，随后用 500 µL 用 PBS 洗涤 3 次以去除多聚甲醛。</li>
		<li>将固定后的细胞与抗 CD29、CD34、CD14、CD45、CD90、CD105、CD166 和 CD73 抗体在室温下孵育 1 小时 4 °C 在 100 µL PBS溶液。 
		注意：所用抗体的浓度为 0.5 µg/mLCD34、CD14 和 CD45 用作阴性标志物，而 CD29、CD90、CD105、CD166 和 CD73 用作间充质干细胞（MSCs）的阳性细胞表面标志物。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，并使用相应的二抗，如异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE） 等等。 用于标记。将细胞与1:500稀释的二抗孵育 100 µL PBS 中孵育 30 分钟 4 °C 用 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>将样品避光保存用于流式细胞术分析，并通过流式细胞术检测阳性与阴性染色。 
		注意：使用未染色的对照细胞设置前向散射和侧向散射。通过排除死细胞、碎片和未染色细胞群体来设定阳性染色群体的门控。使用 100 µm 使用45 psi鞘压的喷嘴，收集10,000个事件，通过设置通道确定阳性DPSCs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DPSCs的分化。
	<ol>
		<li>接种 1 × 104 将细胞接种至24孔板中，加入完全DMEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养24 h 37 °C 在含5% CO₂的湿润空气环境中2.</li>
		<li>使用完全DMEM培养基作为基础培养基配制分化培养基。通过添加100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和0.2 mM抗坏血酸配制成骨诱导培养基。通过添加1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）、100 nM地塞米松和100 ng/mL转化生长因子β（TGF-β）配制软骨诱导培养基。 14 μg/mL 抗坏血酸，以及1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）。通过混合100 nM 地塞米松制备成脂诱导培养基， 5 μg/mL 胰岛素，0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），以及 60 μM indomethacin 
		注意：分化培养基可保存于 4 °C 至少一周。</li>
		<li>更换为成骨、成软骨或成脂诱导分化培养基，每周换液两次，持续两周。</li>
		<li>通过von Kossa染色和阿利新蓝染色、酶活性检测（碱性磷酸酶活性）、免疫细胞化学以及定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，按照先前所述方案确认分化情况21.
		<ol>
			<li>在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后对细胞进行冯克萨（von Kossa）染色和阿尔新蓝（Alcian blue）染色。用PBS洗涤固定后的细胞，并根据试剂盒制造商的说明使用冯克萨染色试剂盒染色，以观察钙盐沉积。</li>
			<li>将1.00 g 阿利新蓝染料溶于100 mL 3%（v/v）乙酸溶液中，配制阿利新蓝染色液，用于后续染色。用PBS洗涤固定后的细胞，加入阿利新蓝染色液染色30 min。使用光学显微镜观察染色样本。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 条件培养基（CM）的制备
<ol>
	<li>在收集条件培养基（CM）前24小时，将步骤1.7中细胞的培养基更换为新鲜的完全DMEM。 
	注意：建议使用第2至第4代细胞。</li>
	<li>当培养的DPSCs细胞达到80%融合度时，收集条件培养基（CM）。将收集的培养基在300 × g下离心5分钟，以去除废弃的组织材料和细胞碎片。 
	注意：也可使用0.2 µm注射器滤器去除条件培养基中的碎片。</li>
	<li>收集上清液，并于-20 °C保存以用于后续实验。 
	注意：长期保存应将上清液置于-80 °C。</li>
</ol>
4. 用条件培养基处理癌细胞
<ol>
	<li>进行细胞活力分析。
	<ol>
		<li>将PC-3细胞（人前列腺癌细胞）以5 × 10⁴个/孔的细胞密度接种于96孔板中3 细胞/孔，加入完全DMEM培养基，在湿润的培养箱中于37°C、5% CO₂条件下孵育 37 °C 和5% CO2 24小时。</li>
		<li>用含10%、20%、30%、40%和50%条件培养基（CM，v/v）的完全DMEM处理细胞，处理24 h。</li>
		<li>使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑（MTS）法检测细胞活力，方法如前所述24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析。
	<ol>
		<li>将PC-3细胞以2 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中5 细胞/孔，在加湿培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 过夜。</li>
		<li>将20% CM（v/v）与完全DMEM培养基混合，加入细胞中，处理24小时。</li>
		<li>用胰蛋白酶处理细胞并悬浮于 50 μL TUNEL反应混合液（标记液 + 酶液，随试剂盒提供）并置于 37 °C 在加湿且含5% CO₂的环境中孵育60分钟2 大气 
		注意：进行胰蛋白酶消化时，从6孔细胞培养板中移除培养基，用1 mL PBS洗涤，并加入 500 µL 胰蛋白酶。在37℃培养箱中孵育2分钟 37 °C 在加湿空气环境及5% CO₂条件下2加入1 mL完全DMEM培养基，孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>用 PBS 洗涤，并将细胞重悬于 PBS 中，通过流式细胞术进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行qPCR分析。
	<ol>
		<li>将PC-3细胞以2 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中5 细胞/孔，在湿润的培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 过夜。</li>
		<li>将20% CM（v/v）与完全DMEM培养基混合，加入细胞中，处理24小时。</li>
		<li>用胰蛋白酶消化细胞，并收集细胞沉淀用于RNA提取和cDNA合成。 
		注意：从6孔细胞培养板中移除培养基，用1 mL PBS洗涤，并加入 500 µL 胰蛋白酶。在37℃培养箱中孵育2分钟 37 °C 在加湿空气环境及5% CO₂条件下2加入1 mL完全DMEM培养基，孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>按照先前所述方案进行 qPCR 实验25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行癌细胞迁移实验。
	<ol>
		<li>接种 1 × 105 将PC-3细胞接种至12孔板中，于湿润培养箱内37℃过夜培养 37 °C 和5% CO2.</li>
		<li>用无菌的划痕工具划伤细胞 200 μL 尖端处理，并立即更换为含不同浓度CM的新鲜培养基例如10%、20%、30%、40% 和 50% CM（v/v）与完全 DMEM 混合</li>
		<li>在倒置显微镜下观察划痕，并在不同时间点（0 和 24 h）拍照。</li>
		<li>使用 Image J 软件，通过以下公式测量划痕闭合率： 
		<img alt="划痕闭合率（%）公式，用于伤口愈合实验的测量；数学示意图。" src="/files/ftp_upload/58825/58825eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
		注意：使用 Image J 软件打开划痕图像。绘制一条与图像中已有的比例尺长度相同的直线。点击分析，设置比例尺，观察所绘制直线的像素距离。将比例尺的大小填写至已知距离部分，并设置单位（像素、cm） 等等。)，然后点击“确定”。再次进入“分析”部分，点击“测量”。这将首先显示比例尺在所选单位下的尺寸。点击划痕的一端，并拖动至划痕的另一端。记录每个时间点（0 h 和 24 h）的数值。将这些数值代入上述公式，计算划痕闭合率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 癌细胞与牙髓干细胞通过间接接触诱导的细胞迁移
<ol>
	<li>将 3 × 104 个 DPSCs 接种至具有 0.4 μm 孔径的 24 孔板小室中，在 37 °C、湿润培养箱中培养过夜。</li>
	<li>将 PC-3 细胞以 5 × 104 的细胞密度接种至 24 孔板中，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养过夜。</li>
	<li>用无菌的 200 μL 枪头划线刮伤 PC-3 细胞层，更换新鲜培养基，并将携带 DPSCs 的小室置于 PC-3 细胞上方。</li>
	<li>在倒置显微镜下观察细胞，并在不同时间点（0 和 24 h）拍照，以分析细胞迁移情况。</li>
</ol>
6. 共培养实验与流式细胞术分析
<ol>
	<li>分别使用 PKH67（绿色）和 PKH26（红色）荧光细胞连接染料对 PC-3 细胞和 DPSCs 进行标记26。</li>
	<li>分别对 PC-3 细胞和 DPSCs 进行胰蛋白酶消化。从 T-75 组织培养瓶中移除培养基，用 2 mL PBS 洗涤，并加入 2 mL 胰蛋白酶。在 37 °C、含加湿空气和 5% CO2 的培养箱中孵育 2 分钟。随后加入 2 mL 完全 DMEM 培养基，再孵育 2 分钟以抑制胰蛋白酶活性。</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清液，并将细胞沉淀重悬于试剂盒提供的稀释剂 C 缓冲液中配制的染料溶液中（参见 材料表）。</li>
	<li>将细胞在染料溶液中孵育 10 分钟，然后加入 100 µL FBS 终止染色反应。以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清液，并用完全生长培养基洗涤细胞，随后进行共培养。</li>
	<li>将标记后的细胞以 1:1 比例（DPSCs:PC3）接种至 6 孔板中（每孔 5 × 104 个细胞）。在完全 DMEM 培养基中维持共培养细胞的生长。</li>
	<li>在孵育 24 小时或 48 小时后，以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞，并用 PBS 洗涤。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 mL 圆底流式细胞仪管中的 300 µL 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中。在样品分析前涡旋振荡，以充分分散细胞聚集体。</li>
	<li>使用 100 µm 喷嘴，鞘液压力设为 45 psi。 
	注意：过高的流速可能会降低荧光检测的灵敏度。</li>
	<li>使用未染色对照细胞和单色标记细胞，按照前述方法调整合适的前向散射和侧向散射激光电压，并进行补偿设置27。 
	注意：应设置门控以选择活细胞，排除细胞碎片、死细胞或细胞聚集体。</li>
	<li>收集 10,000 个事件（建议收集 100,000 个事件），通过设置 FL-1（绿色）和 FL-2（红色）通道，确定绿色 DPSCs 和红色 PC-3 细胞的阳性百分比。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

间充质干细胞对肿瘤微环境的贡献受多种相互作用调控，包括杂交细胞的形成 通过 细胞融合、细胞内吞作用或干细胞与癌细胞之间的细胞因子和趋化因子活性28结构组织、细胞间相互作用以及分泌因子决定了癌细胞在肿瘤促进、进展及向周围组织转移过程中的行为。恰当 离体 研究癌症进展和转移过程中细胞间通讯机制，需要利用模型系统来探究定居细胞群体间相互作用的机理。
我们利用牙髓干细胞（DPSCs）建立了前列腺癌细胞与牙髓干细胞相互作用的模型系统。这类成体干细胞的优势在于组织来源易于获取且分离步骤简便。然而，本实验方案的局限性在于仅使用了DPSCs，而未与已知的其他成体干细胞类型进行比较。目前的共培养方法可分为直接和间接两种技术，包括可溶性分泌分子介导的旁分泌信号传导，以及不同细胞群体在同一环境中的直接共培养29,30,31。我们使用经过...

间充质干细胞（MSCs），具有&#160;具有分化潜能并可参与骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等间充质组织再生的细胞，已从成人机体几乎所有的组织中分离获得1,2除了在慢性炎症或损伤情况下通过产生常驻细胞以维持组织稳态外，它们还分泌关键的细胞因子和生长因子，以协调血管生成、免疫系统功能及组织重塑。3间充质干细胞与肿瘤组织的相互作用尚不明确，但越来越多的证据表明，间充质干细胞可能促进肿瘤的发生、发展及转移4.
间充质干细胞向损伤或慢性炎症区域的归巢能力使其成为基于干细胞治疗的宝贵候选者。然而，癌组织， &#34;永不愈合的伤口&#34;，也会释放炎症性细胞因子、促血管生成分子以及重要的生长因子，从而将间充质干细胞（MSCs）募集至肿瘤发生区域5尽管有关间充质干细胞抑制肿瘤生长的报道较为有限6,7，其促进癌症进展和转移的作用已有大量报道8MSCs 通过多种方式直接或间接影响肿瘤发生，包括抑制免疫细胞、分泌支持癌细胞增殖和迁移的生长因子/细胞因子、增强血管生成活性以及调控上皮-间质转化（EMT）9,10肿瘤微环境包含多种细胞类型，如癌症相关成纤维细胞（CAFs）和/或肌成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及免疫细胞。11在这些细胞中，CAFs 是肿瘤区域中数量最多的细胞类型，可分泌多种促进癌症生长和转移的趋化因子。8已证明骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）可在肿瘤间质中分化为癌相关成纤维细胞（CAFs）12.
牙髓干细胞（DPSCs）由Gronthos et al.13于2000年首次鉴定为来源于牙组织的间充质干细胞（MSCs），随后被其他研究者广泛研究14,15，其表达多能性标志物如Oct4、Sox2和Nanog16，并可分化为多种细胞谱系17。基因和蛋白表达分析证实，DPSCs产生的生长因子/细胞因子水平与其他MSCs相当，包括血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-6、IL-10和干细胞因子（SCF），以及fms样酪氨酸激酶-3配体（Flt-3L），这些因子可能促进血管生成、调节免疫细胞，并支持癌细胞的增殖和迁移18,19,20。尽管MSCs与肿瘤微环境之间的相互作用已在文献中得到充分记载，但DPSCs与癌细胞之间的关系尚未被评估。在本研究中，我们建立了高转移性前列腺癌细胞系PC-3与DPSCs的共培养及条件培养基处理策略，以探讨牙源性MSCs在肿瘤进展和转移中的潜在作用机制。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885084</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（Trypsin）</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>用于细胞解离</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>用于洗涤</td></tr><tr><td>地塞米松（Dexamethasone）</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>成脂分化培养基组分</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸（β-Glycerophosphate）</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td>成骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>抗坏血酸（Ascorbic acid）</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>成骨和成软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS &amp;minus;G）</td><td>Invitrogen</td><td>41400045</td><td>成软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;</td><td>Sigma</td><td>SRP3171</td><td>成软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>胰岛素（Insulin）</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>成脂分化培养基组分</td></tr><tr><td>异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）</td><td>Sigma</td><td>I7018</td><td>成脂分化培养基组分</td></tr><tr><td>吲哚美辛（Indomethacin）</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td>成脂分化培养基组分</td></tr><tr><td>MTS试剂</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>细胞活力分析</td></tr><tr><td>TUNEL检测</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td>凋亡分析</td></tr><tr><td>24孔板小室（inserts）</td><td>Corning</td><td>3396</td><td>用于跨孔迁移实验</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>PKH67GL</td><td>用于共培养细胞染色</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td>用于共培养细胞染色</td></tr><tr><td>多聚甲醛（Paraformaldehyde）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用于细胞固定</td></tr><tr><td>von Kossa染色试剂盒</td><td>BioOptica</td><td>04-170801.A</td><td>用于细胞染色（分化检测）</td></tr><tr><td>阿利新蓝（Alcian blue）</td><td>Sigma</td><td>A2899</td><td>用于细胞染色（分化检测）</td></tr></tbody></table>

从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

癌症作为一种多步骤、复杂的疾病，不仅受到单个细胞增殖和生长的调控，还受到肿瘤微环境及细胞间相互作用的控制。识别癌症细胞与干细胞之间的相互作用，包括细胞外环境的变化、物理性接触以及分泌因子等，可能有助于发现新的治疗策略。我们结合已知的共培养技术，建立了一种用于研究间充质干细胞（MSCs）与癌细胞相互作用的模型系统。在本研究中，采用直接和间接共培养技术，考察了牙髓干细胞（DPSCs）与PC-3前列腺癌细胞之间的相互作用。利用来自DPSCs的条件培养基（CM）以及孔径为0.4 µm的trans-well小室膜，研究其旁分泌效应。通过将不同类型细胞共同培养，以研究直接的细胞-细胞相互作用。结果表明，条件培养基可促进前列腺癌细胞的增殖，并减少其凋亡。无论是条件培养基还是trans-well系统，均可增强PC-3细胞的迁移能力。使用不同膜染料标记的细胞被接种至同一培养容器中，在直接共培养条件下，DPSCs与PC-3细胞共同形成了自组织结构。总体而言，研究结果表明，共培养技术可作为研究癌症细胞与间充质干细胞相互作用的有效模型系统。

图1 描述了在培养条件下DPSCs的间充质干细胞（MSC）的一般特征。DPSCs在接种后呈现成纤维细胞样细胞形态（图1B）。间充质干细胞表面抗原（CD29、CD73、CD90、CD105 和 CD166）高表达，而造血细胞标志物（CD34、CD45 和 CD14）为阴性（图1C). 在应用成骨、成软骨和成脂诱导剂后，观察到牙髓干细胞（DPSCs）培养物在形态学和分子水平上发生与成骨、成软骨及成脂分化相关的改变 (图1D).
为了确定牙髓干细胞（DPSCs）分泌分子对前列腺癌细胞增殖和迁移的活性，我们应用了从培养的牙源性干细胞中收集的条件培养基（CM），并分析了癌细胞的增殖和迁移行为。...

我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。

癌症作为一种多步骤、复杂的疾病，不仅受单个细胞增殖和生长的调控，还受到肿瘤微环境等多种因素的控制。

该方法有助于解答干细胞领域中关于成体干细胞在调控癌细胞行为方面作用的关键问题。该技术的主要优势在于，它能够在不使用活体生物的情况下，在体外评估癌细胞与干细胞之间的相互作用。该技术在癌症转移研究方面具有潜力，因为它可模拟成体干细胞在癌细胞向骨等硬组织转移过程中所起的促进作用。该操作步骤将由我实验室的博士后 Huseyin Apdik 演示。首先使用无菌提取镊子从17至20岁青年人的智齿中取出牙髓组织。将组织置于冷的完全DMEM培养基中，放入10厘米组织培养皿内，并用手术刀将样本切成2至3毫米大小的碎片。将每个培养皿中的组织块分别转移至经组织培养处理的六孔板的各个孔中，每孔加入200微升完全DMEM培养基覆盖组织。将六孔板置于湿度饱和、37摄氏度、5% CO2的细胞培养箱中孵育至少2小时，使组织贴附于孔底。孵育结束后，每孔更换为2至2.5毫升新鲜完全培养基，继续培养8至9天。当细胞培养至80%融合度时，每孔用2毫升PBS洗涤，随后在37摄氏度下加入2毫升胰蛋白酶消化细胞使其脱离。2分钟后，每孔加入2毫升完全DMEM培养基终止反应，并通过离心收集细胞。然后，将每两孔细胞的沉淀重悬于15毫升新鲜完全培养基中，传代至T75培养瓶中进行后续培养。经过至少八次传代后，通过光学显微镜观察细胞。牙髓干细胞应已贴附于培养皿上，并呈现纺锤形的细胞形态。进行表面标志物分析时，在证实已完成胰蛋白酶消化后，将细胞置于1.5毫升离心管中，用4%多聚甲醛在室温下固定20分钟，随后每次用500微升PBS洗涤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，在每管100微升PBS中加入适量的目标一抗，于4摄氏度孵育一小时。孵育结束后，如前所述用PBS洗涤细胞三次，然后在每管100微升PBS中加入相应的二抗，于4摄氏度避光孵育30分钟。随后将样品用PBS洗涤三次，再根据标准操作流程进行流式细胞术分析。进行牙髓干细胞分化时，将1 × 10⁴个细胞分别接种至24孔板的各个孔中，每孔加入500 µL完全DMEM培养基，在细胞培养孵箱中孵育24小时。次日，将每孔中的培养基更换为相应的分化诱导培养基，并将细胞放回孵箱继续培养，每周更换两次培养基，持续两周。可通过von Kossa染色和阿利新蓝（Alcian blue）染色，按照标准实验方案确认分化效果。经过两到四次传代后，当培养的牙髓干细胞达到80%融合度时，收集条件培养基的上清液。然后，将收集的培养基离心以去除任何废弃的组织材料和细胞碎片，并将培养基在-20摄氏度下保存至使用。对于癌细胞处理，将1×10⁵个肿瘤细胞接种至12孔板的各个孔中，在37摄氏度和5%CO₂条件下过夜培养。第二天早晨，使用无菌的200微升枪头在每个孔中制造划痕损伤，并立即用含有不同浓度条件培养基的新鲜培养基替换每个孔中的上清液。随后，在倒置显微镜下立即观察划痕，并在规定的时间间隔内获取损伤培养区域的图像。分析结束时，使用ImageJ软件随时间测量划痕的闭合情况。为评估牙髓干细胞的迁移能力，首先将3 × 10⁴个牙髓干细胞分别接种至含有0.4 µm孔径的24孔板小室中，每孔加入250 µL DMEM培养基，并于37°C培养过夜。接着，将5 × 10⁴个肿瘤细胞分别接种至24孔板的各孔中，每孔加入500 µL DMEM培养基，于37°C培养过夜。次日早晨，按所示方法对肿瘤细胞进行划痕处理。吸除上清液，每孔加入500微升新鲜DMEM培养基，并将一个接种有牙髓干细胞的插入式培养小室放入每孔中，补充新鲜培养基。随后立即在倒置显微镜下观察细胞，并定期成像以评估牙髓干细胞的迁移情况。为评估牙髓干细胞与癌细胞之间的直接相互作用，将每种标记的培养物进行胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液，并通过离心收集解离的细胞。根据制造商说明书，用稀释液C缓冲液配制不同的细胞连接染料溶液，将沉淀重悬于其中，并在室温下孵育10分钟。加入100微升胎牛血清终止染色反应，离心收集细胞。随后用完全培养基离心洗涤细胞，然后在六孔板中每孔接种5 × 10⁴个牙髓干细胞和肿瘤细胞，细胞比例为1:1，每孔加入2毫升完全培养基。在培养24或48小时后，通过离心收集细胞，并用PBS洗涤一次。随后，将细胞重悬于300微升荧光激活细胞分选缓冲液中，加入至5毫升圆底流式细胞管内，涡旋振荡以分散任何细胞团块，然后根据标准流式细胞分析方案进行细胞分析。牙髓干细胞在接种后呈现成纤维细胞样形态，并表达间充质干细胞表面抗原，但不表达造血细胞标志物。在应用适当的分化诱导剂后，牙髓干细胞培养物中也观察到与成骨、软骨和脂肪分化相关的形态学和分子水平的变化。与对照培养基处理的肿瘤细胞培养物相比，用10%和20%浓度的条件培养基处理划痕损伤的肿瘤细胞培养物可显著促进划痕闭合。与对照细胞共培养相比，牙髓干细胞插入式共培养所分泌的分子也能促进损伤肿瘤细胞的划痕闭合。体外细胞培养中牙髓干细胞与肿瘤细胞相互作用的荧光显微镜分析显示，在培养48小时后，肿瘤细胞在形成的结构化组织中迅速增殖。在进行该操作时，需注意将两个组织样本置于低温培养基中，并立即运送至实验室，以尽量减少细胞死亡。该技术建立后，为研究人员探索人类成体干细胞与癌症之间的相互作用开辟了道路。通过该实验流程，还可开展其他方法，例如对不同类型干细胞和癌细胞进行差异标记后的免疫细胞示踪，以进一步探究成体干细胞如何与癌细胞相互作用并调控癌症转移。需要注意的是，操作人体样本可能存在风险，因此在实施该实验流程时，必须采取相应预防措施，例如对患者样本进行传染病检测，并获取患者的书面知情同意书。

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Cancer Research

癌症研究

骨髓间充质干细胞在浆组织中的分离及与癌细胞联合培养研究其相互作用

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

本视频展示了一种利用Transwell小室建立三叉神经元与原代牙髓细胞共培养的技术。在这种物理分离的条件下，从牙髓组织中获得的间充质细胞会分泌旁分泌信号分子，这些分子可通过小室的孔隙穿过，促进神经元向间充质细胞方向分化和迁移，从而建立共培养系统。...

建立牙髓细胞与三叉神经元的共培养体系以实现交互通讯

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

当受到可溶性因子或特定生物材料刺激时，间充质干细胞（MSCs）具有向成骨细胞系分化的潜能。本研究提出了一种新型的人羊膜来源间充质干细胞（AM-hMSCs）递送方案，该方案采用牛骨基质Nukbone（NKB）作为支架材料。...

从多孔骨基质中分离人类间充质干细胞及其培养

人源间充质干细胞（MSC）的免疫调节特性在临床应用中显得愈发重要。通过采用经荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）预标记的MSC与外周血白细胞共培养体系，我们描述了 体外...

人源间充质干细胞（MSCs）免疫调节特性的评估

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。...

人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

我们描述了牙髓（DP）原代细胞的分离、分散和接种，并在上层的transwell小室滤膜上共培养三叉神经节（TG）神经元。可通过免疫荧光或RNA/蛋白质分析来检测DP细胞的细胞反应。利用共聚焦显微镜进行神经元标志物的免疫荧光染色，可分析神经突的生长反应。...

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

本文提供了利用组织块培养法建立牙髓干细胞原代培养的逐步操作指南，并依据ICSCRT指南对这些细胞进行表征。通过本方案分离获得的细胞可被视为间充质干细胞，用于后续应用。...

牙髓干细胞的原代培养

本方案重点介绍通过酶消化法从牙髓中分离、培养和保存多能干细胞的方法。此外，还展示了这些细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能，强调了操作过程中精确性和一致性的关键作用。...

从人类乳牙和恒牙中分离、培养及鉴定牙髓干细胞

了解牙髓间充质干细胞的分离方法及其与前列腺癌细胞的共培养技术。该体外实验方法无需活体动物即可研究干细胞与癌细胞的相互作用机制，为癌症转移研究提供重要实验模型。

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