从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

该方法有助于解答干细胞领域中关于成体干细胞在调控癌细胞行为方面作用的关键问题。该技术的主要优势在于，它能够在不使用活体生物的情况下，在体外评估癌细胞与干细胞之间的相互作用。该技术在癌症转移研究方面具有潜力，因为它可模拟成体干细胞在癌细胞向骨等硬组织转移过程中所起的促进作用。

该操作步骤将由我实验室的博士后 Huseyin Apdik 演示。首先使用无菌提取镊子从17至20岁青年人的智齿中取出牙髓组织。将组织置于冷的完全DMEM培养基中，放入10厘米组织培养皿内，并用手术刀将样本切成2至3毫米大小的碎片。

将每个培养皿中的组织块分别转移至经组织培养处理的六孔板的各个孔中，每孔加入200微升完全DMEM培养基覆盖组织。将六孔板置于湿度饱和、37摄氏度、5% CO2的细胞培养箱中孵育至少2小时，使组织贴附于孔底。孵育结束后，每孔更换为2至2.5毫升新鲜完全培养基，继续培养8至9天。

当细胞培养至80%融合度时，每孔用2毫升PBS洗涤，随后在37摄氏度下加入2毫升胰蛋白酶消化细胞使其脱离。2分钟后，每孔加入2毫升完全DMEM培养基终止反应，并通过离心收集细胞。然后，将每两孔细胞的沉淀重悬于15毫升新鲜完全培养基中，传代至T75培养瓶中进行后续培养。

经过至少八次传代后，通过光学显微镜观察细胞。牙髓干细胞应已贴附于培养皿上，并呈现纺锤形的细胞形态。进行表面标志物分析时，在证实已完成胰蛋白酶消化后，将细胞置于1.5毫升离心管中，用4%多聚甲醛在室温下固定20分钟，随后每次用500微升PBS洗涤，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，在每管100微升PBS中加入适量的目标一抗，于4摄氏度孵育一小时。孵育结束后，如前所述用PBS洗涤细胞三次，然后在每管100微升PBS中加入相应的二抗，于4摄氏度避光孵育30分钟。随后将样品用PBS洗涤三次，再根据标准操作流程进行流式细胞术分析。

进行牙髓干细胞分化时，将1 × 10⁴个细胞分别接种至24孔板的各个孔中，每孔加入500 µL完全DMEM培养基，在细胞培养孵箱中孵育24小时。次日，将每孔中的培养基更换为相应的分化诱导培养基，并将细胞放回孵箱继续培养，每周更换两次培养基，持续两周。可通过von Kossa染色和阿利新蓝（Alcian blue）染色，按照标准实验方案确认分化效果。

经过两到四次传代后，当培养的牙髓干细胞达到80%融合度时，收集条件培养基的上清液。然后，将收集的培养基离心以去除任何废弃的组织材料和细胞碎片，并将培养基在-20摄氏度下保存至使用。对于癌细胞处理，将1×10⁵个肿瘤细胞接种至12孔板的各个孔中，在37摄氏度和5%CO₂条件下过夜培养。

第二天早晨，使用无菌的200微升枪头在每个孔中制造划痕损伤，并立即用含有不同浓度条件培养基的新鲜培养基替换每个孔中的上清液。随后，在倒置显微镜下立即观察划痕，并在规定的时间间隔内获取损伤培养区域的图像。分析结束时，使用ImageJ软件随时间测量划痕的闭合情况。

为评估牙髓干细胞的迁移能力，首先将3 × 10⁴个牙髓干细胞分别接种至含有0.4 µm孔径的24孔板小室中，每孔加入250 µL DMEM培养基，并于37°C培养过夜。接着，将5 × 10⁴个肿瘤细胞分别接种至24孔板的各孔中，每孔加入500 µL DMEM培养基，于37°C培养过夜。次日早晨，按所示方法对肿瘤细胞进行划痕处理。

吸除上清液，每孔加入500微升新鲜DMEM培养基，并将一个接种有牙髓干细胞的插入式培养小室放入每孔中，补充新鲜培养基。随后立即在倒置显微镜下观察细胞，并定期成像以评估牙髓干细胞的迁移情况。为评估牙髓干细胞与癌细胞之间的直接相互作用，将每种标记的培养物进行胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液，并通过离心收集解离的细胞。

根据制造商说明书，用稀释液C缓冲液配制不同的细胞连接染料溶液，将沉淀重悬于其中，并在室温下孵育10分钟。加入100微升胎牛血清终止染色反应，离心收集细胞。随后用完全培养基离心洗涤细胞，然后在六孔板中每孔接种5 × 10⁴个牙髓干细胞和肿瘤细胞，细胞比例为1:1，每孔加入2毫升完全培养基。

在培养24或48小时后，通过离心收集细胞，并用PBS洗涤一次。随后，将细胞重悬于300微升荧光激活细胞分选缓冲液中，加入至5毫升圆底流式细胞管内，涡旋振荡以分散任何细胞团块，然后根据标准流式细胞分析方案进行细胞分析。牙髓干细胞在接种后呈现成纤维细胞样形态，并表达间充质干细胞表面抗原，但不表达造血细胞标志物。

在应用适当的分化诱导剂后，牙髓干细胞培养物中也观察到与成骨、软骨和脂肪分化相关的形态学和分子水平的变化。与对照培养基处理的肿瘤细胞培养物相比，用10%和20%浓度的条件培养基处理划痕损伤的肿瘤细胞培养物可显著促进划痕闭合。与对照细胞共培养相比，牙髓干细胞插入式共培养所分泌的分子也能促进损伤肿瘤细胞的划痕闭合。

体外细胞培养中牙髓干细胞与肿瘤细胞相互作用的荧光显微镜分析显示，在培养48小时后，肿瘤细胞在形成的结构化组织中迅速增殖。在进行该操作时，需注意将两个组织样本置于低温培养基中，并立即运送至实验室，以尽量减少细胞死亡。该技术建立后，为研究人员探索人类成体干细胞与癌症之间的相互作用开辟了道路。

通过该实验流程，还可开展其他方法，例如对不同类型干细胞和癌细胞进行差异标记后的免疫细胞示踪，以进一步探究成体干细胞如何与癌细胞相互作用并调控癌症转移。需要注意的是，操作人体样本可能存在风险，因此在实施该实验流程时，必须采取相应预防措施，例如对患者样本进行传染病检测，并获取患者的书面知情同意书。