使用鲎变形细胞裂解物（LAL）检测法检测纳米制剂中的内毒素

该方法有助于回答纳米药物在医学领域的安全性问题。该技术的优势在于其具有标准化特点，并在全球范围内用于产品评估，包括纳米药物。实验操作演示将由纳米技术表征实验室的Barry Neun完成。

配制校准标准品时，使用900 µL鲎试剂（LAL）级水和100 µL对照标准内毒素，根据需要配制适量的中间稀释液，以制备浓度为1 EU/mL的校准标准品。然后取900 µL LAL级水和100 µL浓度为1 EU/mL的校准标准品，配制第二种校准标准品，其浓度为0.1 EU/mL。

然后重复进行十倍系列稀释，以制备两个较低浓度的校准标准品。最终共获得四个校准标准品，浓度范围为每毫升0.001至1个内毒素单位。为制备每毫升0.5个内毒素单位的质量控制样品，将50微升每毫升1个内毒素单位的对照标准内毒素溶液与950微升LAL级水混合。

接下来在软件中选择仪器设置并创建模板。选择“采集数据”，在“常规”选项卡中输入测试编号和数据组。在“硬件”选项卡下，选择仪器类型和LAL方法，并确认屏幕上显示序列号、系统ID以及串口信息。

单击“确定”两次，以确认仪器选择及与仪器的通信，并按照样品将被检测的相同顺序输入样品编号。然后使用默认按钮输入阴性对照标准曲线和待测样品。向已预先标记的玻璃试管中分别加入适量体积的阴性对照校准标准品和质控品，每种设置两个复孔。

向第一个测试管中加入适量体积的鲎试剂（LAL）。短暂涡旋混匀后，将试管放入仪器转盘中相应的测试槽位。在加载样品前，按照所示方法，在最大有效稀释倍数范围内对测试纳米材料进行多次稀释。

为制备每毫升含0.5个内毒素单位的抑制增强对照，取25微升每毫升含1个内毒素单位的对照标准内毒素溶液，与475微升特定稀释度的待测纳米材料混合。混匀后，将相应的创新增强对照以及未加标的待测样品加入仪器中。然后，将特定稀释度的未加标及加标纳米材料分装至预先标记的试管中。

在涡旋振荡并加载到仪器转盘之前，为进行凝胶-凝块法鲎试剂（Gel-Clot LAL）试验，需将对照标准内毒素配制为终浓度为4λ，并将100微升标准品与100微升水或待测样品混合，以获得终浓度为2λ的对照标准内毒素。向每种λ稀释液中加入100微升鲎试剂（Lysine）。

短暂涡旋混匀各管，然后将试管架放入37摄氏度水浴中孵育一小时。孵育结束后，用平稳的动作倒置试管，通过目视手动记录结果：出现坚实凝块记为加号（+），无凝块或出现松散凝块记为减号（-）。在此代表性分析中，聚乙二醇化脂质体阿霉素在5倍稀释时对显色法LAL检测产生干扰，但该干扰在更高稀释度下得以消除。

在浊度法和显色法LAL试验中，当稀释倍数为50和500时，以及在浊度法LAL试验中稀释倍数为5时，加标回收率介于50%至200%之间。经稀释因子校正后，两种试验中不同稀释倍数下的结果一致。此外，三种试验方法之间的结果也具有一致性。

请记住，每个样品都有其特定的稀释梯度，每种LAL试剂盒格式在内毒素和裂解物中使用其相应的对照标准品，且用于制备稀释液及进行反应的试管在每种LAL检测中均有所不同。在本实验流程中，还可采用其他方法以回答有关材料的更多问题。该技术在开发后，为缝合技术及纳米医学领域的发展奠定了基础，推动了纳米技术在人类药物制剂中的医学应用研究，以及包括非人灵长类动物、兔子、狗和大鼠在内的临床前模型研究。请务必注意，操作内毒素可能具有极高危险性，因此在进行本实验时，必须始终采取佩戴个人防护装备等安全防护措施。