同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

该方法有助于解答脑血管生理学领域中的关键问题，特别是在衰老及慢性疾病发展过程中脑血流调节的相关研究。该技术的主要优势在于，可在生理条件下以天然状态同时测量脑动脉内皮细胞的胞内钙离子浓度和膜电位。为分离小鼠脑组织，在显微镜下移除颅骨表面的皮肤和毛发。

用冰冷的无钙PSS去除多余的血液。接下来，仅使用标准解剖剪的尖端进行切口，从枕骨开始，向上延伸至颅骨的鼻骨。

然后使用粗头镊子沿切口小心打开颅骨，分离结缔组织以暴露脑组织。将分离出的脑组织置于烧杯中，用冰冷的无钙PSS溶液轻轻冲洗，以去除血液。将脑组织腹面朝上放入含有冰冷解剖液的培养皿中，用于分离脑动脉。

为分离脑动脉，将离体脑组织置于玻璃培养皿底部的炭粉浸润硅胶聚合物涂层上，并用两枚不锈钢针穿过脑组织将其固定于冰冷的解剖液中。随后，手术分离后交通动脉和基底动脉处长约0.3至0.5厘米的后脑动脉节段。使用不锈钢针将分离出的两条后脑动脉固定在培养皿内的解剖液中。

然后使用尖端锋利的精细镊子去除结缔组织，小心清理分离出的脑后动脉。将完整的动脉切成一到两毫米长的片段，用于酶消化。在此步骤中，使用显微镜、相机以及固定有腔室和显微操作器的铝制平台，制备吹打装置。

将带有泵控制器的微量注射器固定在载物台和样本附近。接着，用矿物油完全填充滴定移液管，并将其固定在微量注射器活塞上方。然后，使用带泵控制器的微量注射器吸取约130纳升解离溶液进入移液管，同时确保无气泡存在。

随后，将完整的动脉节段放入含有规定浓度酶的一毫升消化溶液中，置于10毫升玻璃试管内。在34摄氏度下孵育10至12分钟，进行部分消化。消化完成后，用五毫升新鲜的消化溶液替换酶溶液。

使用1毫升移液器，将一段组织转移至含有解离溶液的室温孵育腔中。随后将移液器插入孵育腔内的解离溶液，并将其置于消化后血管的一端附近。在泵控制器上设置2至5纳升/秒范围内的流速，进行轻柔吹打。

在100至200倍放大镜下观察的同时，回撤并推出动脉节段，以分离平滑肌细胞并形成内皮管。如有必要，可小心使用尖头镊子将已分离的外膜和内弹性膜从内皮管上剥离。确认所有平滑肌细胞均已分离，仅剩完整的内皮细胞管。

使用显微操作器，用硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在灌流室的玻璃盖玻片上。从灌流室中冲洗掉解离的外膜和血管平滑肌细胞，并用含两倍摩尔浓度氯化钙的生理盐溶液（PSS）替换解离液。

将固定好血管内皮管的移动平台转移至灌流显微镜及实验装置上。实验过程中，使用六个洁净的50毫升储液器，用于持续输送PSS溶液及相应的药物溶液。通过串联式流量控制阀手动调节流速，使其保持稳定的层流状态，同时使进样流速与真空抽吸相匹配。

在记录背景数据和染料加载之前，先将PSS输送至灌流室，对内皮管进行至少五分钟的灌流。为了同时测量膜电位和细胞内钙离子浓度，拉制尖锐电极，并用2 mol/L氯化钾反向填充，用于记录负载了fura-2染料的细胞。为了研究通过染料转移介导的细胞内耦合，将微电极用含0.1%碘化丙啶的2 mol/L氯化钾溶液反向填充。

接下来，将电极置于固定在微操纵器上的电极夹持器内，电极夹持器中含一根涂有氯化物的银丝。使用微操纵器，在四倍物镜观察下，短暂地将电极尖端置入灌流 chamber 中流动的 PSS 液体中。随后，将静息膜电位设定为零，以与接地的浴液电位保持一致。

如有需要，可使用与静电计相连的可听基线监测器，将声音音调与电位记录相关联。随后，使用40倍物镜将放大倍数提高至400倍，并将电极尖端置于内皮管细胞正上方。利用光度测定软件调整光度测量窗口，使其聚焦于约50至80个内皮细胞。

然后使用显微操作器将电极轻柔地置入内皮管的一个细胞中，并等待至少两分钟，使静息膜电位稳定。当静息膜电位稳定在预期值时，在无光条件下打开荧光界面的光电倍增管，通过在340和380纳米波长下交替激发Fura-2，同时在510纳米波长处采集荧光发射信号，开始记录细胞内钙离子浓度。在建立膜电位与细胞内钙离子浓度的同步测量后，先以恒定的层流速率用PSS溶液灌流内皮管约五分钟，然后再施加药物。

以恒定流速将用PSS配制的药物加入灌流室。在药物处理期间，同时测量F340/F380比值中的膜电位。实验结束后，将电极从细胞中撤出。

然后停止膜电位和细胞内钙离子浓度的相应记录，并保存文件以供数据分析。此图为使用40倍物镜在光度测量窗口条件下调整的小鼠脑动脉内皮管的微分干涉差显微图像。如图顶部所示，将一根尖锐电极插入细胞内。

以下是使用100微摩尔ATP刺激后，同时检测F340/F380比值和膜电位的原始迹线示例。通过该操作步骤，还可进一步开展其他方法，例如共聚焦荧光显微镜检测，以探究内皮细胞钙信号微区以及活性氧物质等相关问题。总体而言，该技术将继续为细胞生理学研究开辟道路，以深入探索血液和淋巴循环中的血管功能及衰老机制。