Name: 新鲜分离和内联小鼠脑内皮细胞内钙和膜电位的同时测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习同时测量小鼠脑动脉内皮细胞内钙和膜电位的方法。该技术在生理条件下保留内皮管功能，帮助研究人员深入理解脑血管生理学与脑血流调节机制。

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我们感谢查尔斯·休伊特（Charles Hewitt）在建立本实验方案所需的设备和耗材过程中提供的出色技术支持。我们感谢来自LLU围产期生物学中心的肖恩·M·威尔逊博士（Drs. Sean M. Wilson）和克里斯托弗·G·威尔逊博士（Christopher G. Wilson），他们分别为我们提供了额外的倒置显微镜和电位计。本研究得到了美国国立卫生研究院基金R00-AG047198（EJB）以及洛马林达大学医学院新进教师启动资金的支持。本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

在开展以下实验之前，须确保所有动物护理、使用及操作规程均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定。 &#34;实验动物护理和使用指南&#34; (8th 版本，2011）及ARRIVE指南。洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）已批准本手稿所用所有实验方案，适用于雄性和雌性C57BL/6小鼠（年龄范围：3至30月龄）。
1. 仪器与材料
注意：本实验方案所需材料的详细信息可参见材料表、试剂部分，以及相关供应商提供的说明书或网站信息。
<ol>
	<li>灌流室
	<ol>
		<li>将底部带有玻璃盖玻片的灌流室固定在阳极氧化铝平台上，并将该平台连同灌流室一起固定到紧凑型铝制载物台上。</li>
		<li>在铝制载物台平台的两端各安装一个显微操作器，用于固定固定毛细管。 
		注意： 作为一种实用选择，可使用此可移动载物台装置，并将灌流室单元固定其上，以方便从内皮管的分离过渡到实验操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜
	<ol>
		<li>使用配备光纤光源的体视显微镜（放大倍数范围为5倍至50倍），用于大体和显微解剖操作。</li>
		<li>在制备内皮管时，使用配备相差或微分干涉差（DIC）兼容物镜（10倍、20倍和40倍）以及铝制载物台的倒置显微镜。</li>
		<li>为从部分消化的血管中分离内皮管，将微型注射泵控制器放置在内皮管制备装置旁边。</li>
		<li>对于实验装置，使用配备标准物镜（4倍和10倍）以及荧光物镜（20倍和40倍，数值孔径0.75）的倒置显微镜，并将其置于带手动铝制载物台的防震台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞内记录设备
	<ol>
		<li>为记录分离内皮管中内皮细胞的膜电位 Vm，将电位计连接至匹配的前置放大头段。如实验需要电流注入，可将函数发生器或刺激器连接至电位计。</li>
		<li>将放大器输出端连接至数据采集系统、可听基线监测器和示波器。实验期间，将参比电极（Ag/AgCl小球）固定在灌流室出口附近。</li>
		<li>使用配备荧光系统接口、高强度弧光灯及电源、高速切换器、光电倍增管（或PMT）和相机的光度测量系统，以测定内皮细胞内的[Ca2+]i水平。</li>
		<li>使用配备管路加热器的温度控制器，以在整个实验过程中升高并维持生理温度（37 °C）。</li>
		<li>使用连接六储液槽平台的阀控制器，并配备管路流量控制阀，以调控向灌流室内固定的内皮管输送的不同溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微量移液管与尖锐电极 
	注意： 为制备用于吹打及机械稳定分离内皮管的移液管，应使用电子拉制仪拉制移液管，并使用显微 forge 进行折断和火焰抛光。
	<ol>
		<li>为从部分消化的动脉节段中分离外膜、平滑肌和内皮管，根据需要使用硼硅酸盐玻璃毛细管制备吹打移液管（每根移液管尖端内径为80–120 µm），并对尖端进行火焰抛光。</li>
		<li>为将内皮管固定在灌流室底部，使用末端钝化呈球形的固定移液管（热抛光，外径100–150 µm；由薄壁硼硅酸盐玻璃管制成）。</li>
		<li>为记录内皮细胞的膜电位 Vm，使用电子拉制仪从玻璃毛细管拉制尖锐电极，使其尖端电阻约为150 ± 30 MΩ。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 溶液与药物的配制
<ol>
	<li>生理盐溶液（PSS）
	<ol>
		<li>为进行一次含药物处理的实验，至少配制1 L的PSS，其成分为：140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）和10 mM葡萄糖。</li>
		<li>为用于组织解剖、脑动脉分离及内皮管制备所需的溶液，需配制不含CaCl2的PSS（无Ca2+ PSS）。</li>
		<li>所有溶液均使用超纯去离子H2O配制，调节pH至7.4，经滤膜（孔径0.22 µm）除菌，并确保溶液渗透压在290至300 mOsm之间。 
		注意：溶液可在4 °C保存约两周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% 牛血清白蛋白（BSA）
	<ol>
		<li>配制10% BSA时，将1 g冻干粉末溶于10 mL无Ca2+ PSS中。</li>
		<li>用石蜡膜覆盖烧杯，在缓慢搅拌条件下静置数小时，使BSA充分溶解。</li>
		<li>使用10 mL注射器和0.22 µm滤器过滤最终溶液，并分装为1 mL等份，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖溶液
	<ol>
		<li>配制50 mL解剖溶液：将500 µL BSA（10%）加入49.5 mL无Ca2+ PSS中。</li>
		<li>配制后立即转移至培养皿中，用于动脉解剖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离溶液
	<ol>
		<li>配制50 mL分离溶液：向49.5 mL无Ca2+ PSS中加入5 µL CaCl2（1 M）和500 µL BSA（10%），溶液置于室温（RT）静置备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶溶液
	<ol>
		<li>为实现动脉节段的部分消化，配制1 mL消化液，含0.31 mg/mL木瓜蛋白酶、0.5 mg/mL二硫赤藓醇、0.75 mg/mL胶原酶（H型混合物）和0.13 mg/mL弹性蛋白酶。 
		注意：酶活性可能存在差异；但在本实验室成功使用的方案中，所采用的商品化酶活性如下：木瓜蛋白酶≥10单位/mg；胶原酶≥1单位/mg（以N-[3-(2-呋喃基)丙酰基]-Leu-Gly-Pro-Ala或FALGPA为底物时的转化率）；弹性蛋白酶≥5单位/mg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fura-2及药理学试剂的配制
	<ol>
		<li>将Fura-2 AM染料溶于DMSO中，配制成1 mM的储备液。使用时取5 µL储备液加入495 µL PSS中，得到10 µM的工作浓度用于负载。</li>
		<li>根据需要，在PSS中配制不少于50 mL的药理学试剂工作液（如ATP）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导电溶液
	<ol>
		<li>通过将KCl溶于去离子H2O中配制2 M KCl导电溶液（50 mL H2O中加入7.455 g KCl）。</li>
		<li>在填充尖锐电极前，使用0.22 µm注射器滤器过滤该溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碘化丙啶（0.1%）
	<ol>
		<li>将10 mg冻干碘化丙啶溶于10 mL 2 M KCl中。</li>
		<li>充分混匀后于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 大脑动脉的解剖与分离
注意：所有解剖操作均需通过体视显微镜进行标本放大（最高达50倍），并辅以光纤光源提供照明。为完成脑组织和动脉的分离解剖操作，应使用经过 sharpened 的解剖器械。用于分离和清理动脉的显微解剖工具包括尖端 sharpened 的精细镊子以及Vannas型解剖剪（刀片长度3至9.5 mm）。
<ol>
	<li>小鼠脑组织的分离
	<ol>
		<li>麻醉一只 C57BL/6 小鼠（3–30 月龄；雄性或雌性） 通过 吸入异氟烷（3%，2–3 分钟），然后在完全麻醉后立即处死动物。将头部置于含有冷（4 °C）无钙液的培养皿（直径 10 cm，深度 1.5 cm）中2+ 在体视显微镜下进行PSS。</li>
		<li>通过显微镜观察，去除颅骨表面的皮肤和毛发，并用冷的无钙溶液清除多余血液2+ PSS。使用标准解剖剪刀的尖端（例如，24 mm 刀片），从枕骨开始，沿颅骨鼻骨向上延伸，进行切口。</li>
		<li>使用粗头镊子沿切口小心打开颅骨，并分离结缔组织，以获取保留完整大脑动脉环（Circle of Willis）的脑组织。 
		注意： 或者，可使用Littauer骨剪来打开颅骨并暴露脑组织。</li>
		<li>用冷的无钙人工脑脊液轻轻冲洗分离的脑组织2+ 将PSS倒入烧杯中以去除血液。将脑腹侧朝上置于含有冷解剖液的培养皿中，用于分离脑动脉。图1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑动脉的分离 
	注意： 大脑后动脉被选为脑血管的代表性血管&#160;本方案的内皮研究模型。
	<ol>
		<li>使用不锈钢针（直径 0.2 mm，长度约 11–12 mm）将分离的脑组织固定在冰冷的解剖液中，针插入涂有炭粉掺杂硅聚合物的玻璃培养皿底部（深度 ≥50 cm）。</li>
		<li>为在解剖过程中保持PSS的低温，可使用由制冷系统持续循环1:1水-乙二醇混合物冷却的解剖 chamber。或者，也可在新鲜冰上进行解剖。</li>
		<li>使用Vannas型显微剪刀和尖端锋利的精细镊子，通过显微解剖器械从后交通动脉和基底动脉上分离出大脑后动脉（约0.3至0.5厘米的节段，避免轴向张力）图1B）。使用不锈钢针（直径 0.1 mm，长度约 13–14 mm）将两条分离的脑后动脉固定在培养皿的解剖液中（图1C).</li>
		<li>使用尖端锋利的精细镊子小心清除分离出的后脑动脉周围的结缔组织图1D）。将完整的动脉切成段（长度1–2 mm），用于酶消化（图1D；插图）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 内皮管的制备与灌流
注意：内皮管的制备方法如先前所述12，并针对脑动脉进行了修改6。
<ol>
	<li>使用配备物镜（10x、20x 和 40x）、相机以及固定有腔室和显微操作器的铝制载物台的显微镜准备匀浆装置。将带有泵控制器的微量注射器固定在载物台及样品旁（图2A）。</li>
	<li>用矿物油完全充满匀浆移液管，并将其固定在微量注射器活塞上方。然后，使用带泵控制器的微量注射器将解离液吸入移液管中（约130 nl），位于矿物油上方，同时确保移液管内无气泡。</li>
	<li>将完整的动脉节段放入盛有1 mL解离液的10 mL玻璃试管中（图2B），解离液含0.31 mg/mL木瓜蛋白酶、0.5 mg/mL二硫赤藓醇、0.75 mg/mL胶原酶和0.13 mg/mL弹性蛋白酶。在34 °C下孵育10–12分钟以进行部分消化。</li>
	<li>消化完成后，用约5 mL新鲜解离液替换酶溶液。使用1 mL移液器将一段动脉转移至含有解离液的腔室中，室温下进行操作。</li>
	<li>将移液管插入腔室中的解离液，并将其置于消化后血管的一端附近。在泵控制器上设定2至5 nL/s范围内的流速，进行轻柔匀浆（图2C；插图）。</li>
	<li>在100x至200x放大倍数下观察，反复吸入并推出动脉节段，以解离平滑肌细胞并形成内皮管。如有必要，可小心使用尖头镊子将已解离的外膜和内弹性膜从内皮管上分离。确认所有平滑肌细胞均已解离，仅剩完整的&#34;管状结构&#34;由内皮细胞组成（图2C）。</li>
	<li>使用显微操作器，借助硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在灌流腔室的玻璃盖玻片上（图2D）。</li>
	<li>冲洗腔室以去除解离的外膜和平滑肌细胞，并用含2 mM CaCl2的PSS溶液替换解离液。将固定有内皮管的可移动平台转移至灌流实验系统的显微镜载物台上。</li>
	<li>实验过程中，根据需要使用6个洁净的50 mL储液瓶（图3A）持续输送PSS及相应的药物溶液。通过串联式流量控制阀手动调节流速，确保流速稳定并符合层流条件，同时使进液流速与真空抽吸相匹配。向腔室输送PSS（图3B），对内皮管进行至少5分钟的灌流，之后再记录背景数据并进行染料加载。</li>
</ol>
5. 染料加载、洗脱及温度设置
<ol>
	<li>开启光度测量系统的全部组件，用于测量[Ca2+]i。使用实验装置上的显微镜（图3C），以400倍放大倍率观察内皮管，并利用光度测量系统软件套件对准光度测量窗口中的细胞进行聚焦。</li>
	<li>测量内皮管的直径，并在340 nm和380 nm交替激发（≥10 Hz）条件下，记录510 nm发射波长下的背景自发荧光值。</li>
	<li>为测量[Ca2+]i反应，将内皮管加载Fura-2 AM染料（终浓度为10 µM），在室温下避光孵育约30–40分钟。</li>
	<li>用新鲜的PSS重新开始对内皮管的灌流，持续约30–40分钟，以洗去多余的染料，并使细胞内的Fura-2 AM完成去酯化。在洗脱期间，使用温度控制器（图3A）配合管路加热器，将温度从室温逐步升至37 °C，随后在整个实验过程中维持在37 °C。 
	注意：建议从室温升至37 °C采用分步升温方式（例如每步5 °C），每步至少平衡5分钟。</li>
</ol>
6. 同时测量[Ca2+]i和Vm
<ol>
	<li>打开所有其他设备及用于测量 V 的静电计软件套件m （参见 图3, 图4）。相应调整数据采集速率（≥10 Hz）。</li>
	<li>拉制尖锐电极，并用2 M KCl回填。若研究通过染料传递进行的细胞间耦合，将微电极用含0.1%碘化丙啶的2 M KCl溶液回填。</li>
	<li>将电极固定在连接于电位计头部的移液管架上，电极内为涂有氯化物的银丝。通过显微操作器调节，使电极尖端短暂进入灌流 chamber 中流动的 PSS 液体，同时借助 4x 物镜进行观察。</li>
	<li>设定静息电压 Vm 调零以与接地浴电位保持一致。将电极尖端置于内皮管的一个细胞正上方。如需要，可使用连接至电位计的可听基线监测器，将声音音调与电位记录相对应。</li>
	<li>将物镜切换至40倍，使总放大倍数达到400倍，并根据需要重新调整电极尖端的位置。使用光度测定软件调节光度测量窗口，使其聚焦于约50至80个内皮细胞。</li>
	<li>使用显微操作器将电极轻轻置入内皮管的一个细胞中，并等待 ≥2 分钟以达到静息 Vm 以稳定。类似地，将第二个电极插入另一个细胞（与第一个电极穿刺的细胞距离 ≥100 µm）。</li>
	<li>静息状态后m 稳定在其预期值范围内（-30 至 -40 mV）6，关闭光源，在荧光界面打开光电倍增管（PMT），开始采集细胞内[Ca2+]i&#160;通过在510 nm处采集荧光发射信号的同时，以10 Hz的频率交替用340 nm和380 nm激发Fura-2。 
	注意： 为检测细胞间电耦合，可施加电流（± 0.5–3 nA，脉冲持续时间约 20 s） 通过 一个静电计作为 &#34;位点 1&#34;，以及V的变化m 可以用另一台静电计记录 &#34;位点 2&#34; （距离 ≥100 µm）</li>
	<li>一旦完成V的同步测量m 和 [Ca2+]i&#160;建立后，在施加药物前，以恒定的层流速率用PSS对内皮管进行约5分钟的灌流。</li>
	<li>以恒定流速将用PSS配制的药物（如ATP）加入灌流室。约3分钟后（或根据药物动力学选择适当的时间段），用PSS冲洗直至Vm 以及 F340/380 比率恢复至基线水平。在每次溶液转换过程中，标记光度计和电计软件套件中的相应记录为时间同步。</li>
	<li>实验结束后，使用显微操作器将电极从细胞中撤出，并观察Vm ~0 mV（以浴电极为参考）。停止相应的V记录m 和 [Ca2+]i 并将记录保存归档，以供数据分析。</li>
</ol>
7. 细胞间连接的可视化
<ol>
	<li>可视化细胞间偶联 通过 碘化丙啶，使用数值孔径相对较高（例如0.95）的40倍或60倍荧光物镜，配备固态照明的罗丹明滤光片组、高分辨率相机（例如1600万像素）以及成像软件套件。</li>
</ol>

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<li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intercellular+Ca2%2B+signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

鉴于近期的研究进展6,15,16,17，我们现在展示一种用于分离小鼠脑动脉内皮细胞的方法，以便在37 °C条件下持续约2小时稳定地同时测量内皮依赖性超极化（EDH）相关的细胞内钙浓度[Ca2+]i和膜电位Vm。尽管该技术操作难度较高，我们仍可同时检测细胞间的电耦联（参见文献6，图1）。通过这种方法，我们能够同时记录局部和传导性的信号事件。有关分离小鼠动脉内皮过程中所面临的一般性挑战，请参阅文献11,12。本文将重点强调分离小鼠脑动脉的关键步骤、内皮细胞[Ca2+]i与Vm测量的具体方法、常见...

脑内血流通过血管网络中脑动脉和小动脉的血管舒张协调作用进行调节1。脑阻力动脉内壁的内皮细胞可根据神经元的代谢需求，调控血管直径的变化1,2,3。特别是，在内皮依赖性超极化（通常称为EDH）过程中，内皮细胞内的细胞内Ca2+（[Ca2+]i）和电信号通过缝隙连接与周围平滑肌细胞协调，共同介导内皮细胞间的血管舒张，从而实现动脉松弛4。EDH的生理启动依次包括：Gq偶联受体（GPCRs）被激活、[Ca2+]i升高，以及内皮小电导和中电导Ca2+激活的K+通道（SKCa/IKCa）的开放，导致脑内皮细胞膜电位（Vm）超极化5,6,7。因此，内皮细胞中[Ca2+]i与Vm之间的密切关系对血流调节至关重要，是心血管和脑血管功能不可或缺的部分6,8。在更广泛的研究文献中，已有大量研究表明，血管内皮功能障碍与多种慢性疾病的发生发展相关（例如高血压、糖尿病、心力衰竭、冠状动脉疾病、慢性肾功能衰竭、外周动脉疾病）9,10，这表明研究内皮功能在生理和病理条件下的作用具有重要意义。
血管内皮在超极化、血管舒张和组织灌注的产生过程中起着关键作用，因此对其固有细胞特性的研究至关重要。作为一种通用研究模型，小鼠动脉内皮管模型已被用于骨骼肌相关研究，并已有文献报道。11,12，肠道13，肺14，以及近期针对大脑的研究6同时进行的[Ca2+]i 和 Vm 特别是骨骼肌动脉内皮的测量结果已有发表15,16 以及淋巴管内皮17除了利用内皮细胞管形成方法的原始研究外，还包括对该方法优缺点的全面综述8 可参考以确定该实验工具是否适用于特定研究。简而言之，其优势在于内皮细胞功能的关键生理组分得以保留（例如, Ca2+ 内流与细胞内释放，V 的超极化m 直至钾离子的能斯特电位+&#160;通过 SKCa/IKCa 活化，以及内皮细胞间耦联 通过 缝隙连接，且无血管周围神经输入、平滑肌电压门控通道功能与收缩性、血液流动及激素影响等混杂因素8相比之下，常用的细胞培养方法会显著改变细胞形态18 离子通道表达19 以一种可能严重妨碍与离体或在体生理学观察结果进行比较的方式。其局限性包括：缺乏与其他调节血流的关键组分（如平滑肌）的整合，以及实验时间安排上的灵活性受限，因为该模型在从动物体内分离出完整血管段后的4小时内进行测试效果最佳。
基于 Socha 和 Segal 之前发表的视频实验方案12以及期间最新的实验进展6,15,16，本文展示了从大脑后动脉中分离新鲜内皮组织，并分别利用 Fura-2 光度法和细胞内锐电极同步测量内皮细胞内 [Ca2+]i 和 Vm 的技术。此外，本实验在生理条件（pH 7.4，37 °C）下持续灌注盐溶液和药理学试剂。我们选择大脑后动脉，因其可获得结构完整（细胞通过缝隙连接相互耦合）、尺寸适宜（宽度 ≥50 µm，长度 ≥300 µm）的内皮组织，适合研究内皮细胞内部及细胞间的信号传导。此外，关于啮齿类动物大脑后动脉的研究在文献中已有广泛报道，涵盖内皮基本信号机制、血管发育/衰老及病理学等方面20,21,22。该实验方法有望实现对脑内皮功能（及功能障碍）的高通量分析，从而显著推动人们对衰老过程中血流调节机制以及神经退行性疾病发生发展的理解。

<table><tbody><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）</td><td>A466250</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶（H型混合物）</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>E7885</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 染料</td><td>美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen</td><td>F14185</td><td></td></tr><tr><td>循环冷却器（Isotemp 500LCU）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13874647</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 灌流室&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments，康涅狄格州剑桥，美国</td><td>RC-27</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片底部（2.4&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;5.0&amp;nbsp;cm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>阳极氧化铝平台（直径：7.8&amp;nbsp;cm&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>PM6 或 PH6</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型铝制载物台&amp;nbsp;</td><td>美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤</td><td>8090P</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>锡斯基尤</td><td>&amp;nbsp;MX10</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>蔡司，纽约，美国</td><td>Stemi 2000 &amp;amp; 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>&amp;nbsp;德国美因茨，肖特公司 &amp;amp; KL200，蔡司</td><td>Fostec 8375</td><td></td></tr><tr><td>尼康倒置显微镜</td><td>美国纽约州梅尔维尔，尼康仪器公司</td><td>Ts2</td><td></td></tr><tr><td>相差物镜&amp;nbsp;</td><td>尼康仪器公司</td><td>&amp;nbsp;(Ph1 DL；10X &amp;& 20X)</td><td></td></tr><tr><td>荧光物镜&amp;nbsp;</td><td>尼康仪器公司</td><td>20X（S-Fluor）和40X（Plan Fluor）</td><td></td></tr><tr><td>尼康倒置显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>显微注射泵控制器（Micro4）&amp;nbsp;</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（WPI）</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>减振台</td><td>美国马萨诸塞州皮博迪，技术制造公司</td><td>&amp;nbsp;微重力</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>Axoclamp 2B &amp;和 Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>HS-2A &amp;amp; HS-9A</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器&amp;nbsp;</td><td>EZ Digital，韩国首尔</td><td>FG-8002</td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>Digidata 1550A</td><td></td></tr><tr><td>可听基线监测器</td><td>Ampol US LLC，佛罗里达州萨拉索塔，美国</td><td>&amp;nbsp;BM-A-TM</td><td></td></tr><tr><td>数字存储示波器</td><td>Tektronix，美国俄勒冈州比弗顿</td><td>&amp;nbsp;TDS 2024B</td><td></td></tr><tr><td>荧光系统接口，ARC 灯 + 电源，Hyperswitch，PMT</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>IonOptix 系统</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>华纳仪器</td><td>TC-344B 或 C</td><td></td></tr><tr><td>内联加热器&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>阀门控制器&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td></td></tr><tr><td>内联流量控制阀</td><td>Warner Instruments</td><td>&amp;nbsp;FR-50</td><td></td></tr><tr><td>电子拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国</td><td>P-97 或 P-1000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige，美国纽约州东草地公园</td><td>&amp;nbsp;MF-900</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管（匀浆用）</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI）</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管（固定用）</td><td>Warner Instruments</td><td>G150T-6</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管（尖端电极）</td><td>Warner Instruments</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;micro;m)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>722-2520</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿 + 活性炭硅胶</td><td>美国佛蒙特州圣奥尔本斯市 Living Systems Instrumentation 公司</td><td>DD-90-S-BLK</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 型剪刀（3 mm） &amp;和 9.5&amp;nbsp;mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>555640S, 14364</td><td></td></tr><tr><td>剪刀 3 &amp;amp; 7 mm 刀片</td><td>Fine Science Tools（或 FST），美国加利福尼亚州福斯特市</td><td>Moria MC52 &amp;amp; 15000-00</td><td></td></tr><tr><td>尖头精细镊子&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>Dumont #5 &amp;amp; Dumont #55</td><td></td></tr></tbody></table>

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

脑动脉及其相应的微循环通过调节血流将氧气和营养物质输送至大脑。内皮细胞衬于血管管腔内，可根据神经元的代谢需求调控血管直径的变化。介导血管舒张并从而增加血流的内皮依赖性主要信号通路通常平行发挥作用，包括膜电位（Vm）超极化和一氧化氮通路。尽管内皮源性超极化（EDH）的组分在协调数毫米长度血管的舒张过程中至关重要，但其组分历来难以测量。EDH的这些组分包括细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i的升高以及随后小电导和中等电导的Ca2+激活K+通道（SKCa/IKCa）的激活。
本文介绍了一种简化的小鼠脑动脉新鲜内皮细胞分离方法；分别采用Fura-2光度法和细胞内锐电极技术同步测量内皮细胞内钙离子浓度 [Ca2+]i 和膜电位 Vm；并在生理条件（pH 7.4，37 °C）下持续灌流盐溶液和药理学试剂。从Willis环获取的后脑动脉需完全剔除后交通动脉和基底动脉。对清洗后的后脑动脉节段进行酶消化，随后进行吹打处理，以去除外膜、血管周围神经和平滑肌细胞。所得的后脑动脉内皮&#34;管状结构&#34;在显微镜下固定，并在持续灌流条件下，利用摄像系统、光电倍增管以及一个或两个电位计进行观察和检测。该方法可同时在特定细胞区域测量内皮细胞 [Ca2+]i 和 Vm 的动态变化，并可检测内皮源性超极化（EDH）通过缝隙连接在完整内皮层中沿血管长达毫米距离的传播过程。该方法有望实现对正常与病变脑组织中脑内皮细胞功能及其在脑血流调节机制中作用的高通量分析。

上述方案的示意图如附图所示。图中显示一只年轻成年雄性C57BL/6N小鼠（5个月大）分离出的脑组织 图1A. 仔细从威尔氏环分离出大脑后动脉，去除结缔组织后剪成若干段（图1B- D）。从部分消化的动脉节段中获取完整的内皮管，并使用固定移液管将其固定在玻璃盖玻片上。利用两个固定移液管施加轻柔的机械拉伸，以接近体内线性长度，同时避免血管扭曲。这一点已在稿件中进一步阐明。图2A- D）。从大脑后动脉分离的内皮管约为90–100 µm 宽度和≥300 µm 长度。将Fura-2 AM加入管中，随后用PSS洗脱。同时测量[Ca2+]i 和 Vm 内皮管中的钙离子活动由Ca2+ 光度法以及尖锐电极电生理学（实验装置如图所示） <strong class=...

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。

脑动脉及其相应的微循环通过调节血流将氧气和营养物质输送至大脑。内皮细胞排列于……

该方法有助于解答脑血管生理学领域中的关键问题，特别是在衰老及慢性疾病发展过程中脑血流调节的相关研究。该技术的主要优势在于，可在生理条件下以天然状态同时测量脑动脉内皮细胞的胞内钙离子浓度和膜电位。为分离小鼠脑组织，在显微镜下移除颅骨表面的皮肤和毛发。用冰冷的无钙PSS去除多余的血液。接下来，仅使用标准解剖剪的尖端进行切口，从枕骨开始，向上延伸至颅骨的鼻骨。然后使用粗头镊子沿切口小心打开颅骨，分离结缔组织以暴露脑组织。将分离出的脑组织置于烧杯中，用冰冷的无钙PSS溶液轻轻冲洗，以去除血液。将脑组织腹面朝上放入含有冰冷解剖液的培养皿中，用于分离脑动脉。为分离脑动脉，将离体脑组织置于玻璃培养皿底部的炭粉浸润硅胶聚合物涂层上，并用两枚不锈钢针穿过脑组织将其固定于冰冷的解剖液中。随后，手术分离后交通动脉和基底动脉处长约0.3至0.5厘米的后脑动脉节段。使用不锈钢针将分离出的两条后脑动脉固定在培养皿内的解剖液中。然后使用尖端锋利的精细镊子去除结缔组织，小心清理分离出的脑后动脉。将完整的动脉切成一到两毫米长的片段，用于酶消化。在此步骤中，使用显微镜、相机以及固定有腔室和显微操作器的铝制平台，制备吹打装置。将带有泵控制器的微量注射器固定在载物台和样本附近。接着，用矿物油完全填充滴定移液管，并将其固定在微量注射器活塞上方。然后，使用带泵控制器的微量注射器吸取约130纳升解离溶液进入移液管，同时确保无气泡存在。随后，将完整的动脉节段放入含有规定浓度酶的一毫升消化溶液中，置于10毫升玻璃试管内。在34摄氏度下孵育10至12分钟，进行部分消化。消化完成后，用五毫升新鲜的消化溶液替换酶溶液。使用1毫升移液器，将一段组织转移至含有解离溶液的室温孵育腔中。随后将移液器插入孵育腔内的解离溶液，并将其置于消化后血管的一端附近。在泵控制器上设置2至5纳升/秒范围内的流速，进行轻柔吹打。 在100至200倍放大镜下观察的同时，回撤并推出动脉节段，以分离平滑肌细胞并形成内皮管。如有必要，可小心使用尖头镊子将已分离的外膜和内弹性膜从内皮管上剥离。确认所有平滑肌细胞均已分离，仅剩完整的内皮细胞管。 使用显微操作器，用硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在灌流室的玻璃盖玻片上。从灌流室中冲洗掉解离的外膜和血管平滑肌细胞，并用含两倍摩尔浓度氯化钙的生理盐溶液（PSS）替换解离液。将固定好血管内皮管的移动平台转移至灌流显微镜及实验装置上。实验过程中，使用六个洁净的50毫升储液器，用于持续输送PSS溶液及相应的药物溶液。通过串联式流量控制阀手动调节流速，使其保持稳定的层流状态，同时使进样流速与真空抽吸相匹配。在记录背景数据和染料加载之前，先将PSS输送至灌流室，对内皮管进行至少五分钟的灌流。为了同时测量膜电位和细胞内钙离子浓度，拉制尖锐电极，并用2 mol/L氯化钾反向填充，用于记录负载了fura-2染料的细胞。为了研究通过染料转移介导的细胞内耦合，将微电极用含0.1%碘化丙啶的2 mol/L氯化钾溶液反向填充。接下来，将电极置于固定在微操纵器上的电极夹持器内，电极夹持器中含一根涂有氯化物的银丝。使用微操纵器，在四倍物镜观察下，短暂地将电极尖端置入灌流 chamber 中流动的 PSS 液体中。随后，将静息膜电位设定为零，以与接地的浴液电位保持一致。如有需要，可使用与静电计相连的可听基线监测器，将声音音调与电位记录相关联。随后，使用40倍物镜将放大倍数提高至400倍，并将电极尖端置于内皮管细胞正上方。利用光度测定软件调整光度测量窗口，使其聚焦于约50至80个内皮细胞。然后使用显微操作器将电极轻柔地置入内皮管的一个细胞中，并等待至少两分钟，使静息膜电位稳定。当静息膜电位稳定在预期值时，在无光条件下打开荧光界面的光电倍增管，通过在340和380纳米波长下交替激发Fura-2，同时在510纳米波长处采集荧光发射信号，开始记录细胞内钙离子浓度。在建立膜电位与细胞内钙离子浓度的同步测量后，先以恒定的层流速率用PSS溶液灌流内皮管约五分钟，然后再施加药物。以恒定流速将用PSS配制的药物加入灌流室。在药物处理期间，同时测量F340/F380比值中的膜电位。实验结束后，将电极从细胞中撤出。然后停止膜电位和细胞内钙离子浓度的相应记录，并保存文件以供数据分析。此图为使用40倍物镜在光度测量窗口条件下调整的小鼠脑动脉内皮管的微分干涉差显微图像。如图顶部所示，将一根尖锐电极插入细胞内。以下是使用100微摩尔ATP刺激后，同时检测F340/F380比值和膜电位的原始迹线示例。通过该操作步骤，还可进一步开展其他方法，例如共聚焦荧光显微镜检测，以探究内皮细胞钙信号微区以及活性氧物质等相关问题。总体而言，该技术将继续为细胞生理学研究开辟道路，以深入探索血液和淋巴循环中的血管功能及衰老机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

新鲜分离和内联小鼠脑内皮细胞内钙和膜电位的同时测量

我们介绍了如何利用全内反射显微镜和落射荧光显微镜，在培养的星形胶质细胞中检测近膜区和全细胞内的钙离子动态变化。...

测量星形胶质细胞中近质膜及全细胞内钙动力学

本文详细介绍了在完整分离的Langendorff灌注小鼠心脏中进行跨膜电位（Vm）和细胞内钙瞬变（CaT）光学标测时的解剖操作、仪器设置及实验条件。...

小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

该视频展示了小鼠脑动脉段内皮细胞中细胞内钙水平和膜电位变化的同步测量。分离的内皮管被加载荧光钙指示剂，并用一种诱导细胞内钙释放的药物处理，从而引起膜电位的变化。通过该指示剂的荧光可测量钙水平，同时将记录电极插入细胞以测量膜电位的变化。...

小鼠脑血管内皮细胞中细胞内钙离子与膜电位的同步测量

来源：Hakim, M. A. 等，小鼠脑实质微动脉内皮的分离与功能分析。J. Vis. Exp.

小鼠微动脉内皮中钙动力学与膜电位变化的分析

本文描述了同时记录膜电位或电流以及细胞内钙离子浓度变化的方法。通过全细胞膜片钳配置的膜片钳电极，将钙离子指示剂bis-fura-2导入视交叉上核神经元中。...

同时记录视交叉上核神经元的电生理活动与钙成像

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。...

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。...

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。...

转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

本文展示了从小鼠脑实质小动脉中大量制备完整脑微血管内皮"管状结构"的方法，用于研究脑血流调节机制。此外，我们还阐述了该内皮细胞研究模型在荧光成像和电生理学检测中的实验优势，可应用于关键细胞信号通路的分析，包括细胞内[Ca2+]浓度变化和膜电位变化。...

小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

学习同时测量小鼠脑动脉内皮细胞内钙和膜电位的方法。该技术在生理条件下保留内皮管功能，帮助研究人员深入理解脑血管生理学与脑血流调节机制。

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

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