Name: 密度梯度离心法测定微分品质的精子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 28 s
Description: 学习密度梯度离心法分离不同品质精子，用于研究生理特性与生育力生物标志物。该技术可高效区分高、中、低质量精子层，适用于精子生理学及生育研究。

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本文所述所有方法均已获得佐治亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 使用传统离心法进行洗涤
<ol>
	<li>配制磷酸盐缓冲液（PBS）。在800 mL去离子水（dH2O）中加入8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和0.24 g KH2PO4。用0.1 N HCl将pH值调节至7.4，并用dH2O定容至1 L。</li>
	<li>配制运动缓冲液。在800 mL去离子水（dH2O）中加入6.5 g NaCl、4.5 g葡萄糖、0.444 g CaCl2 和11.5 g N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸（TES）。用1 M NaOH将pH值调节至7.4，并用dH2O定容至1 L。</li>
	<li>用移液器将0.5 mL精液转移至聚丙烯微量离心管中。加入1.0 mL PBS，轻轻混匀。</li>
	<li>在室温（RT）下以1,500 × g离心10分钟，弃去上清液。用PBS将精子沉淀重悬至1.5 mL。</li>
	<li>在室温（RT）下以1,500 × g离心10分钟。用运动缓冲液将精子沉淀重悬至0.5 mL。</li>
</ol>
2. 执行 PDGC 技术
注意：PDGC 的整个过程均在室温下进行。
<ol>
	<li>在两个独立的离心管中分别配制3.0 mL密度为1.08 g/mL和1.07 g/mL的Percoll溶液。
	<ol>
		<li>在一支洁净的试管中，加入1.712 mL的1.13 g/mL原始Percoll溶液和0.3 mL的1.5 M NaCl溶液，再加入0.988 mL的dH2O，通过轻柔倒置混匀，得到3.0 mL密度为1.08 g/mL的溶液。</li>
		<li>在另一支洁净的试管中，加入1.482 mL的1.13 g/mL原始Percoll溶液和0.3 mL的1.5 M NaCl溶液，再加入1.218 mL的dH2O，通过轻柔倒置混匀，得到3.0 mL密度为1.07 g/mL的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在一支洁净的试管中，将1.0 mL精液样本用2.0 mL PBS按1:2比例稀释，通过移液操作轻柔混匀。</li>
	<li>将3.0 mL密度为1.07 g/mL的溶液移入一支无菌的15 mL锥形离心管中。小心地将3.0 mL密度为1.08 g/mL的溶液沿管壁缓慢加入至1.07 g/mL溶液下方，确保两层溶液不混合。使用长型（9英寸）巴斯德移液管可使此步骤更易操作。</li>
	<li>将3.0 mL稀释后的精液样本小心地叠加在PDG（Percoll密度梯度）上方。为防止精液样本与PDG混合，将含有PDG的锥形管轻轻倾斜至45°角，沿管壁缓慢加入样本，使其自然流下并覆盖在PDG上层。</li>
	<li>准备一支空白管，使其质量与叠加样本后的PDG管相匹配。将两支管在1500 × g条件下离心20分钟。在将离心管从实验台转移至天平，再转移至离心机的过程中，需小心保持不连续梯度的完整性。 
	注意：离心结束时切勿使用刹车功能。</li>
	<li>观察结果，确认离心管中已形成三个清晰的精液层，如图1所示。</li>
	<li>用移液器吸取分离后的精液各层。首先收集最上层，其次为中间层，最后收集管底的致密沉淀。将每层分别转移至洁净无菌的聚丙烯微量离心管中。</li>
	<li>每份样本用PBS稀释至1.5 mL，于1500 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，通过轻柔移液操作用运动缓冲液重悬精子沉淀。 
	注意：可根据研究者需求调整密度梯度。可通过以下公式计算所需试剂用量，其中v0为所用储备密度溶液的体积，v为所需终体积，p为所需终密度溶液的密度，p0为储备密度溶液的密度： 
	<img alt="速度计算公式，包含参数p和p₀，用于科学公式语境。" src="/files/ftp_upload/58833/58833eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"> 
	配制密度溶液时始终加入0.3 mL的1.5 M NaCl，以使NaCl浓度与生理盐水一致。</li>
</ol>
3. 确定精子质量
<ol>
	<li>按照先前所述方法计算精子浓度22。</li>
	<li>按照先前所述方法进行伊红-尼格罗辛活体染色12，并作如下修改：
	<ol>
		<li>制备 100 µL 精子悬液，浓度为 1 × 108 个细胞/mL。</li>
		<li>用移液器将 50 µL 精子悬液加入含等体积伊红-尼格罗辛染液的聚丙烯微量离心管中。室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>取 20 µL 染色后的精子样品滴于载玻片一端，均匀涂片，方法类似于血涂片制备。涂片后于室温下空气中干燥 3–5 分钟。</li>
		<li>在显微镜下观察涂片，计数活精子（无着色）和死精子（呈粉红色着色）的数量，并计算活精子百分率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用先前已验证适用于鸡精子的 Accudenz 检测法，以客观评估精子运动能力8，并作如下修改：
	<ol>
		<li>将 1.0 mL 6% 检测液加入聚苯乙烯比色皿中，如图 2所示。将检测液预热至 41 °C。 
		注意：使用 41 °C 是为了模拟母鸡体内的生理温度。孵育温度应与所研究物种雌性生殖道的温度相匹配。</li>
		<li>在预热的检测液上层覆盖 100 µL 精液样品，浓度为 5 × 108 个细胞/mL。</li>
		<li>将含有分层精子样品的比色皿放入分光光度计中，在 550 nm 处记录吸光度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前所述方法进行 IPVL 穿透试验11，并作如下修改：
	<ol>
		<li>从完整的 IPVL 非胚盘区域切取一块大小为 0.5 cm × 0.5 cm 的组织片。</li>
		<li>将精子浓度调整至 4 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>将精子与 IPVL 组织片在小型玻璃小瓶中加入运动缓冲液，于 37 °C 孵育 15 分钟，如图 3所示。</li>
		<li>将 IPVL 组织片浸入 3% NaCl 溶液中，以终止 IPVL 与精子之间的相互作用。</li>
		<li>将 IPVL 组织片固定于载玻片上，先用 10% 甲醛固定 20 秒，再用希夫试剂染色 10 分钟。</li>
		<li>在显微镜下观察 IPVL 组织片，识别精子成功穿透形成的孔洞，并在 40 倍放大下计数每 0.25 mm2 区域内所有可见孔洞的数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生育力不仅决定动物生产的盈利能力，同时也是物种通过自然选择实现存续的手段。精子细胞的最终功能是使卵子受精。雌性输卵管仅选择最适配的精子，以确保卵子成功受精23,24。体外研究也揭示了精子质量特征与受精成功率之间存在密切关联4,11,23,24。生育力下降与精子质量低下相关4,11,25。因此，有必要对精液进行处理以改善精子质量。在辅助生殖技术（ART）中，已应用PDGC方法筛选高质量精子，以提高人类及重要农业动物的生育能力13</...

在脊椎动物中，雄性配子会经历强烈的选择压力；因此，雄性的生殖适应性对于成功受精至关重要。任何特定脊椎动物物种的雄性都必须能够大量产生足够质量的精子细胞，以满足受精需求。精子细胞具有头部和鞭毛，是体内极性最强的细胞。它们在精子质量上也表现出高度异质性（包括活精子与死精子、形态正常与异常精子，以及不动、低速运动和高速运动的精子），这种异质性体现在不同雄性个体间生殖效率的巨大差异上。高质量精子所占比例越大，成功使卵子受精所需的交配次数就越少。然而，为了实现受精，形态正常的精子细胞依赖其鞭毛产生的推进力，以到达受精部位，并在自然交配或人工授精（AI）后穿透卵子的透明带1（ZP；哺乳动物的情况）或卵周内层2（IPVL；鸟类和爬行动物的情况）。确定精子质量对于辅助生殖技术3（ART）的应用以及人工授精项目中种用雄性的选择至关重要4。另一方面，辅助生殖技术的成功完全依赖于对精子质量的准确评估。目前已开发出多种实验室检测方法，用于测定精子的功能特性。其中最重要的参数包括精子形态、活力、运动能力、获能（禽类精子无需获能5）、顶体反应（AR；精子头部顶体发生外排并释放蛋白水解酶）、精子对透明带或卵周内层的穿透能力，以及受精能力6,7,8,9,10,11。仅通过生育力的测量无法准确评估一群精子的受精能力11。对受精前多个关键事件的检测，能够更恰当地反映单个精细胞的功能表现7。
用于评估精子功能的方法主要是物种特异性的。例如，在禽类精子中，活力、运动能力以及对卵黄膜内层（IPVL）的穿透能力是最常用于评估精子质量的参数8,11,12。射精液中活精子的数量对精子的存活至关重要，因为精液中存在大量死精子会影响精子质量，从而增强精液中活性氧（ROS）的产生，导致活精子发生氧化损伤13。精子运动能力是指禽类精子在体温条件下克服阻力进行鞭毛运动的能力，已知其在实现受精过程中起直接作用8。已有充分证据表明，精子运动能力与受精力呈正相关，因此是决定受精力的主要因素之一8。然而，具有运动能力的精子还必须具备发生顶体反应（AR）并穿透卵黄膜内层（IPVL）的能力11。IPVL 穿透实验能够全面评估每一个参与受精过程的精子11。
在辅助生殖技术（ART）的应用中，通常需要对精液进行处理，以最大化高质量精子的浓度，同时最小化低质量精子的浓度。在精液采集后，可通过工业和科研实践中常用的精子分离方法，提高高质量精子所占的比例。目前已开发出多种此类方法，各有其优势与局限性，但均利用了精子群体的异质性，以筛选出受精能力较强的精子。这些方法包括精子迁移法、黏附柱过滤法以及密度梯度离心法（DGC）14,15,16,17,18,19,20。在现有技术中，DGC被证明是一种非常简单、可重复、成本效益高且高效的方法，能够分离出最大数量的高质量精子，用于辅助生殖技术，以期最大化受精成功率14,15。此外，DGC对精子细胞膜无损伤作用。相比之下，精子迁移法仅能收集具有前向运动能力的精子18,19，但所获精子数量极少，导致在需要大量精子时效率较低18,20。黏附柱过滤法在从精液中筛选高活动力精子方面效率较高17；然而，该方法往往会对精子膜造成损伤20,21。
在密度梯度离心（DGC）技术中，最常用的生成密度梯度的基质是Percoll，其由涂覆有聚乙烯吡咯烷酮的胶体二氧化硅颗粒组成。Percoll密度梯度离心（PDGC）可以是连续的或不连续的，但不连续梯度最常用于高得率地分离高活动力精子13,16,20。在不连续梯度中，低密度介质浮于高密度介质之上，形成从锥形管顶部到底部密度逐渐增加的梯度，从而在两种不同密度介质的界面处形成分界区域。PDGC的分离效率来源于两个因素：1）单个精子细胞的推进能力；2）结构完整性良好的精子细胞往往具有更高的密度。活动力较高的精子更能够穿过低密度介质并进入高密度介质中，而活动力较低的精子则更可能被困在不同密度介质界面所形成的边界处。结构完整性高且活动力强的精子通常比死亡、形态异常或活动力低的精子具有更高的密度。当在PDGC中施加离心力时，可促使不同密度的精子迁移至其在梯度中的相应位置。
在常规操作中，完成PDGC后，收集锥形管底部具有高生育潜能的柔软精子沉淀，其余部分则弃去。然而，该技术一个尚未充分利用的优势在于能够根据精子质量的差异将其分离为多个群体。出于研究目的，利用PDGC技术按质量程度分离精子，可便于研究精子质量与其生理学、代谢组学及蛋白质组学差异之间的关系。本文旨在详细说明如何利用该技术按质量分离精子，并通过已建立的伊红-尼格罗辛活体染色法评估精子活力、Accudenz分析法检测精子运动能力，以及精子-IPVL相互作用分析法评估精子穿透能力，来展示这些质量上的差异。

<table><tbody><tr><td>Accudenz</td><td>美国纽约州韦斯特伯里，精确化学与科学公司</td><td>AN7050</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>P7828</td><td></td></tr><tr><td>希夫&amp;rsquo;试剂 s</td><td>Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>尼格罗辛</td><td>Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>198285</td><td></td></tr><tr><td>ST 40R 离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>DU 530 生命科学紫外/可见分光光度计</td><td>Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布雷亚</td><td></td><td>未找到目录</td></tr><tr><td>奥林巴斯IX71倒置荧光与相差显微镜</td><td>Olympus America Inc.，宾夕法尼亚州，美国</td><td></td><td>未找到目录</td></tr></tbody></table>

利用密度梯度离心法收集不同质量的精子

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

在有性生殖过程中，雄性配子或精子细胞与雌性配子融合，从而实现受精。然而，需要大量具有受精能力的精子细胞与雌性配子相互作用，才能确保受精成功。因此，单个精子细胞的受精能力对于成功繁殖至关重要。多年来，密度梯度离心法一直被用作一种可重复、快速、高效、有效且高度可调的方法，用于在辅助生殖技术中仅收集高质量的精子。本文所述方案重点介绍利用不连续 Percoll 密度梯度离心法（PDGC）按质量分离公鸡精子的三种不同群体。我们能够收集到低、中和高质量的精子。我们还描述了可重复的实验方案，通过评估精子的存活率、运动能力和穿透能力来确定其受精潜力。利用 PDGC 技术按质量分离精子，将有助于准确而全面地表征具有不同受精潜力的精子。

PDGC 技术在所有参数中均实现了按精子质量程度的三层明显分离。精子分为高质量层、中等质量层和低质量层：高质量层位于高密度溶液下方，中等质量层位于高密度与低密度溶液之间，低质量层位于低密度溶液上方。这些质量差异通过活力的显著差异得以证实（图4），迁移率（图5）和穿透性（图6经PDG法分离后，高质量层中获取的精子在全部三项参数上均较传统洗涤法处理的样本有所提升。而PDGC分离后标记为中等和低质量的层次，其各项检测参数则分别呈现中等程度和显著下降。
<img alt="通过离心法分离精液质量；密度梯度层前后的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58833/58833fig1.jpg" data-altupdatedat="17...

本文旨在描述密度梯度离心技术的操作方法及其在精子生理学研究中的应用。

在有性生殖中，一个雄性配子或精子细胞与一个雌性配子融合，从而实现受精。然而，大量具有……的精子细胞

该方法有助于解答精子生理学领域中的关键问题，例如精子质量的化学决定因素。该技术的主要优势在于能够根据质量分离大量样本，并且与替代方法相比具有更高的适应性。尽管该方法可用于揭示精子质量的差异，还可应用于其他样本，如具有不同密度的混合细胞类型或亚细胞组分。首先，在两个独立的试管中分别配制两份3毫升的Percoll稀释液。在一个洁净的试管中，将1毫升精液样本与2毫升PBS混合。轻轻吹打以混匀溶液。向无菌锥形管中加入3毫升低密度Percoll溶液。然后，小心地将3毫升高密度Percoll溶液移至低密度Percoll溶液下方。将锥形管倾斜约45度角，将3毫升稀释后的精液样本轻轻加在Percoll密度梯度的上层。在准备空白管后，将两支管在1500 G下离心20分钟。确保离心后管内形成三层清晰的精液层。使用移液器收集精液的三层成分，先从上层开始，接着收集中层，最后收集管底的硬沉淀。将各层转移至无菌的微量离心管中。每份精液样本加入1.5毫升PBS稀释，然后在1500 ×g 条件下离心10分钟。最后，弃去上清液，并用运动缓冲液重悬沉淀。在本实验方案中，采用 Percoll 密度梯度离心技术（PDGC）将精液样本分离为三个不同的层次。精子会分布于高密度溶液下方的高质量层、高低密度溶液之间的中等质量层，以及低密度溶液上方的低质量层。精子质量的差异体现在其存活率、运动能力及穿透能力的不同。进行该操作时，需注意将样品恢复至室温。PDGC 技术的成功依赖于梯度的精确制备以及对分离层的小心收集。该技术建立后，为我们在鸟类精子蛋白质组学领域探索生育力生物标志物的研究奠定了基础。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

密度梯度离心法测定微分品质的精子

本文介绍了一种从小鼠睾丸中高效获取高纯度且具有活性的减数分裂细胞组分的方法，该方法结合了优化的细胞解离方案与荧光激活细胞分选技术（FACS）。此方法利用了不同减数分裂阶段细胞在DNA含量和细胞核密度上的差异。...

流式细胞术纯化小鼠减数分裂细胞

本视频介绍了从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的技术。通过本方案，我们将从人类患者血液样本中分离CLL细胞，用于后续高效制备细胞核和细胞质组分。...

密度梯度离心法：从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病细胞的方法

利用STA-PUT沉降速度法分离精原细胞类型

我们描述了一种利用流式细胞术对小鼠精子细胞进行分选的策略。精子细胞被分为四个高纯度的群体，包括圆形精子细胞（精子形成阶段1-9）、早期伸长精子细胞（精子形成阶段10-12）、晚期伸长精子细胞（精子形成阶段13-14）以及伸长型精子细胞（精子形成阶段15-16）。分选依据包括DNA染色、细胞大小和颗粒度。...

通过流式细胞术对小鼠精子细胞进行分步分选

本研究描述了一种从不同哺乳动物物种的睾丸组织中获取纯化生殖细胞群体的方法的标准化流程。该方法是一种简便的实验方案，结合了睾丸组织的机械解离、Hoechst-33342和碘化丙啶染色以及荧光激活细胞分选（FACS），在雄性生殖生物学的比较研究中具有广泛的应用价值。...

通过机械组织解离与流式细胞术对多种哺乳动物雄性生殖细胞进行标准化纯化的方法

我们展示了利用不连续密度梯度根据细菌荚膜产生情况分离细菌群体的方法。该方法可用于比较不同培养物之间的荚膜含量、分离具有特定荚膜表型的突变株，或鉴定荚膜调控因子。本文描述了该检测方法的优化及操作流程。...

利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌

本文介绍了一种利用不连续的牛血清白蛋白密度梯度，结合常规实验室设备，从成年小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞、圆形精子细胞和伸长中的精子细胞的实验方案。...

利用常规实验室设备从小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞和精子细胞

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过...

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

本方案描述了一种利用精子运动特性和触壁性筛选DNA片段化指数较低的高质量精子的方法。该方法采用U形水平泳道，使高质量精子能够穿过缓冲液滴到达对侧，而死精子、细胞碎片和杂质则被排除在外。...

U型水平泳动法用于制备低DNA碎片化指数的高质量精子

变性梯度凝胶电泳（DGGE）

学习密度梯度离心法分离不同品质精子，用于研究生理特性与生育力生物标志物。该技术可高效区分高、中、低质量精子层，适用于精子生理学及生育研究。

利用密度梯度离心法收集不同质量的精子

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