Name: 在体外显示砷对皮肤细胞迁移影响的划痕测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习使用划痕实验评估砷对皮肤细胞迁移的影响，建立体外伤口愈合物模型。该方法为研究环境污染物对细胞行为的早期影响提供了可靠工具。

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本研究由美国国立卫生研究院少数族裔健康与健康差异研究所根据资助编号U54MD012388资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

<ol><li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+an+overview+of+acute%2C+fibrotic+and+delayed+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+BioScience%22%5BJournal%5D)">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li>
<li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li>
<li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMichelson%2C+A+%22Platelets%22">Platelets</a>. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).</li>
<li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+rabbit+platelets+and+leukocytes+in+the+release+of+histamine.+Electron+microscopic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li>
<li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li>
<li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li>
<li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+In+Vitro+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li>
<li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+%28PRP%29+promotes+fetal+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+migration+and+wound+healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li>
<li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li>
<li>Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+aspects+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+Brasileiros+de+Dermatologia%22%5BJournal%5D)">Cellular aspects of wound healing.</a> Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).</li>
<li>Beem, E., Segal, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+stability+and+sensitivity+of+cell+fluorescent+labels+when+used+for+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration.</a> Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).</li>
<li>Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+recent+advances+in+research+on+arsenic+cancer+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).</li>
<li>Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+children%27s+urinary+CC16+levels+with+arsenic+concentrations+in+multiple+environmental+media%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health.pii%3A+E521.2016%3A13%22%5BJournal%5D)">Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).</li>
<li>Robertson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+in+ground-water+under+oxidizing+conditions%2C+southwest+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Geochemistry+and+Health%22%5BJournal%5D)">Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States.</a> Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).</li>
<li>Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Groundwater+arsenic+in+the+Verde+Valley+in+central+Arizona%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA.</a> Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).</li>
<li>Uhlman, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUhlman%2C+K+%22Arsenic+in+Arizona+Ground+Water%3A+Source+and+Transport+Characteristics%22">Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics</a>. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).</li>
<li>Agusa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exposure+to+arsenic+from+drinking+water+in+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam.</a> Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).</li>
<li>Ayotte, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+temporal+variability+of+arsenic+in+groundwater+used+for+drinking+water+supply+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li>
<li>Dummer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geostatistical+modeling+of+arsenic+in+drinking+water+wells+and+related+toenail+arsenic+concentrations+across+Nova+Scotia%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li>
<li>Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+species+in+drinking+water+wells+in+the+USA+with+high+arsenic+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations.</a> Water Research. 48, 156-169 (2014).</li>
<li>Beamer, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Children%27s+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li>
<li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li>
<li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li>
<li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li>
<li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).</li>
<li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该检测方法可对细胞迁移进行高通量且及时的评估，并可直接应用于复杂的生理系统5,6,7因此，所提出的台式模型经过优化和实践，可用于评估各种治疗剂和环境毒素对伤口愈合的影响6本研究中所用的砷浓度是通过广泛查阅已知暴露水平的相关文献以及对多个数据库进行回顾性分析后确定为具有环境相关性的。14,15,16,17,18,19,20,21. 本方法的使用 体外 划痕实验表明，暴露于较高但环境相关浓度的砷会延缓伤口闭合（细胞迁移）。
该台式模型还被用于分离和研究单个细胞系（成纤维细胞），以进一步了解成纤维细胞迁移如何影响伤口愈合的结果。此外，在复杂的in vivo系统中，由于存在许多其他细胞和组织，可能干扰分析，因此很难研究单个细胞系的功能。另外，该检测方法可提供半定量的伤口闭合百分比数据，可用于靶向特定的细胞机制，从而揭示化合物如何影响伤口愈合过程。例如，划痕实验中使用的细胞可被收集并储存在合适的试剂中，用于基因表达（信号mRNA）或蛋白质表达检测22。如果研究者希望了解在不同处理条件（i.e., 砷）下，哪些信号或蛋白质可能在很大程度上影响细胞迁移的变化，这些信息将非常有用22。
本研究选择人新生儿真皮成纤维细胞，因其在伤口愈合过程中具有重要作用。然而，该划痕实验方案已应用于多种细胞类型及不同研究目的。例如，划痕实验已被用于肿瘤学领域，以研究化疗药物对细胞迁移的抑制作用23；用于骨骼肌细胞的迁移、增殖和扩散研究24；用于评估植物提取物对细胞迁移的影响25；以及用于理解角质形成细胞的迁移和增殖在伤口愈合中的作用9。此外，Pinto et al. 之前的一项研究利用划痕实验评估了铀（U）和富血小板血浆（PRP）对hDFn细胞迁移的影响6。本研究的目的是明确该实验在多大程度上可用于检测被认为可减缓细胞迁移的物质（U）以及被认为可加速细胞迁移的物质（PRP）的作用效果。如上述研究及其他研究者的工作所示，划痕实验在多种实验模型中具有广泛的应用潜力26。尽管方法部分提供了详细说明，但在不同研究者和实验之间仍可能出现差异。例如，细胞迁移速率可能会因所使用的细胞系以及特定细胞类型所需的微量营养素不同而有所波动。本方案中列出了多项有助于提高细胞产量和存活率的重要注意事项（NOTEs）。然而，强烈建议研究者遵循试剂制造商提供的最佳生长条件建议，并将本方法作为常规细胞培养工作的补充指导。
尽管划痕实验在研究细胞活性方面具有极高的多功能性，但在测量技术中可能产生意想不到的偏差。例如，使用 ImageJ 手动追踪细胞迁移前沿时，不同操作者之间可能存在差异，从而限制数据的准确性和代表性。还应注意，为尽量减少操作者偏倚，迁移前沿的读取应采用盲法评估。此外，由于细胞可形成伪足并伸出以建立黏着斑，手动识别迁移前沿可能导致平均迁移距离的误算，造成视觉上的误导。同理，使用荧光标记 &#34;细胞示踪剂&#34; 细胞表面或核蛋白的染色在检测迁移时可能意外导致细胞固定，从而在随时间测量细胞迁移时产生不准确结果。建议在实验中纳入适当的阳性对照和/或阴性对照，以全面评估处理因素对细胞系的影响。进行该检测时必须充分认识其局限性。该检测不能确保所获得的细胞迁移结果能够完全反映 体外 实验将直接转化为 体内 结果. 在复杂的生物系统中，伤口愈合与细胞迁移涉及多种细胞类型和分子信号，每一种都有可能影响愈合反应。
综上所述，划痕实验已被证实可用于在环境变化条件下对细胞迁移进行高通量筛选6,25。我们特别采用该实验方案，成功检测了在不同环境相关剂量的砷暴露下细胞迁移发生的变化。这些数据为进一步采用划痕实验研究细胞迁移的分子机制及其在砷暴露下的改变提供了依据。

伤口愈合是一个复杂的过程，包含一系列相互重叠的步骤，涉及多种细胞类型、信号分子以及细胞外基质成分1。这些成分协同作用，实现伤口的消退或修复，最终根据创伤程度形成具有保护作用的纤维化瘢痕1。在单个实验中同时捕捉伤口愈合的所有独立过程和功能十分困难，因此需要分别识别并检测愈合过程中的各个独立步骤。在伤口愈合的诸多步骤中，细胞迁移过程在评估愈合速率时被认为至关重要2。细胞迁移存在于伤口愈合的各个阶段，因此有必要进一步了解细胞迁移的改变如何影响伤口闭合。例如，在炎症的早期和晚期阶段均可观察到细胞迁移，表现为伤口部位的血液凝固和血小板聚集3。这些事件通过形成暂时性阻塞，填充无组织区域，从而防止过度失血3。循环中的血小板会合成并分泌血管活性介质以及趋化因子，共同诱导炎性白细胞（白细胞）向受损组织迁移，以促进修复4。组织损伤后数小时内即发生再上皮化，此过程涉及上皮角质形成细胞的活动与迁移，覆盖伤口部位，防止外来颗粒进一步污染或侵入伤口2。上述例子仅涵盖了与伤口愈合相关的众多细胞迁移功能中的一部分。
划痕实验已被描述并用于深入理解细胞迁移及其在伤口愈合中的多种作用5,6该实验方法被认为较为简单，具有高通量特点，可使研究者获得具有代表性的细胞迁移数据。迁移实验已成功证明，某些化合物可能加速或减缓细胞迁移速率。6此外，这些检测结果可提供具有转化意义的生理学信息，可用于在制定靶向治疗方案、给药浓度以及筛选目标基因之前 体内 实验需要基本的细胞培养技术与耗材、一种选定的细胞系，以及成像技术以随时间记录细胞运动或对处理刺激的运动反应。
该检测方法可轻松进行调整或定制，以满足研究者的需求。然而，在开展实验之前，需考虑四个基本问题。研究者试图回答哪些一般性或特定性问题？这一点适用于大多数以假设为导向的研究；但对该检测尤为重要，因为这将决定准确且完整回答问题所需的诸多参数。应选用何种细胞系（若涉及多个，则为哪些细胞系）来代表所研究的生理系统？例如，在皮肤伤口愈合研究中，可使用真皮成纤维细胞5,6,7干细胞8，或表皮角质形成细胞9 可能代表在皮肤组织中通常大量存在的细胞群体10或者，可在此系统中评估中性粒细胞、巨噬细胞或其他炎症细胞，以代表皮肤组织中伤口愈合其他组分的细胞迁移。10此外，明确待评估的特定细胞系将有助于确定使用何种试剂最有利于促进细胞代谢活性。细胞迁移将如何追踪或成像？目前有多种技术可用于观察培养板或培养瓶中的细胞迁移。例如，对细胞进行染色或荧光标记，并利用荧光显微成像或共聚焦成像来追踪细胞，可提供较强的对比度，使研究者能够清晰界定细胞 与 非细胞定位与细胞运动11另一种在本研究中描述的常用技术是使用带有相差功能的倒置光学显微镜6,7这种方法替代了细胞染料和荧光标记，使用户能够在不进行终末固定的情况下对活细胞进行实时追踪，并可连续采集同一孔中随时间变化的受损单层细胞的图像。将采用哪些结果指标进行分析？利用研究过程中采集的图像，可生成用于评估细胞迁移速率变化的数据。在本实验室中，将在倒置光学显微镜下获取的显微图像上传至图像分析软件，计算伤口闭合百分比及曲线下面积总和（AUC）。
我们将重点介绍该检测方法在阐明已知环境污染物砷对真皮成纤维细胞迁移影响方面的特定应用。砷是一种天然存在的类金属元素，存在于地壳中。已在多个地区发现砷含量升高，这对居住在这些地区附近的人群构成健康风险。因此，食物和水源中已显示出砷污染水平上升，增加了人群接触砷的可能性。研究表明，环境中的砷暴露会对人群产生长期健康影响，即使暴露浓度等于或低于美国环境保护署（USEPA）现行规定的最大污染物浓度限值（MCL）——10 ppb（10 µg/L）12,13。尽管美国环保署已设定该限值并认为其在饮用水安全范围内，但全球许多水源中砷浓度超过此限值的情况并不少见。在美国西南部，已有大量地下水、井水和泉水被证实含有令人担忧的砷浓度14。例如，在亚利桑那州的弗尔德河谷（Verde Valley），蒙特祖玛井（Montezuma Well）的砷浓度达到210 µg/L&#160;15。亚利桑那州弗尔德河周边的地下水砷浓度平均为16 µg/L&#160;，峰值可达1.3 mg/L15,16。值得注意的是，弗尔德河流域许多水井中的砷浓度超过50 µg/L15,16。基于上述信息，本研究选择了具有环境相关性的砷浓度，范围从低于MCL的0.1 µM（7.5 ppb）到高于MCL的10 µM（750 ppb）14,15,16,17,18,19,20.
这些实验所获得的信息将用作体内砷污染伤口中细胞迁移速率潜在变化的早期指标。in vivo 污染伤口中细胞迁移速率的早期指标。随后可根据信号分子在促进伤口愈合和细胞迁移中的作用选择特定分子，并可在当前研究完成后开展基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的基因表达定量分析实验。若本实验中砷的存在导致迁移速率发生变化，则参与细胞迁移的特定基因靶点可能受到砷的有害影响，从而成为其干扰机制的关键环节。

<table><tbody><tr><td>II 级 A/B3 型生物安全柜</td><td>Forma Scientific</td><td>15201-816</td><td></td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td>Kimberly-Clark</td><td>55082</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Precision</td><td>Model 182</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>Q080318</td><td></td></tr><tr><td>CPR 离心机</td><td>Beckman</td><td>349702</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Ohaus</td><td>I093 1125062111P</td><td></td></tr><tr><td>称量纸</td><td>VWR</td><td>H351125781212A</td><td></td></tr><tr><td>生物危害袋</td><td>Fisherbran</td><td>01-830A</td><td></td></tr><tr><td>水套式 CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>309739-31053</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>自动移液器</td><td>Drummond</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>p200 移液枪</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 移液枪</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>D59707</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>T75 组织培养瓶</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>组织标记笔</td><td>Securline</td><td>92167</td><td></td></tr><tr><td>擦拭纸</td><td>Kintech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher</td><td>63-67-0</td><td></td></tr><tr><td>非滤芯移液器吸头</td><td>Fisherbrand</td><td>16160210</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Great Value</td><td>220-04</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353915</td><td></td></tr><tr><td>冻存管架</td><td>Nalgene</td><td>5030-0505</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Gizmo Supply</td><td>B00SCOGY56</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 消化液</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>离心管架</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3598</td><td></td></tr><tr><td>废液杯</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>直边尺</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>人新生儿真皮成纤维细胞（hDFn）</td><td>批号：1734, 2902</td><td>106-05n</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio 统计分析软件</td><td></td><td>版本：3.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>版本：1.8.0_112</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 划痕实验用于演示砷对皮肤细胞迁移的影响

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

多年来，理解伤口愈合的生理机制一直是持续研究的重点。这些研究直接转化为临床伤口治疗标准的改进，有助于降低患者的发病率和死亡率。伤口愈合是一个复杂的过程，需要细胞与组织之间有策略性的相互作用和功能协调。其中，细胞迁移（包括单个细胞和集体迁移）是伤口愈合过程中众多关键功能之一。受伤后，来自血液、周围结缔组织和上皮组织的多种细胞会通过化学和/或物理刺激迅速迁移至伤口部位。这种迁移反应在很大程度上决定了伤口愈合的结果与成败。深入理解这一特定的细胞功能，对于推动转化医学发展、改善伤口愈合效果具有重要意义。本文介绍了一种用于深入研究与伤口愈合相关的细胞迁移过程的实验方案，并探讨细胞微环境的变化如何显著影响这一过程。在本示例研究中，将真皮成纤维细胞在添加胎牛血清（FBS）的培养基中，以单层形式培养于组织培养瓶中。细胞经无菌操作转移至组织培养处理的12孔板中，并培养至100%融合。达到融合状态后，使用p200移液枪头垂直划痕破坏单层细胞。随后，在含FBS的培养基中加入不同环境相关浓度（0.1–10 μM）的砷，分别加入各孔中。在24小时期间内，每隔4小时（h）使用倒置光学显微镜拍摄图像，以观察细胞迁移（即伤口闭合）情况。每张图像均使用图像分析软件进行单独分析，并计算伤口闭合百分比。结果表明，砷会减缓伤口愈合过程。该技术为评估污染物对伤口愈合影响提供了一种快速且经济的初步筛选方法。

所有处理组的样本量（n）均为 n = 28。细胞按照无菌技术和实验室操作规程成功培养（图1）。所有处理组均观察到均一的划痕，平均划痕宽度为 0.8 mm ± 0.4 mm（图2）。对照组的曲线下面积总和平均值为 1,355.83；0.01 µM As 处理组的曲线下面积总和平均值为 1,366.21；0.1 µM As 处理组为 1,326.24；1.0 µM As 处理组为 1,295.10；最后，10 µM As 处理组的曲线下面积总和平均值为 535.12，显著低于其他各组（p &lt; 0.05）（图3）。采用 R 程序进行统计分析，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey post hoc 校正，以确定各处理组之间的统计学差异（p &lt; 0.05）。
<img alt="细胞迁移实验；延时显微成像；对照组与砷处理组；0-20小时比较；细胞运动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：20小时期间代表性划痕实验图像。 图像A-D代表对照组细胞的迁移情况；图像E-H代表暴露于1.0 µM As的细胞迁移情况；图像I-L代表暴露于10 µM As的细胞迁移情况。从这些图像可以看出，在砷存在条件下，细胞迁移速度减慢。对照组图像显示，在20小时后划痕已完全“愈合”，而另外两个砷处理组则未实现“愈合”。10 µM As处理组在24小时后完全抑制了划痕的闭合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="总AUC砷剂量反应柱状图；从对照组至10μM浓度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：砷在划痕实验中减缓细胞迁移。 在24小时的时间段内采集图像，以观察不同浓度砷存在下细胞迁移速率的变化。原始图像采用自动化软件进行分析（例如在 MATLAB 中）首先测量伤口宽度，然后计算闭合百分比，最后计算曲线下面积（AUC）。误差线表示均值的标准误。 10 µM 与使用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验的其他所有处理组相比，该处理组显著减缓了人新生儿真皮成纤维细胞（hDFn）的细胞迁移，表现为AUC值显著降低。 事后检验 调整（p&lt;0.05）。统计学差异通过字母“A”和“B”表示，这些字母是通过R程序中的紧凑字母显示法（Compact Letter Display method）获得的。不共享相同字母的处理组之间具有统计学显著性差异（p&lt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本研究聚焦于一个 体外 伤口愈合模型（划痕实验）作为一种研究环境污染物（如砷）对细胞迁移影响的机制。结果表明，该 体外 检测可在细胞迁移发生改变之前提供快速且早期的指示 体内 实验。

理解伤口愈合的生理机制多年来一直是持续研究的重点。该研究可直接转化为……

细胞迁移是伤口愈合过程中的关键环节，会显著影响伤口愈合的最终结果。本实验方案可帮助研究人员更好地理解各种化合物对伤口愈合过程中细胞迁移的影响，从而常可为临床医学提供靶向治疗策略。划痕实验是一种经济高效且通量较高的方法，可在进行成本高昂且耗时的体内测试之前，获得有意义的伤口愈合数据。作为一种方法，划痕实验在伤口愈合研究中具有特别重要的意义，尤其是针对皮肤的研究。然而，该检测实际上是一种迁移检测，可应用于任何需要测量或捕获细胞迁移的细胞类型。与经典的细胞和组织培养类似，标准操作程序、培训、技术以及反复的练习、练习、再练习，是成功进行划痕检测的关键。演示该实验操作的是硕士生 Nathan Cruz 和本科生研究员 Oscar Lujan。开始此操作前，需使用 70% 的异丙醇水溶液对生物安全二级柜进行消毒擦拭，从后壁和侧壁开始，向下擦拭至底板。同时，在将所有实验所需材料放入柜内前，也需对其表面进行彻底擦拭。接下来，取含有目标冻存细胞系的冻存管，将其置于37摄氏度、深度为1厘米的水浴中解冻。向T75细胞培养瓶中加入10毫升添加了10% FBS的培养基。打开含有细胞储备液的冻存管，小心吸取其中的溶液。然后将细胞转移至T75培养瓶中。从培养瓶中取出1毫升培养基，转移回原冻存管中，再将该液体重新转移回培养瓶，以最大限度地回收冻存管中的细胞。拧紧培养瓶的瓶盖，轻轻摇动培养瓶，使悬浮的细胞均匀分散在整个培养瓶表面。此后，根据此处所示信息标记烧瓶，并将其置于37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中培养72小时。首先，从培养箱中取出组织培养烧瓶，按照文本方案中所述观察贴壁细胞。用移液管吸除烧瓶中的全部培养基液体，并转移至废液容器中。向培养瓶中加入 5 mL 平衡盐溶液，轻轻摇晃以冲洗掉多余的培养基、死细胞或代谢废物。然后将培养瓶中的盐溶液全部移除，并弃入废液容器中。接着，向培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶，轻轻摇晃使酶液均匀覆盖贴壁细胞。确保贴壁表面完全浸润，将培养瓶放入培养箱中孵育两到三分钟。随后，轻轻敲击培养瓶壁三至五次，以促进细胞脱落。用70%酒精擦拭培养瓶，然后将其放入生物安全柜中。加入 5 毫升培养基至组织培养瓶中，以终止酶与底物的反应。吸出瓶中的全部液体，转移至无菌的 15 毫升锥形管中。在 25 °C 条件下，以 200 ×g 离心 5 分钟。然后用70%酒精擦拭含有细胞沉淀的离心管，并将其放入生物安全柜中。用移液器吸去上清液，留下约250微升液体与细胞沉淀一同保留。将锥形管底部快速划过微量离心管架的管槽，产生短暂振动，以搅动并重悬细胞沉淀。正确操作完成后，新的细胞悬液应呈现浑浊的混合状态，无残留沉淀物。向细胞重悬液中加入2毫升培养基。轻轻吹打管壁侧面，使细胞上下移动20次，以充分分散任何团块。记录细胞悬液的总体积。接下来，使用无菌移液器向96孔板的空孔中加入20 µL台盼蓝原液。然后用无菌移液器吸头从15 mL离心管中吸取20 µL细胞原液，转移至含有台盼蓝溶液的孔中。轻轻吹打混匀内容物，取10微升混合液加入血细胞计数板盖玻片与计数室之间。仅对中央及四个角的方格内的细胞进行计数，分别记录这五个方格的总细胞数和非活细胞数。计算出活细胞数量后，在12孔板底部画一条水平线，作为成像时的参考标记。用培养基将细胞原液稀释至每毫升19,000个细胞的密度。然后向12孔板的每个孔中加入1毫升稀释后的细胞原液，在加样过程中需定期混匀细胞原液，以确保12个孔中的细胞接种均匀。用标签标注每个培养板，标签信息如图所示。将其置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养，直至细胞生长至100%汇合度。从培养箱中取出含有细胞的12孔板。使用10倍物镜的显微镜观察各孔中的细胞，并确定其汇合度。接下来，吸除并弃去每个孔中的培养基。将一支P200移液器装配1-200微升无菌吸头。在每个孔中，将移液器吸头从12:00位置沿细胞表面滑动至6:00位置，以划出一道划痕模拟伤口。用一毫升平衡盐溶液冲洗每个孔，以清除多余的碎片和细胞团块。左右轻轻摇动培养板以促进洗涤。然后吸出并弃去每孔中的平衡盐溶液。使用带有1,000微升吸头的P1000移液器，将1,000微升已配制好的砷储备液加入随机分配至处理组的孔中。每个孔使用新的移液器吸头，并记录加入处理液的时间。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育。为了对培养板进行成像，在24小时期间内，每隔4小时以10倍物镜放大倍数拍摄每个孔的图像。参考此前在培养板底部画出的标记线，以确保在每个时间点对每个孔内划痕的相同位置进行成像。在本研究中，采用体内划痕实验检测法观察砷对细胞迁移的影响。在所有处理组中均观察到均匀的划痕，平均划痕宽度约为0.8毫米。对照组细胞在20小时后划痕完全愈合，而两个砷处理组未表现出同等程度的愈合。10 微摩尔浓度的处理可完全抑制 24 小时内的伤口闭合。这些结果表明，砷的存在会减缓细胞迁移。实验过程中采集的原始图像通过自动化软件进行分析，以测量伤口宽度，随后计算闭合百分比，最后计算曲线下面积。与所有其他处理组相比，10微摩尔处理组显示出人新生儿真皮成纤维细胞迁移速度在统计学上显著减慢。充分练习该技术以提高划痕操作的一致性非常重要。不同实验之间若存在非预期的变异，可能会导致数据偏差并改变结论。刮痕实验后，可进一步采用定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附测定等分子技术，鉴定可能介导实验中观察到的细胞迁移变化的信使信号和蛋白质。该实验已为研究人员理解癌症转移、新兴癌症疗法、干细胞及再生医学等多个科学里程碑做出了重要贡献。

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