在体外显示砷对皮肤细胞迁移影响的划痕测定
February 23rd, 2019
本研究的重点是伤口愈合的体外模型 (划痕检测), 作为一种机制, 以确定环境污染物, 如砷如何影响细胞迁移。结果表明, 这种体外检测在体内实验之前为细胞迁移的变化提供了快速和早期的迹象。
细胞迁移是一个关键的伤口愈合过程，可以彻底改变愈合伤口的结果。该协议使研究人员能够更好地了解各种化合物在伤口愈合过程中对细胞迁移的影响。这往往会导致临床医学的有针对性的治疗策略。
划痕检测是一种经济高效且高通量的方法，用于在成本高昂且时间密集的体内测试之前生成有意义的伤口愈合数据。划痕测定作为一种方法在伤口愈合应用中特别相关。最具体地说，皮肤。
然而，该检测实际上是一种迁移检测，可以应用于任何细胞类型，其中细胞迁移是感兴趣的测量或捕获。类似于经典的细胞和组织培养，标准操作程序，培训，技术和实践，实践，实践。这些都是成功的关键与划痕测定。
展示这个程序的将是硕士生内森·克鲁兹和本科生奥斯卡·卢詹。要开始此过程，请使用 70% 异丙基水溶液准备生物安全 II 机柜，以执行卫生擦拭，从后壁和侧壁开始，一直工作到底板。在将检测材料放入机柜之前，还要擦拭所有用于测定的材料。
接下来，获取含有所需冷冻保留细胞系的小瓶，并在37摄氏度的1厘米深的水浴中放置一个，以解冻。将10毫升的介质加入10%FBS，加入T75组织培养瓶。打开含有细胞储存的小瓶，小心吸气溶液。
然后将细胞转移到T75烧瓶中。从烧瓶中取出一毫升的介质，并将其转移回小瓶中，然后将其转移回烧瓶中，以最大限度地提高小瓶中的细胞产量。拧紧烧瓶盖，轻轻摇动它，以均匀地将悬浮的细胞分散到整个表面。
之后，用此处显示的信息标记烧瓶，并在 37 摄氏度和 5%的二氧化碳下放置在加湿的培养箱中 72 小时。首先，从培养箱中取回组织培养瓶，并观察文本协议中所述的粘附细胞。从烧瓶中吸出全部介质，然后转移到废物容器中。
在烧瓶中加入五毫升的平衡盐溶液，轻轻摇动，冲洗掉多余的介质、死细胞或废物。然后从烧瓶中去除整个盐溶液，然后丢弃到废物容器中。接下来，在烧瓶中加入两毫升的三辛，轻轻摇动它，将酶分散在粘附的细胞上。
确保粘附表面完全饱和，将组织烧瓶放在培养箱中两到三分钟。之后，轻轻敲拍烧瓶的侧面三到五次，以帮助促进细胞分离。用70%酒精擦拭烧瓶，并放在生物安全柜中。
在组织烧瓶中加入五毫升的库存介质，以阻止酶基底反应。从烧瓶中吸出整个液体体积，并转移到无菌的15毫升锥形管中。在200倍g和25摄氏度下离心5分钟。
然后使用70%酒精擦拭含有颗粒细胞的管子，并放在生物安全柜内。移出介质，留下约250微升的液体与细胞颗粒。将锥形管底部穿过微离心管机架的小瓶槽，以产生快速振动并干扰和重新暂停电池颗粒。
正确完成后，新的细胞溶液将显示为无剩余颗粒的多云混合物。向细胞再增中添加两毫升介质。在管子的一侧轻轻上下移液细胞20次，以分解任何团块。
并记录总细胞悬浮量。接下来，使用无菌移液器将20微升的 trypan 蓝色股票添加到96井板的空井中。使用无菌移液器尖端，将 20 微升细胞存量从 15 毫升管转移到含有 trypan 蓝色溶液的井中。
移液器轻轻混合内容物，并在表皮滑移和血细胞计上的计数室之间转移 10 微升混合物。仅计算中心单元格和四个角方块，分别计算五个已标识正方形的总单元格计数和不可行的单元格计数。计算可行细胞计数后，在 12 井板的底部标记一条水平线，作为成像期间的参考标记。
用介质稀释细胞存量，密度为每毫升19，000个细胞。然后用一毫升稀释的细胞储存播种12孔板的每个孔，定期混合细胞储存，以确保所有12口井的细胞均匀播种。使用此处显示的信息标记每个板。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下放在孵化器中，直到细胞生长到100%汇合。从培养箱中取回一个12井的细胞。使用具有 10 倍目标的显微镜，观察细胞并确定每个井内的汇合。
接下来，从每一个井中吸气并处理生长介质。组装一个P200管道机与1-200微升无菌尖端。在每口井中，将移液器尖端从 12:00 位置滑过细胞表面，以产生划痕模拟伤口。
用一毫升的平衡盐溶液冲洗每口井，清除多余的碎屑和细胞团块。将板从一侧摇到另一侧，以方便清洗。然后从每一个井中去除并处理平衡的盐溶液。
使用带1000微升尖端的P1000移管器，将1000微升的砷储存添加到与治疗组随机分配的井中。对每一个井使用新的移液器尖端，并记录添加治疗的时间。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育板。
要对板进行成像，请每孔在 24 小时内以 10 倍的客观放大率拍摄一次图像。参考以前在板底绘制的线，在每个时间点上沿每个井内的划痕成像相同的位置。在这项研究中，一种体内划痕测试用于观察砷对细胞迁移的影响。
所有治疗组均观察到均匀的划痕，平均划痕宽度约为 0.8 毫米。控制细胞在20小时后显示完全愈合的划痕。两个砷组没有显示这种水平的愈合。
10微摩尔治疗抑制关闭完全24小时。这些结果表明，砷的存在减缓了细胞迁移。使用自动软件分析检测过程中捕获的原始图像，以测量伤口宽度，然后计算百分比闭合，最后计算曲线下的面积。
10微摩尔治疗组显示，与所有其他治疗组相比，人类新生儿皮肤纤维细胞的细胞迁移在统计上减缓。彻底练习此技术以提高抓伤细胞的一致性非常重要。检测之间的无意变异性可能会扭曲数据并改变结论。
进一步的分子技术，如定量聚合酶链反应和酶链接免疫吸附剂测定，可以采用刮伤后测定，以确定信使信号和蛋白质，这些信号和蛋白质可能是测定中观察到的细胞迁移变化的目标。这一分析有助于研究人员理解癌症转移、新兴的癌症疗法、干细胞和再生医学，以及许多其他科学里程碑。
概述
本研究使用体外划痕测定法来探讨环境污染物，特别是砷，对伤口愈合过程中细胞迁移的影响。研究结果表明，该测定法可以在体内研究之前提供细胞行为的早期洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 毒理学
背景
- 细胞迁移对有效的伤口愈合至关重要。
- 环境污染物可能会对细胞过程产生不利影响。
- 划痕测定法是一种广泛用于研究细胞迁移的方法。
- 了解这些影响可以导致更好的临床治疗。
研究目的
- 评估砷如何影响细胞迁移。
- 建立可靠的体外模型用于初步测试。
- 增强对伤口愈合机制的理解。
使用的方法
- 划痕测定法评估细胞迁移。
- 细胞培养的准备和砷处理。
- 观察处理后的细胞行为。
- 数据收集以分析迁移模式。
主要结果
- 划痕测定法有效地展示了细胞迁移的变化。
- 砷暴露改变了细胞的迁移动态。
- 结果为进一步的体内研究提供了基础。
- 早期的细胞反应指标可以在体外观察到。
结论
- 划痕测定法是研究污染物影响的宝贵工具。
- 研究结果强调了细胞迁移研究中早期测试的重要性。
- 需要进一步的研究来探索对伤口愈合治疗的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cell migration using the in vitro scratch assay provides early, actionable insights into the biological impact of environmental contaminants on wound healing. This assay enables rapid hypothesis testing and mechanistic de-risking before advancing to resource-intensive in vivo models. Its reproducibility and scalability make it a valuable tool for portfolio triage and early-stage target validation in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular migration pathways relevant to wound healing and tissue regeneration.
- Supports biological de-risking by quantifying the impact of test compounds on cell motility.
- Facilitates functional target validation through direct measurement of migration inhibition or promotion.
- Provides predictive confidence for downstream translational studies.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, high-throughput platform for evaluating compound effects on cell migration.
- Generates reproducible, quantitative outputs such as percent wound closure and area under the curve.
- Enables assay scalability and platform reuse across multiple cell types and conditions.
- Prepares validated biological systems for reliable compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant processes such as impaired wound healing or metastasis.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by providing mechanistic data.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative migration metrics.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker development when supported by further molecular analyses.
Pipeline & Workflow Integration
The scratch assay is positioned at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge to preclinical research by enabling rapid, quantitative evaluation of cellular migration responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for cell migration and wound healing mechanisms.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts suitable for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Provides statistical outputs such as percent closure and area under the curve for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro migration data to disease-relevant outcomes and potential biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to diverse cell types and experimental questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Enables standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by filtering compounds before in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, imaging, and quantitative analysis.
- Needs access to tissue culture facilities, inverted microscopy, and image analysis software.
- Demands rigorous cross-team standardization to minimize assay variability.
- Adaptable to various cell types but may require protocol optimization for each system.
- Potential limitations include operator-dependent variability and the need for consistent scratch technique.
