Name: 用于补丁夹紧器的接触气泡层的脂质双层实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解接触气泡双层膜技术，用于在脂质双层中记录单通道电流并研究通道-膜相互作用。该方法结合平面脂质双层与膜片钳技术的优势，实现高信噪比电生理记录。

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作者感谢山武真理子和高岛正子提供的技术协助。本工作部分由KAKENHI资助项目编号16H00759和17H04017（SO）支持。

1. 制备脂质体
<ol>
	<li>分散磷脂（例如，10 mg 粉末）溶于氯仿，配制成所需浓度（例如，10 mg/mL。</li>
	<li>蒸发氯仿。
	<ol>
		<li>将磷脂溶液置于圆底烧瓶中，并将其固定在旋转蒸发仪上（参见 材料表) 连接到一个 N2 气瓶。在N₂气氛下旋转烧瓶2 室温下减压旋转蒸发至形成一层薄薄的磷脂膜（约30分钟后）。</li>
		<li>将敞口烧瓶放入连接真空泵的干燥器中。启动真空泵，抽真空数小时，以彻底除去氯仿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向烧瓶中加入适量电解质溶液，悬浮磷脂，制备成浓度为2 mg/mL的磷脂悬浮液。</li>
	<li>使用浴式超声仪对悬浮液超声处理数十秒（参见 材料表以获得多层囊泡（MLV）悬液。</li>
	<li>制备含有离子通道蛋白的蛋白脂质体时，将蛋白溶液（使用适当去垢剂溶解的蛋白；体积占比不超过2%）加入MLV悬浮液中，并使用水浴超声仪超声数秒。</li>
</ol>
2. 准备大口径玻璃移液管
<ol>
	<li>将玻璃毛细管安装至拉针仪上，通过两步拉制法制备具有细长锥形尖端的微电极。</li>
	<li>将微电极置于显微成型仪上，使微电极尖端接触铂丝，在锥形部位进行接触，该部位直径为 30 至 50 µm。</li>
	<li>短暂加热铂丝（5 秒），随后立即关闭电源。 
	注意：此操作会在加热位置产生裂口，从而使微电极尖端断裂脱落，留下直径为 30 至 50 µm 的宽孔开口。</li>
</ol>
3. 使用浅凹孔玻片表面处理（硅化以获得疏水表面）
<ol>
	<li>用蒸馏水和乙醇清洁带有浅井的载玻片表面。</li>
	<li>加入适量体积（例如，将100 µL疏水化试剂（防潮剂）滴加到打孔载玻片上。</li>
	<li>在空气中将试剂彻底干燥。</li>
	<li>将玻璃载玻片置于倒置显微镜的载物台上。</li>
</ol>
4. 形成CBB并进行电生理测量
<ol>
	<li>向硅化孔板玻璃的浅孔中加入 100 µL 十六烷。 
	&#8203;注意：对于脂质去除法，需预先将磷脂分散于十六烷（20 mg/mL）中。</li>
	<li>使用结核菌素注射器将电解质溶液填充至微电极尖端长度的一半处。</li>
	<li>将微量移液器放置在带有压力接口的微量移液器架上，使Ag/AgCl丝电极浸入移液器电解液溶液中。</li>
	<li>将其中一个微电极夹持器连接至膜片钳放大器的头级，另一个连接至电学接地端。</li>
	<li>将显微注射仪连接至显微移液管持架的压力接口。</li>
	<li>通过操作显微操作器，将微量移液器置于倒置显微镜载物台上方的适当位置。</li>
	<li>调节电极偏移电位。
	<ol>
		<li>在凹孔载玻片浅井周围的平坦表面放置1 µL与充注微电极移液管所用相同的电解质溶液，形成电解质液滴。</li>
		<li>通过操纵显微操作仪，将两支微量移液器的尖端浸入电解液穹顶中。</li>
		<li>调节膜片钳放大器的电极偏移电位。</li>
		<li>通过在实验结束时施加高膜电位（电击穿；使用放大器上的Zap功能）破坏CBB，使两个气泡融合为一个（气泡融合），从而确认正确的偏移量。</li>
		<li>校正液接电位54 在使用不对称电解质溶液的情况下，需将计算值加至所施加的膜电位上，以获得真实的膜电位。 
		注意：液接电位使用 JPCalc 程序计算55.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从尖端吸取脂质体溶液。 
	&#8203;注意：采用脂质外翻法检测水溶性通道时，无需抽吸脂质体溶液。
	<ol>
		<li>将1 µL脂质体溶液置于凹孔载玻片浅孔周围的平坦表面（含脂质体的穹顶区域）。</li>
		<li>操纵显微操作仪，将微移液管的尖端插入含有脂质体的穹顶结构中。</li>
		<li>使用显微注射仪降低微移液管支架内的压力，吸取含有脂质体的溶液。</li>
		<li>对另一支移液器重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操纵显微操作仪，将微吸管尖端浸入浅孔中的十六烷内。</li>
	<li>缓慢增加压力，吹出一个水泡，直至气泡达到所需大小（例如，直径50 µm）并在之后保持相同压力。</li>
	<li>若难以保持气泡大小稳定，可通过将移液头穿过油-空气界面来去除气泡。</li>
	<li>重复步骤 4.8 至 4.9，直至形成稳定的气泡。</li>
	<li>操纵气泡使其相互接触（图5). 
	注意：有时气泡会自发靠近并形成气泡双层膜（CBB）。在其他情况下，气泡虽彼此接近但未接触。此时，需通过机械方式推动气泡使其相互接触。</li>
	<li>调节压力以维持气泡大小，因为即使在气泡内压力恒定的情况下，气泡大小也可能逐渐发生变化。</li>
	<li>使用膜片钳放大器将膜电位调节至适当值，并等待通道电流出现（图6).</li>
</ol>
5. 测量双层电容
<ol>
	<li>通过施加斜坡电位测量双层膜的电容（Cel）。 
	注意：当斜坡指令中的电压变化速率为 10 mV/10 ms（或 1 V/s），随后为 -10 mV/10 ms 时，斜率变化引起的电流跃变幅度即对应于膜电容值的读数（例如，100 pA → 100 pF）。</li>
	<li>评估上下堆叠的两个气泡所形成的双层膜面积，并将显微镜聚焦于双层膜层面以观察双层膜的边缘（图6）。 
	注意：双层膜形状多为圆形，其面积由半径计算得出。</li>
	<li>通过将电容除以双层膜面积来计算单位膜电容（Csp）（Csp = Cel/A）。</li>
	<li>利用公式 Dc = (εrε0)/Csp 计算双层膜厚度（疏水核心的厚度）（其中 εr 和 ε0 分别表示双层膜疏水区域的介电常数和真空介电常数）。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

CBB 法形成脂双层的原理基于由单层膜包被的油中水滴20从技术上讲，构建CBBs的步骤较为简单，尤其对于熟练操作玻璃微电极的膜片钳研究人员而言。当配备两个带有微注射器的微电极操纵器时，膜片钳的电生理装置可直接用于CBB实验。另一方面，由于CBB是传统PLB的延续，而传统PLB已积累了大量的物理化学知识8，这一背景知识以及表面化学的相关知识38 有助于CBB的操作与操控。CBB能够调节化学组成和物理状态，为研究通道-膜相互作用提供了一个多功能平台61在CBB中，排列在气泡表面的脂质能够自由地跨过单层相与双层叶之间的边界扩散，我们已开发出双层附着-脱离和膜灌流等技术45我们已将CBBs扩展用于 体外 通道蛋白合成，其中通道合成在气泡中进行，新合成的通道蛋白在膜电位作用下自发转移至双层膜，同时从KcsA DNA转录/翻译启动时起追踪KcsA通道的新生功能...

对于离子通道而言，细胞膜不仅是起支撑作用的材料，更是产生离子流的合作伙伴。从功能上看，细胞膜是一种电绝缘体，离子通道嵌入其中，且所有细胞膜都具有静息膜电位。传统上，通过外部电路施加一个任意的膜电位，以测量通道中的电流。在不同膜电位下对离子流进行的这种定量评估揭示了这些通道的分子特性，例如其离子选择性通透性和门控功能1,2。用于离子通道功能研究的膜平台可以是细胞膜，也可以是脂双层膜。历史上，单通道电流记录最初是在脂双层膜上实现的3,4，随后相关技术被发展应用于细胞膜，例如膜片钳技术（图1A）5,6。自此以后，这两种技术朝着不同的应用方向分别发展（图1）7,8。
膜脂质和双层膜因其在支持通道蛋白结构和功能方面的作用，目前正成为研究的焦点。因此，能够便捷地改变双层膜中脂质组成的方法备受关注。平面脂双层（PLB）8,9,10,11、油中水滴双层12以及液滴界面双层（DIB）13,14,15,16,17,18,19技术（图1）是常用的方法，可为在不同脂质组成条件下研究通道功能提供机会20。尽管DIB在技术上比传统的PLB更容易制备，但其较大的尺寸使得膜片钳研究者缺乏将其用于常规电导大小（&#60;100 pS）单通道电流记录的动力。
为了规避背景噪声，必须尽量减小双层膜的面积。这一问题令人联想到脂质双层膜电生理技术发展过程中历史的重演（图1）。早期，人们在移液管尖端形成小尺寸的双层膜（直径为1–30 µm），即尖端浸入法（tip-dip method；图1C）21,22,23，而不是在腔室中的疏水隔膜上形成游离双层膜（直径约100 µm）（图1B）。尖端浸入法能够实现背景噪声显著更低的电学测量24。我们在使用平面脂双层（PLB）25,26、尖端浸入法22,23,27以及膜片钳技术28,29,30,31方面的经验，促使我们提出了一种基于油相中水相双层膜原理构建脂质双层的新方法。我们将该方法称为接触气泡双层膜（CBB）法20,32。在此方法中，不是将水相液滴悬挂在油相中（图1D），而是通过玻璃移液管（尖端直径约为30 µm）向油相中吹入一个水相气泡（图1E和图2），并通过施加稳定压力维持该气泡。在气泡表面的水-油界面处，单层膜会自发形成。随后，通过操控两根玻璃移液管使两个气泡对接，当两个单层膜相互靠近时即形成双层膜，最终达到平衡状态的双层膜面积。气泡的大小由气泡内压力（维持压力）控制，双层膜的尺寸也随之调控。通常采用约50 µm的平均直径。尽管气泡体积很小（&#60;100 pL），但它与移液管内微升级体积的溶液相连，构成主体电解质相。
使用CBB方法具有诸多优势（表1）。作为一种脂双层形成技术，可制备具有不同脂质组成的膜，并且相较于传统的折叠法33，更易于形成不对称膜32。与仅能通过流体静压差弯曲的传统平面脂双层（PLB）不同，CBB膜可进行机械操控34,35。通过改变维持压力，气泡可发生膨胀或收缩，从而导致膜张力增加或降低32。该脂双层可被机械性地分离为单层，类似于形态学研究中膜的冷冻断裂技术36,37，但使用CBB时，可通过操作实现反复的分离与重新结合循环32。气泡内电解质溶液的小体积有利于通道重构脂质体高效融合至脂双层中，获得通道记录的概率远高于传统PLB技术。小体积气泡还允许在将另一灌注移液管插入任一气泡后，实现快速灌流（约20 ms内）。与膜片钳技术不同，CBB膜一旦破裂可立即且反复地重新形成，移液管每天可重复使用多次。通过整合膜片钳与PLB方法的优点，CBB提供了一个多功能平台，可用于改变膜的物理化学条件，从而实现对通道-膜相互作用的前所未有的研究。
在详细介绍CBB形成过程的实验方案之前，首先阐述双层膜形成的物理化学背景，这将有助于膜片钳使用者解决在膜形成过程中遇到的实验难题。
CBB 实验传授了表面化学科学的知识38。CBB 类似于通过吸管向空气中吹出的肥皂泡，类似地，此处是将水泡吹入有机溶剂中。可以观察到，当水相或有机溶剂中均未添加膜脂时，水泡几乎无法膨胀。在缺乏两亲性脂质的情况下，水-油界面的表面张力较高，因此吹制气泡所需的泡内压力也较高。这体现了拉普拉斯方程（ΔP = 2 γ/R，其中 ΔP 为泡内压力，γ 为表面张力，R 为气泡半径）。当有机相或电解质溶液中脂质浓度较高时，根据吉布斯吸附等温方程（-dγ = Γi dµi，其中 Γi 为组分 i 的表面过剩量，µi 为组分 i 的化学势）39，单分子层中脂质密度增加，导致表面张力降低，气泡更易形成。在 CBB 中，可以从切向角度观察双分子层（图 2），并可测量单分子层与双分子层之间的接触角。该角度代表了单分子层与双分子层表面张力之间的平衡（杨氏方程：γbi = γmo cos(θ)，其中 γbi 为双分子层张力，γmo 为单分子层张力，θ 为接触角）。接触角的变化反映了双分子层张力的变化，前提是单分子层张力可通过接触角随膜电位变化的关系进行评估（杨-李普曼方程：γmo = Cm V2/4 (cos(θ0) - cos(θv))，其中 Cm 为膜电容，V 为膜电位，θ0 和 θv 分别为 0 mV 和 V mV 时的接触角）40,41,42。当两个气泡足够接近时，它们会自发相互靠近。这是由于范德华力的作用，我们可以在 CBB 形成过程中直观地观察到这一动态过程。
CBB 系统由不同的相组成：即主体油相、被单层膜包覆的水相气泡，以及相接触的双层膜（图3）。这些结构类似于在 PLB 中观察到的多种相态，例如围绕双层膜相的含溶剂环状结构，以及被两个单层膜夹在中间的薄有机相43,44。在 CBB 中，单层膜相与双层膜的叶层是连续的，脂质分子可在单层膜与叶层之间自由扩散。单层膜相覆盖了气泡的大部分表面，构成主要相态，起到脂质储存库的作用。由于单层膜中脂质的疏水尾部向外延伸至主体油相，双层膜内部或疏水核心便与主体油相相通。因此，注入到靠近双层膜的油相中的疏水性物质能够轻易进入双层膜内部。这便是我们近期开发的膜灌注技术45，该技术可在单通道电流记录过程中快速（在一秒内）改变双层膜中的脂质组成。我们发现，通过开启或关闭胆固醇的灌注，可逆地调控双层膜中的胆固醇含量45。当相关物质在单层膜与双层膜中的浓度不同时，其浓度梯度会通过扩散迅速消除，这一现象称为马兰戈尼效应（Marangoni effect）46,47。另一方面，脂质分子在单层膜之间的翻转（flip-flop）过程则较为缓慢48,49,50。
采用CBB方法，可在多种物理化学条件下形成双层膜，例如电解质pH低至1 51、盐（K+、Na+、etc.）浓度高达3 M、膜电位高达±400 mV，以及体系温度高达60 °C的条件。
形成CBB并将其通道分子整合其中的方法有多种。在水-油界面形成单层膜时，可将脂质以有机溶剂形式加入（外脂法；图4A, 4C），或以脂质体形式包裹在气泡中加入（内脂法；图4B, 4D）。值得注意的是，内脂法可实现不对称膜的构建15,32。对于可溶于水溶液的通道分子（例如，成通道肽类），可直接加入气泡中（图4A, B）52,53；而通道蛋白则需先重建至脂质体中，再将脂质体加入气泡内（图4C, D）。本文展示了采用内脂法构建CBB的过程，分别用于通道肽（多甲胺B（pTB）；图4A）和蛋白质（KcsA钾离子通道；图4C）的情况。

<table><tbody><tr><td>豆蔻酰卵磷脂（L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱，IV-S型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3644</td><td></td></tr><tr><td>模数转换器</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata1550A</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl电极</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1317</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td>M1800H-J</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0062</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Dojindo</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>打孔载玻片</td><td>Matsunami Glass</td><td>S339929</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>隔振台</td><td>Herz</td><td>TDI-86LA(Y)2</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>EMM</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器夹持器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正十六烷</td><td>Nacalai</td><td>07819-32</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>HEKA</td><td>EPC800</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>POPC（1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>POPE（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺&lt;br/&gt;）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757</td><td></td></tr><tr><td>POPG（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Nacalai</td><td>28514-75</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Iwaki</td><td>REN-1000</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Nacalai</td><td>32402-05</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Buchi</td><td>V-100</td><td></td></tr></tbody></table>

用于膜片钳研究的接触气泡双层脂质膜实验

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

脂质双分子层为离子通道的功能研究提供了一个独特的实验平台，能够在不同膜脂组成条件下考察通道与膜之间的相互作用。其中，液滴界面双层膜技术已获得广泛应用；然而，较大的膜面积限制了低电学背景噪声的记录。我们建立了一种接触气泡双层膜（CBB）方法，结合了平面脂质双层和膜片钳技术的优势，例如可调节脂质组成以及调控双层膜力学特性。利用常规膜片钳实验的装置，可直接开展基于CBB的实验。简言之，将玻璃移液管中的电解质溶液吹入有机溶剂相（十六烷）中，并通过维持移液管内压力以获得稳定大小的气泡。气泡表面会自发形成一层脂质单层膜（纯脂质或混合脂质），该单层膜来源于气泡中的脂质体。随后，使两个玻璃移液管尖端处带有脂质单层膜的气泡（直径约50 µm）对接，从而形成双层膜。将含有通道蛋白的重组脂质体引入气泡后，通道可插入双层膜中，实现单通道电流记录，其信噪比可与膜片钳记录相媲美。可方便地构建具有不对称脂质组成的CBB。通过吹出原有气泡并形成新的气泡，可反复更新CBB。此外，可对CBB施加多种化学和物理扰动（例如，膜灌流和双层膜张力）。本文中，我们介绍了CBB形成的基本操作流程。

典型的CBB直径为50 µm（图5、6），在十六烷中的特异性膜电容为0.65 µF/cm2。气泡大小可通过气泡内压力进行任意调控。当需要较小气泡以实现低噪声记录时，尖端直径也应相应减小。例如，当气泡直径为50 µm时，尖端直径应为30 µm。
CBB形成后，水溶液或脂质体中的通道分子在数分钟至数十分钟内自发插入双分子层。在施加膜电位的条件下，通过电流幅度的逐步增加可确认通道的插入（图7）。与传统的PLB和DIB系统相比，较小的膜面积（<1,000 µm2）显著提高了电信号的信噪比。
记录电流可一直持续至膜破裂且两个气泡融合为止。可反复吹出...

本文介绍了一种利用接触气泡双层法形成脂双层的实验方案。将水相气泡吹入有机溶剂中，在水-油界面处形成单层膜。通过操纵两根移液管使气泡对接，从而形成双层膜结构。

脂质双分子层为离子通道的功能研究提供了独特的实验平台，可用来考察通道与膜之间的相互作用……

接触气泡双层膜法是一种传统脂质双层膜技术的替代方法，该方法允许通过膜进行更灵活的振动。CBB 法结合了平面脂质双层膜和膜片钳技术的优点。作为一种脂质双层技术，可以形成具有任意脂质组成的细胞膜支撑双层脂膜（CBB）。我们开发了一种用于单通道电流记录且具有高信噪比的CBB。该方法允许多种膜振动形式，并为通道与膜界面的研究提供了广泛的平台。每个人都体验过吹肥皂泡。类似的操作可用于CBB的形成，只需手动微调施加的压力，而无需用嘴吹。多加练习，享受CBB带来的乐趣。开始该实验步骤时，将磷脂以所需浓度分散于圆底烧瓶中的氯仿溶液内。将磷脂溶液置于连接氮气钢瓶的旋转蒸发仪上。在室温下通入氮气并旋转烧瓶，直至形成一层薄的磷脂膜。接下来，将敞口的烧瓶放入连接真空泵的干燥器中。使用真空泵抽吸干燥器内部数小时，以彻底去除氯仿。随后向烧瓶中加入适量电解质溶液，并将磷脂悬浮，得到浓度为 2 毫克/毫升的磷脂悬浮液。使用水浴超声仪超声处理20至30秒，以获得多层囊泡悬浮液。制备含有离子通道蛋白的蛋白脂质体时，将蛋白溶液加入多层囊泡悬浮液中，然后使用水浴超声仪超声处理数秒。为制备大口径玻璃移液管，将玻璃毛细管放入拉管仪中，通过两步拉制法制备出具有细长锥形尖端的微移液管。然后将微移液管置于显微火焰成型仪上，使其尖端与铂丝在直径为30至50微米的锥形部位接触。短暂加热铂丝后立即关闭电源。使用蒸馏水和乙醇清洁带有浅井的载玻片表面。接着将硅化试剂涂布于载玻片上，并让试剂在空气中完全干燥。然后将载玻片放置在倒置显微镜的载物台上。向硅化玻璃载片的浅孔中加入 100 微升十六烷。使用结核菌素注射器将电解质溶液注入至微移液管长度的一半。随后将微移液管安装到带有压力接口的微移液管架上，使银/氯化银丝电极浸入微移液管电解质溶液中。将其中一个微移液管支架连接到膜片钳放大器的头级，另一个连接到电接地端。随后将微注射器连接到微移液管支架的压力端口。使用显微操作器将微移液管调整至倒置显微镜载物台上方的合适位置。为了调节电极偏移电位，取一微升用于填充微电极的相同电解质溶液，滴加在玻璃载片浅孔周围的平坦表面上，形成电解质液滴。将两根微电极的尖端浸入该电解质液滴中。随后调节膜片钳放大器的电极偏移电位。吸取脂质体溶液时，先将一微升脂质体溶液滴加在载玻片浅孔周围的平坦表面上。接着将微量移液器的尖端置于含有脂质体的液滴中，使用显微注射仪吸取含有脂质体的溶液。对另一支微移液管重复上述操作，用于吸取通道中的重组脂质体。然后将微移液管尖端置于浅孔中的十六烷内。通过缓慢增加压力吹出一个水泡，直至水泡达到所需大小，之后保持压力不变。如果难以保持气泡大小稳定，可通过将移液枪头穿过油-空气界面来弃去该气泡。重复上述操作，直至形成两个稳定的气泡。使这两个气泡相互接触。调节压力以维持气泡大小，因为即使在气泡内压力恒定的情况下，气泡大小也可能逐渐发生变化。使用膜片钳放大器将膜电位设定至适当值，并等待通道电流出现。为了形成稳定的脂双层，清洁滤纸至关重要。玻璃毛细管或移液管的制备应彻底清洗，避免被洗涤剂分子污染。一旦CBB形成通道分子，无论是在水溶液中还是在脂质体中，都会在数分钟至数十分钟内自发插入双分子层。在施加膜电位的条件下，通过电流幅度的逐步增加可确认通道的插入。通过CBB方法形成的双层膜可被分离为两个单层膜。在两个单层膜接触后，pTB通道电流立即出现。随着接触面积增大，电流也随之增大；电流的幅度与CBB的分离-贴附操作同步变化。如果吹出的气泡数量过多，会导致水溶液中的脂质浓度降低，从而无法形成单层膜。此时应尝试减轻脂质体部分的压力。一旦CBB形成和通道重建成功建立，即可尝试通过灌注或注入亲水性或疏水性物质来改变水溶液和膜的组成。CBB方法为探索通道-膜相互作用开辟了多种途径。

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本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

在此，开发了一种基于纳米棒支撑的脂质双层系统，以构建具有确定曲率的合成膜，从而实现对具有曲率感知能力的蛋白质进行表征 体外.

一种用于研究膜曲率感应蛋白的纳米棒支撑脂双层系统 体外

本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。...

利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

了解接触气泡双层膜技术，用于在脂质双层中记录单通道电流并研究通道-膜相互作用。该方法结合平面脂质双层与膜片钳技术的优势，实现高信噪比电生理记录。

用于膜片钳研究的接触气泡双层脂质膜实验

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