用于膜片钳研究的接触气泡双层脂质膜实验

接触气泡双层膜法是一种传统脂质双层膜技术的替代方法，该方法允许通过膜进行更灵活的振动。CBB 法结合了平面脂质双层膜和膜片钳技术的优点。

作为一种脂质双层技术，可以形成具有任意脂质组成的细胞膜支撑双层脂膜（CBB）。我们开发了一种用于单通道电流记录且具有高信噪比的CBB。该方法允许多种膜振动形式，并为通道与膜界面的研究提供了广泛的平台。

每个人都体验过吹肥皂泡。类似的操作可用于CBB的形成，只需手动微调施加的压力，而无需用嘴吹。多加练习，享受CBB带来的乐趣。

开始该实验步骤时，将磷脂以所需浓度分散于圆底烧瓶中的氯仿溶液内。将磷脂溶液置于连接氮气钢瓶的旋转蒸发仪上。在室温下通入氮气并旋转烧瓶，直至形成一层薄的磷脂膜。

接下来，将敞口的烧瓶放入连接真空泵的干燥器中。使用真空泵抽吸干燥器内部数小时，以彻底去除氯仿。随后向烧瓶中加入适量电解质溶液，并将磷脂悬浮，得到浓度为 2 毫克/毫升的磷脂悬浮液。

使用水浴超声仪超声处理20至30秒，以获得多层囊泡悬浮液。制备含有离子通道蛋白的蛋白脂质体时，将蛋白溶液加入多层囊泡悬浮液中，然后使用水浴超声仪超声处理数秒。

为制备大口径玻璃移液管，将玻璃毛细管放入拉管仪中，通过两步拉制法制备出具有细长锥形尖端的微移液管。然后将微移液管置于显微火焰成型仪上，使其尖端与铂丝在直径为30至50微米的锥形部位接触。短暂加热铂丝后立即关闭电源。

使用蒸馏水和乙醇清洁带有浅井的载玻片表面。接着将硅化试剂涂布于载玻片上，并让试剂在空气中完全干燥。然后将载玻片放置在倒置显微镜的载物台上。

向硅化玻璃载片的浅孔中加入 100 微升十六烷。使用结核菌素注射器将电解质溶液注入至微移液管长度的一半。随后将微移液管安装到带有压力接口的微移液管架上，使银/氯化银丝电极浸入微移液管电解质溶液中。

将其中一个微移液管支架连接到膜片钳放大器的头级，另一个连接到电接地端。随后将微注射器连接到微移液管支架的压力端口。使用显微操作器将微移液管调整至倒置显微镜载物台上方的合适位置。

为了调节电极偏移电位，取一微升用于填充微电极的相同电解质溶液，滴加在玻璃载片浅孔周围的平坦表面上，形成电解质液滴。将两根微电极的尖端浸入该电解质液滴中。随后调节膜片钳放大器的电极偏移电位。

吸取脂质体溶液时，先将一微升脂质体溶液滴加在载玻片浅孔周围的平坦表面上。接着将微量移液器的尖端置于含有脂质体的液滴中，使用显微注射仪吸取含有脂质体的溶液。

对另一支微移液管重复上述操作，用于吸取通道中的重组脂质体。然后将微移液管尖端置于浅孔中的十六烷内。通过缓慢增加压力吹出一个水泡，直至水泡达到所需大小，之后保持压力不变。

如果难以保持气泡大小稳定，可通过将移液枪头穿过油-空气界面来弃去该气泡。重复上述操作，直至形成两个稳定的气泡。使这两个气泡相互接触。

调节压力以维持气泡大小，因为即使在气泡内压力恒定的情况下，气泡大小也可能逐渐发生变化。使用膜片钳放大器将膜电位设定至适当值，并等待通道电流出现。为了形成稳定的脂双层，清洁滤纸至关重要。

玻璃毛细管或移液管的制备应彻底清洗，避免被洗涤剂分子污染。一旦CBB形成通道分子，无论是在水溶液中还是在脂质体中，都会在数分钟至数十分钟内自发插入双分子层。在施加膜电位的条件下，通过电流幅度的逐步增加可确认通道的插入。

通过CBB方法形成的双层膜可被分离为两个单层膜。在两个单层膜接触后，pTB通道电流立即出现。随着接触面积增大，电流也随之增大；电流的幅度与CBB的分离-贴附操作同步变化。

如果吹出的气泡数量过多，会导致水溶液中的脂质浓度降低，从而无法形成单层膜。此时应尝试减轻脂质体部分的压力。一旦CBB形成和通道重建成功建立，即可尝试通过灌注或注入亲水性或疏水性物质来改变水溶液和膜的组成。

CBB方法为探索通道-膜相互作用开辟了多种途径。