用于补丁夹紧器的接触气泡层的脂质双层实验
January 16th, 2019
在这里, 我们提出了一个协议, 形成脂质双层使用接触气泡双层法。水泡被吹入有机溶剂, 藉以单层被形成在水油接口。两个移液器纵 , 以停靠气泡 , 形成一个双层。
接触气泡双层法是传统脂质双层的替代技术。这种方法允许通过膜进行更通用的振动。CBB 方法集成了平面脂层和贴片夹紧方法的益处。
作为脂质双层技术，可以形成具有任意脂质组合物的CBB。我们开发了用于高信道电流录制的 CBB，具有高信噪比。这种方法允许各种膜振动，并提供一个广泛的类型平台，以通道膜接口。
每个人都经历过吹肥皂泡的经历。通过手动微调施加的压力而不是通过嘴吹，对 CBB 形成采取类似的操作。练习和享受CBB。
以此程序，在圆底烧瓶中以所需浓度将氯仿中的磷脂分散。将磷脂溶液放在连接到氮气瓶的旋转蒸发器上。在室温下旋转烧瓶，直到出现薄磷脂膜。
接下来，将打开的烧瓶放入连接到真空泵的干燥器中。使用真空泵吸气干燥器内部数小时，彻底去除氯仿。随后，在烧瓶中加入适当体积的电解质溶液，并悬浮磷脂，每毫升磷脂悬浮液获得两毫格里。
使用沐浴声波器将悬浮液进行 20 到 30 秒的悬挂，以获得多层囊泡悬浮液。对于含有离子通道蛋白的蛋白体体制备，在多层囊泡悬浮液中加入蛋白质溶液。并使用沐浴声波器进行几秒钟的声波。
要准备大孔玻璃移液器，请将玻璃毛细管放在移液器拉拔器中，并通过两步拉拔用细锥形尖端制造微移管。然后将微管放在微锻造上，将微管的尖端接触到直径为 30 至 50 微米的锥形部分的铂丝。短暂加热灯丝并立即将其关闭。
使用蒸馏水和乙醇用浅井清洁玻璃滑梯的表面。接下来，将硅化试剂涂抹在玻璃幻灯片上，让试剂在空气中完全干燥。然后将玻璃滑梯放在倒置显微镜的舞台上。
在硅化玻璃滑梯的浅井中加入100微升六烷。使用结核素注射器填充电解质溶液，其长度高达微管的一半。接下来，将微移子设置在带压力口的微管支架上，使银/氯化银线电极浸泡在移液器电解质溶液中。
将其中一个微管支架连接到贴片夹放大器的头部阶段，将另一个微管支架连接到电气接地。随后将微控制器连接到微管支架的压力端口。使用微操纵器将微管调整到倒置显微镜舞台上方的适当位置。
要调整电极偏移电位，请将用于填充微管的相同电解质溶液的微升放在玻璃滑梯浅井周围的平坦表面上，以创建电解质圆顶。将两个微管的尖端浸泡在电解质圆顶中。随后调整贴片夹放大器的电极偏移电位。
要从尖端绘制脂体溶液，请将一微升脂体溶液添加到滑动玻璃浅井周围的平坦表面上。接下来，将微移器的尖端放在含圆顶的脂体中。使用微反应器吸气含有含脂素的溶液。
重复其他和平石对吸气通道重组脂质体的过程。现在把微管放在浅井的六角体里。通过增加压力缓慢吹吹水泡，直到气泡达到所需尺寸，并随后保持相同的压力。
如果难以保持气泡大小稳定，则通过油空气接口通过尖端来丢弃气泡。重复这些过程，直到形成两个稳定的气泡。在两个气泡之间建立接触。
微调压力以保持气泡大小，因为即使在恒定的气泡内压力下，大小也可能逐渐改变。使用贴片声明放大器将膜电位设置为适当的值，并等待通道电流的出现。为了稳定的脂质双层层形成，清洁印迹器至关重要。
玻璃毛细管或移液器制备应彻底清洗，避免被洗涤剂分子污染。一旦CBB形成通道分子，无论是水溶液或脂体，在几到几十分钟内被自发地插入到双层体中。通道的插入通过应用膜电位下电流振幅的明智增加得到确认。
CBB 方法形成的双层层可以分解为两个单层。pTB 通道电流在连接两个单层后立即出现。电流变大，因为接触增加了电流的振幅与CBB的分离连接操作同步。
如果气泡的吹出数量增加水溶液中的脂质浓度降低，并且单层未形成。然后尝试减轻脂体部分的压力。一旦CBB形成和通道重组建立，你可以尝试改变水溶液和膜的成分通过大量或注射亲水或疏水物质。
CBB 方法为探索通道膜相互作用开辟了多种途径。
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概述
本研究介绍了形成脂质双层的接触气泡双层（CBB）方法，为传统技术提供了一种创新的替代方案。该方法能够实现多样的膜振动，并提供高信噪比的单通道电流记录，从而增强了对通道-膜相互作用的研究。
研究的主要组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 电生理学
- 脂质膜技术
背景
- 脂质双层对于研究膜蛋白至关重要。
- 传统方法在灵活性和稳定性方面存在限制。
- CBB方法融合了平面脂质双层和膜片钳技术的优点。
- 该技术促进了离子通道活动的高质量记录。
研究目的
- 开发一种使用接触气泡方法形成脂质双层的稳健方法。
- 实现具有改进质量的单通道记录。
- 探索膜动力学和通道-膜相互作用。
所用方法
- CBB方法利用在有机溶剂中控制水泡的操纵来创建双层。
- 磷脂被制备和超声处理以形成多层囊泡，随后加入离子通道蛋白。
- 制造微量移液器，以在双层形成过程中精确应用和稳定气泡。
- 实验设置涉及使用膜片钳放大器监测双层形成后的离子通道电流。
主要结果
- CBB方法有效地支持通道蛋白插入双层，通过电流幅度的变化得到证实。
- 形成了稳定的双层，展示了记录单通道电流的能力。
- 该方法表明气泡大小的调整可能影响膜的稳定性和电流的连续性。
结论
- CBB方法在脂质双层形成方面呈现出显著的进步，使电生理学研究能够进行多样化的应用。
- 这种创新方法增强了我们对通道-膜动力学的理解。
- 研究结果强调了适应各种实验条件的脂质双层技术的潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
