基于多色流式细胞仪的 t 细胞线粒体和溶酶体的定量
January 9th, 2019
本文说明了一种对活细胞中线粒体或溶酶体进行量化的有力方法。将溶酶体或线粒体特异性染料与针对表面标记物的荧光共轭抗体结合使用, 可以通过使用多色流式细胞术。
该方法可以帮助我们回答免疫代谢领域的关键问题。这种技术的优点是，它允许在不同细胞类型的复杂混合物中对单个活细胞中的线粒体或解索体进行定量。这种研究T和B细胞的方法也可以应用于许多其他细胞类型，如巨噬细胞，树突状细胞，或从组织样本中收获的任何初级细胞。
这个程序将由我实验室的研究生魏钦文演示。要标记细胞器进行定量，首先，将十倍添加到第六个小鼠T细胞中，每个标记的一个圆底传真管中。通过离心对细胞进行造粒。
预热至37摄氏度无血清培养基，稀释细胞器特异性探针库存溶液，最终在培养基中工作浓度。并每管将100微升探针染料的细胞重新悬浮。接下来，在细胞培养培养箱中孵育细胞，以适当的染色期，每管用一毫升的冰冷传真缓冲液停止孵化结束时的反应。
然后，用另一种离心收集细胞，并在冰上预滴答的24G2杂交上先液的100微升中重新悬浮颗粒。十分钟后，每管添加一毫升传真缓冲液。通过离心收集细胞，并标记细胞与50微升的预滴定荧光结合抗体鸡尾酒的兴趣。
根据表格添加适当的浓度。和传真缓冲20分钟的冰上，防止光。在孵育结束时，每管添加一毫升传真缓冲液。
通过离心收集细胞。并在300微升传真缓冲液中重新悬浮细胞，并辅以每毫升碘化铀1微克。添加核和染色体计数器后，立即打开流式细胞仪分析计算机、流式细胞仪、传真采集软件以及任何其他附件设备，具体取决于机器平台。
通过系统运行 PBS 约一分钟，以确保流线充满 PBS 和 sheathe 缓冲区。打开新实验，根据制造商的说明设置圆度计参数。通过70微米细胞滤株过滤细胞。
并在采集每个样品之前出现涡流，以避免团团和双层形成。打开"自动补偿"设置，并为每个荧光参数创建点图。设置所有电压后，调整补偿并应用补偿对样品。
创建向前散射与侧散射图并优化电压，以便感兴趣的单元出现在图中。创建向前散射与向前散射高度图，并门控单个单元。创建一个向前散射区域与侧散射区图，并门对淋巴细胞。
创建一个向前散射区域与碘化铀图，并门对活细胞。设置所有电压后，调整补偿并应用补偿对样品。然后加载第一个样本管，创建适当的细胞表面标记图，并收集至少 1，000 个感兴趣的总体事件。
运行所有示例后，导出流数据以进行后续分析。将实验保存为模板，以保留未来类似实验的细胞计设置和参数。最终位点线粒体含量为双负一T细胞中最低的，双负一T细胞的峰数为双负二、三，双负四阶段略有下降。
双阳性胸腺细胞显示线粒体数量高于CD4和CD8单阳性胸腺细胞，表明线粒体含量在发育过程中波动。CD4 和 CD8 单阳性胸腺细胞表现出比单体 CD4 或 CD8 T 细胞更高的线粒体平均荧光强度，这表明在富氧血液环境中再循环的天真 T 细胞的线粒体质量甚至比胸腺细胞低。有趣的是，这种线粒体含量的减少在CD8中比CD4 T细胞系更加突出，T细胞激活进一步减少了这些细胞器的存在。
在所有胸腺细胞群中观察到相对较低但可检测的利索马血素含量，在双阴性一个胸腺细胞中存在更突出。在外围，在记忆和效应CD8阳性T细胞中检测到相对大量的利索索姆。将细胞器特异性染料和表面标记物与流式细胞学相结合，是描述复杂混合物中细胞代谢状态的有力方法。
额外的细胞器特异性染料可用于检测内质神经，自噬性气囊，或其他细胞内感兴趣的隔间。
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概览
本文介绍了一种在活细胞中量化线粒体或溶酶体的强大方法。该技术允许在不同细胞类型的复杂混合物中对单个活细胞中的这些细胞器进行量化。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 免疫学
- 代谢
背景
- 细胞器的量化对理解细胞功能至关重要。
- 这种方法可以应用于各种细胞类型，包括T细胞和B细胞。
- 它利用溶酶体或线粒体特异性染料，结合荧光标记的抗体。
- 采用流式细胞术进行分析。
研究目的
- 提供一种在混合细胞群体中量化细胞器的方法。
- 增强对免疫代谢的理解。
- 展示该技术在组织样本的原代细胞中的应用。
使用的方法
- 在圆底法管中准备小鼠T细胞。
- 离心以使细胞成为沉淀。
- 用特定染料标记细胞器。
- 使用多色流式细胞术进行分析。
主要结果
- 该方法可以精确量化线粒体和溶酶体。
- 它在区分不同细胞类型方面有效。
- 展示了对各种原代细胞的适用性。
- 促进免疫代谢研究。
结论
- 这种技术是研究细胞器的有价值工具。
- 它提供了细胞代谢状态的洞察。
- 未来的应用可能扩展到细胞生物学的其他领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying mitochondrial and lysosomal dynamics in T cells provides critical insights into immuno-metabolic reprogramming during immune responses. This method enables high-resolution, single-cell analysis of organelle content within heterogeneous populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. By linking organelle metrics to functional states, it enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial and lysosomal flux to T cell differentiation and activation states.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative organelle readouts that reflect metabolic fitness.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying metabolic vulnerabilities in pathogenic T cell subsets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline organelle metrics in primary T cells.
- Reproducibility: Standardizes organelle quantification via flow cytometry, enabling consistent readouts across screening campaigns.
- Scalability: Supports multiplexed analysis of organelle content alongside surface markers for high-content phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial and lysosomal dynamics to T cell-mediated pathologies in autoimmune and cancer models.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase metabolic profiling with preclinical validation of immunomodulatory candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating organelle shifts with functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling metabolic phenotyping as a filter for immunomodulatory activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying organelle responses to genetic or pharmacological perturbations in T cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for lysosomal and mitochondrial content that are compatible with flow cytometry-based screening platforms.
- Analytics: Generates mean fluorescence intensity and percentage-positive metrics that allow comparison of metabolic states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects organelle metrics to preclinical continuity by tracking metabolic adaptation in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry panel for immunometabolic profiling across multiple projects and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in T cell metabolic regulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through standardized dye protocols and compensation controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying metabolically compromised or hyperactive T cell states early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their impact on mitochondrial and lysosomal homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design and organelle-specific dye titration.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient fluorescence channels for multiplexed organelle and surface marker detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-lymphoid primary cells or tissue-derived samples.
- Limited by the availability and specificity of organelle dyes, which may require validation in new model systems.
