Drosophila Melanogaster 中病毒感染的建立及宿主-病毒相互作用分析

该方法有助于解答病毒-宿主相互作用领域中的关键问题，例如如何在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中有效建立病毒感染。这种纳米注射方法能够精确控制病毒感染剂量，并可轻松应用于其他微生物病原体的感染研究。首先，在25°C条件下，将每毫升含一乘十的七次方个活性S2*细胞的细胞悬液，以10毫升完全Schneider果蝇培养基接种于10厘米细胞培养皿中，培养一小时，形成疏松的半贴壁单层细胞，无需额外添加二氧化碳。

孵育期间，将新解冻的果蝇C病毒（Drosophila C Virus，DCV）用1毫升完全培养基重悬，使其感染复数为0.01，并将病毒溶液加入细胞培养皿中。然后将培养板放回25°C培养箱中继续孵育3至5天。当细胞形态变得模糊、培养基中充满黑色颗粒（提示细胞碎片）时，病毒即可收集。

将细胞培养物全部转移至15毫升离心管中，于-80摄氏度裂解宿主细胞前，先用移液器反复吹打上清液数次。为制备病毒工作浓度，将细胞悬液在25摄氏度水浴中振荡解冻，随后通过离心去除细胞碎片。然后将上清液转移至新的无菌15毫升离心管中，涡旋混匀，并每管分装最多200 µL病毒溶液。

为了确定平均病毒组织培养感染剂量，首先将每100微升完全培养基中接种5×10⁴个S2*细胞，每列8个孔，共12列，置于96孔板中。然后将该板放回25°C培养箱中。从-80°C保存条件下随机选取5管病毒。

在细胞沉降的同时，将10个无菌的1.5毫升微量离心管各加入450微升无菌完全培养基，并向第一个含有450微升无菌完全培养基的1.5毫升管中加入50微升病毒原液，逐管进行10倍梯度稀释至第12孔。孵育结束后，将每种稀释度的50微升分别加入对应病毒管的各列相应孔中，每列另设一孔加入50微升不含病毒的培养基作为阴性对照孔。随后将培养板置于25摄氏度培养箱中培养三天，每天在20倍明场显微镜下观察各病毒原液的细胞病变效应。

将细胞形态模糊且培养基中充满碎片的孔判定为阳性孔，将细胞形态正常的孔判定为阴性孔。在交配前，将400微升浓度为50微克/毫升的四环素与4克新鲜的标准玉米粉果蝇食物充分混合，并将食物置于4摄氏度环境下过夜，以挥发乙醇。次日早晨，将食物恢复至室温，然后将食物、20只雌性及10只雄性新羽化的成年果蝇放入一个繁殖小瓶中，在25摄氏度、60%湿度及正常明暗循环条件下进行为期三至四天的繁殖培养。

当产卵数量足够后，在轻微的二氧化碳气流下收集新羽化的成虫，并按照上述方法再次繁殖果蝇，重复两代。经过三代四环素处理后，在轻微的二氧化碳气流下收集五只果蝇，加入250微升双蒸水和数颗0.5毫米无菌陶瓷珠，将果蝇匀浆。一分钟后，向样品中加入250微升2倍浓度缓冲液A，涡旋混匀，随后将样品置于-80摄氏度冰箱中冷冻保存。

接下来，将样品从–80 °C冰箱中取出，在25 °C水浴中快速解冻，随后在70 °C水浴中孵育30分钟，然后根据标准方案提取基因组DNA，并通过聚合酶链式反应扩增DNA。根据标准方案，通过凝胶电泳确认每份果蝇匀浆中不存在沃尔巴克氏体16S小RNA和wsp。随后，如示例所示，将无沃尔巴克氏体的果蝇品系饲养在标准玉米粉果蝇培养基上。

进行病毒感染实验时，首先使用体视显微镜和细镊子将玻璃毛细管针头的尖端折断至适合纳米注射的适当直径。组装注射器时，将顶盖O形环和白色垫片套在注射器金属推杆上，确保较大的凹面朝外。使用装有30号针头的注射器将矿物油注入玻璃针中，然后将针穿过针筒套管。

将较大的 O 型圈放置在针头钝端约一毫米处的套管底部，并将针头安装到注射器的推杆上。固定针头与推杆连接处，按下空按钮，推动显微注射器的推杆直至听到可听见的信号。然后按填充按钮，将推杆回缩五毫米，并将针头浸入含有 100 个噬斑形成单位的病毒悬液中。

轻轻摇动一个或至少三个装有20只无沃尔巴克氏体（Wolbachia-free）雄性果蝇的西林瓶，将果蝇转移至注射培养皿中。在交配过程中，雄性果蝇更具交配优势，且其繁殖能力可能影响雌性。随后，在每只果蝇中胸侧板与翅侧板之间颜色略浅的区域，向其胸部注射50.6纳升病毒溶液，并通过细胞病变效应检测法及定量RT-PCR法，对研磨后的果蝇样本进行DCV载量测定，方法如前所述。

注射后，小心将果蝇转移到新的培养管中，并将培养管水平放置，以防止果蝇在麻醉恢复期间粘附于培养基上。注射过程耗时较长，但DCV的复制非常迅速，因此在每管果蝇全部注射完成后，立即在管壁上记录准确的注射时间至关重要。病毒感染可诱导细胞裂解，并在感染后三天观察到细胞病变效应。

如所示，可使用 Wolbachia 的 16S rRNA 和 wsp 引物来检测 Wolbachia 和果蝇的存在。经检测无 Wolbachia 的果蝇在感染 DCV 后存活率显著降低，且呈剂量依赖性。DCV 会激活宿主中的抗病毒信号通路，这些通路对果蝇抵抗病毒感染至关重要，这一点在 Dicer-2 突变果蝇中表现为存活率降低和病毒载量升高。

在进行该实验操作时，需要注意沃尔巴克氏体（Wolbachia）基因型的污染可能会影响黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）对DCV感染的易感性。完成该操作后，可进一步开展更大规模的遗传筛选等其他方法，以探究在病毒侵染或抗病毒反应中所需的特定宿主基因。该技术建立后，为研究人类病毒性疾病的研究人员提供了利用黑腹果蝇模型探索地方性人类病毒感染暴发机制的新途径。

请注意，操作病毒可能具有极高危险性，在进行本实验时，务必采取佩戴适当防护装备等预防措施。