Name: 果蝇病毒感染的建立及宿主病毒相互作用分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习利用纳米注射技术在黑腹果蝇中建立病毒感染并分析宿主病毒相互作用的方法。该技术可精确控制病毒剂量，适用于研究病毒宿主动态及抗病毒机制。

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我们感谢中国科学院植物生理生态研究所潘实验室全体成员。感谢中国科学院植物生理生态研究所王兰凤博士提供实验协助，感谢Springer Nature的Gonalo Cordova Steger博士、巴黎居里研究所的Jessica VARGAS博士和Seng Zhu博士提出的宝贵意见。本研究得到了中国科学院战略性先导科技专项对L.P（XDA13010500）和H.T（XDB29030300）的资助，以及国家自然科学基金对L.P（31870887和31570897）及J.Y（31670909）的资助。L.P为中国科学院青年创新促进会会员（2012083）。

注意：实验开始前，所使用的细胞系和果蝇品系必须未被其他病原体污染，尤其是DCV、FHV、黑腹果蝇X病毒（DXV）和禽类肾炎病毒（ANV）等病毒。理想情况下，应通过RNA测序或更简单的基于PCR的鉴定方法来检测污染情况10,45。一旦发现污染，在彻底去污染之前，不应继续使用这些细胞系和果蝇品系46。
1. 病毒与果蝇的制备
<ol>
	<li>病毒扩增与收集 
	注意： 果蝇 S2*细胞用于DCV的增殖与滴定。S2*细胞系源自晚期胚胎的原代培养 D. melanogaster 胚胎。该细胞系此前已有详尽描述47.
	<ol>
		<li>在25 °C下，使用Schneider's Drosophila培养基培养S2*细胞，无需额外添加CO2，以1 × 10⁶细胞/10 cm培养皿的密度接种于10 cm细胞培养皿中，形成疏松、半贴壁的单层细胞7 活细胞数/mL。S2*细胞使用完全培养基：Schneider’s果蝇培养基，含10%热灭活胎牛血清、100单位/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。 
		注意：健康细胞应呈圆形，且大小均一。</li>
		<li>从 -80 °C 快速解冻 DCV 储存液，置于 25 °C 水浴中。立即以 MOI = 0.01 感染 S2* 细胞，将 1 mL 病毒溶液直接加入细胞培养皿（生长面积：55 cm²）中。2用 10 mL S2* 细胞完全培养基重悬。</li>
		<li>在25 °C下培养细胞3至5天。当病毒准备收集时，细胞形态异常（细胞形状模糊），培养基中充满黑色颗粒，表明存在细胞碎片。</li>
		<li>用移液器反复吹打，收集全部细胞培养物至15 mL离心管中，于-80 °C冷冻保存（可保存长达一年）。 
		注意：DCV 在 -80 °C 条件下可长期保存长达一年，感染性损失极小。</li>
		<li>在25 °C水浴中振荡解冻细胞培养物，随后于4 °C以6,000 × g离心15分钟。将上清液收集至无菌15 mL离心管中并涡旋混匀。每管分装最多200 μL病毒溶液。 
		注意：病毒分装样品可在 4 °C 下短期保存，最长 3 天，或在 -80 °C 下保存最长 1 年。应避免反复冻融。建议始终一次性使用全部分装样品。</li>
		<li>随机选取5个含病毒的试管，通过细胞病变效应（CPE）实验测定平均病毒组织培养感染剂量（TCID50）（TCID50的1个单位）50= 0.7 空斑形成单位 [PFU] 
		注意：CPE 指由病毒感染引起的宿主细胞结构变化。感染病毒可导致宿主细胞裂解，或因细胞失去增殖能力而发生非裂解性死亡。48.
		<ol>
			<li>第1天，用移液器收集制备好的S2*细胞，计数细胞数量。以300 × g离心4分钟，弃上清液。将细胞稀释至密度为1 × 106 细胞/mL，使用S2*细胞的完全培养基，具体步骤见1.1.1。</li>
			<li>接种 1 × 105 将S2*细胞以每孔100 μL接种至平底96孔板（约30%汇合度）。</li>
			<li>用S2*细胞的完全培养基对DCV原液进行10倍系列稀释。将50 µL稀释液加入孔中。向被归类为阴性对照孔的孔中加入50 µL不含病毒的培养基。 
			注意：每个稀释度使用8个孔。由于典型的DCV产量约为108-109 PFU/mL，稀释度应至少覆盖 ~10-5-10-10.</li>
			<li>第4天，使用20倍或40倍物镜在明场显微镜下观察细胞病变效应（CPE）。将细胞形态模糊且培养基中充满碎片的孔判定为 &#34;阳性孔&#34;，将细胞形态正常的孔称为“阴性孔”。</li>
			<li>用“+”或“–”分别标记细胞病变效应（CPE）阳性或阴性孔。计算病毒的TCID50 按Reed和Muench法49.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所有受污染的材料和手套丢弃至去污盘中。若病毒无法达到预期的TCID50，将100 mL病毒溶液在4 °C下以68,000 x g离心1小时进行浓缩。 
		注意：根据实验目的，可使用从10开始的一系列剂量2 至 106 TCID50 单位可用于病毒感染。通常，我们使用 3 x 106 TCID50 单位</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 7.2）重悬。每管分装20 μL病毒溶液，于-80 °C保存。随机选取5管测定病毒平均TCID50 再次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇感染前处理 
	注意：共生细菌 Wolbachia 可抑制多种RNA病毒感染昆虫30,31,32,33,41因此，彻底清除至关重要 Wolbachia 在研究宿主-病毒感染之前，先从果蝇中分离 体内33.
	<ol>
		<li>在4克新鲜的标准玉米粉果蝇食物中加入400 μL浓度为50 µg/mL的四环素（溶于70%乙醇），制备含四环素的果蝇食物（每升食物含77.7 g玉米粉、32.19 g酵母、10.6 g琼脂、0.726 g CaCl₂）。2，31.62 克蔗糖，63.3 克葡萄糖，2 克山梨酸钾和 15 毫升 5% C8H8O3）。充分混匀，将食物置于4 °C过夜，以蒸发乙醇。 
		注意：高剂量乙醇可能影响果蝇的生育能力，因此切勿省略此步骤。</li>
		<li>将食物升温至室温，放入新羽化的成年果蝇（20只雌性与10只雄性）于试剂瓶中。在25 °C、60%湿度及正常明暗循环条件下培养果蝇。 
		注意：通常情况下，果蝇需要 3-4 天才能产下足够的卵。卵的数量过多会抑制幼虫发育，并降低四环素的效率。</li>
		<li>收集羽化后3~5天内的成年果蝇，置于轻微的CO气流下2，并重复步骤 ~1.2.1-1.2.2。通常需要至少 3 代才能完全消除 Wolbachia.</li>
		<li>经过三代四环素处理后，在微弱的二氧化碳气流下收集5只果蝇2 对于 Wolbachia 感染检测。将果蝇与250 μL双蒸水（ddH₂O）混合，研磨1分钟。2O）以及几粒0.5 mm无菌陶瓷珠置于1.5 mL离心管中，使用匀浆器进行处理。向样品中再加入250 μL 2×缓冲液A（0.2 M Tris-HCl，pH 9.0；0.2 M EDTA；2% SDS），涡旋混匀。 
		注意：由于SDS会阻碍磁珠移动，因此不能直接使用1×缓冲液A研磨果蝇。如果果蝇具有红眼，研磨前应去除头部，因为这可能影响DNA产物的颜色。</li>
		<li>将样品在 -80 °C 冻存（可保存长达一年）。从 -80 °C 取出后，立即在 25 °C 水浴中快速解冻，直至完全溶解。将样品在 70 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入190 μL 5 M KOAc，涡旋混匀，冰上孵育15分钟或更长时间。</li>
		<li>在室温下以13,000 × g离心样品5分钟，收集上清液并转移至新管中。</li>
		<li>重复步骤 1.2.7 以获得质量更高的 DNA。</li>
		<li>向每个样品中加入 750 μL 异丙醇，用手轻轻颠倒混匀数次。室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>在室温下以13,000 × g离心样品5分钟，弃去上清液。管底可见白色基因组DNA沉淀。</li>
		<li>向沉淀中加入1 mL 70%乙醇，于13,000 × g离心5分钟，弃去上清液。将DNA空气干燥至透明。</li>
		<li>将DNA溶解于100 μL ddH₂O中2使用紫外-可见吸收光谱法滴定DNA浓度，并将DNA稀释至100 ng/μL。</li>
		<li>使用200 ng DNA进行PCR反应（20 μL体系，参见 材料表)。在热循环仪中进行PCR，程序如下：95 °C 预变性15 min；36个循环：95 °C 变性45 s，50 °C 退火45 s，72 °C 延伸1 min；最后72 °C 延伸1 min。 
		注意：根据沃尔巴克氏体（Wolbachia）16S rRNA，使用以下引物：5’ TGAGGAAGATAATGACGG 3’（正向）和 5’ CCTCTATCCTCTTTCAACC 3’（反向）。针对wsp基因，引物为5’ CATTGGTGTTGGTGTTGGTG 3’（正向）和5’ ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3’（反向）。</li>
		<li>使用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。PCR产物的大小为 Wolbachia 16S rRNA 和 wsp 分别为约200 bp和600 bp。</li>
		<li>后部 Wolbachia 在标准玉米粉果蝇培养基上饲养无菌果蝇品系。收集羽化后3-5天的雄性果蝇用于感染实验。 
		注意：四环素处理可能影响肠道微生物群组成，进而影响宿主的抗病毒反应。我们建议所有果蝇均接受相同的四环素处理。将无沃尔巴克氏体（Wolbachia-free）的果蝇在标准条件下培养至少3代，以恢复其肠道微生物群。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pastrel 基因分型 
	注意：S 或 R 等位基因的存在与否 pst 基因在遗传背景中已被报道会影响DCV感染 果蝇34,35有必要检查 pst 基因型，尤其是对于DCV感染。存在少数SNPs pst 可能影响病毒感染的单核苷酸多态性中，主要的是512C/T。温度梯度PCR是鉴定该位点的快速方法。 pst 基因型
	<ol>
		<li>按照上述方法（步骤 1.2.4 - 1.2.15）提取果蝇基因组 DNA。</li>
		<li>使用100 ng DNA作为模板，采用512C引物（正向引物5’ CAGCATGGTGTCCATGAAGTC 3’，反向引物5’ ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3’）检测R等位基因，采用512T引物（正向引物5’ CAGCATGGTGTCCATGAAGTT 3’，反向引物5’ ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3’）检测S等位基因。</li>
		<li>设定Tm（熔解温度）梯度如下：54 °C、54.7 °C、55.5 °C、58 °C、59.7 °C、62.2 °C、63.7 °C 和 64 °C（每个温度保持45秒）。 
		注意：建议进行30个PCR循环反应（20 μL体系）。</li>
		<li>通过2%琼脂糖凝胶电泳观察100 bp的PCR产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 病毒感染在 果蝇
<ol>
	<li>通过纳米注射感染果蝇并进行生存率测定。
	<ol>
		<li>拉制毛细管以制备注射针，用油从后方填充注射针，并按照先前描述的方法组装注射器50。</li>
		<li>在轻微的CO2气流下将果蝇麻醉，通过胸腔内注射44注入50.6 nL病毒溶液（100 PFU，用Tris-HCl缓冲液pH 7.2稀释）。每组至少注射3管果蝇（每管20只果蝇）。 
		注意：注射过程耗时较长（通常每小时约100只果蝇），且DCV复制非常迅速，因此在完成每管（20只）注射后立即在管上记录准确时间至关重要。仅注射缓冲液的组设为模拟对照。通常优先选用雄性成年果蝇，因为与雌性相比，其结果更稳定、可重复性更高，而雌性在交配和繁殖过程中激素水平的变化可能影响实验读数51。</li>
		<li>将注射后的果蝇置于25 °C、60%湿度及正常光/暗循环条件下培养。每天提供新鲜食物，并记录死亡果蝇数量。</li>
		<li>至少进行3次生物学重复实验，并绘制生存曲线。</li>
		<li>对生存数据进行统计分析时，使用统计软件生成Kaplan-Meier生存曲线。采用log-rank检验计算P值。在生存表中输入每个个体的信息，软件将自动计算各时间点的存活百分比，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。 
		注意：切勿在试管中额外添加酵母。与模拟对照组相比，感染DCV的果蝇偶尔会出现腹水且行动笨拙，容易被粘性酵母困住。建议在预实验中设置更多时间点，以确定感染果蝇大规模死亡发生的时间窗口。通常情况下，即使在Dcr-2突变品系中，感染果蝇在前两天内极少死亡。对于感染100 PFU DCV的无Wolbachia的w1118（Bloomington 5905）果蝇，该时间段通常在感染后3–5天左右。注射后0.5小时内死亡的果蝇不应计入死亡数，因其可能死于针头损伤而非病毒感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过CPE法测定DCV载量 
	注意：病毒载量的测定方法与病毒原液滴定（步骤1.1.6）类似，但需要额外的样品处理步骤（步骤2.2.1–2.2.4）。
	<ol>
		<li>第1天，按照步骤2.1.1–2.1.2所述方法感染雄性果蝇。将注射后的果蝇按20只为一组分组，在新鲜果蝇食物上继续培养所需时间（通常为24小时或3天）。每天提供新鲜食物。</li>
		<li>第2天，按照步骤1.1.1所述方法，将Drosophila S2*细胞接种至10 cm细胞培养皿中，密度约为5 × 106 至 1 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>第3天，在轻微CO2气流下收集5只果蝇，置于含200 μL Tris缓冲液和陶瓷珠的1.5 mL离心管中，使用匀浆器高速研磨30秒。样品可储存于-80 °C，或立即进入下一步操作。</li>
		<li>充分涡旋样品。使用1 mL注射器和0.22 μm滤膜将上清液过滤至新的1.5 mL离心管中。随后按照步骤1.1.6.1–1.1.6.5所述方法进行滴定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过qRT-PCR法测定DCV载量
	<ol>
		<li>第1天，按上述方法感染果蝇。将注射后的雄性果蝇（每组20只）分组，在新鲜果蝇食物上培养至所需时间（通常为24小时或3天）。每天提供新鲜食物。</li>
		<li>第3天，在轻微CO2气流下收集5只果蝇，放入含200 μL裂解缓冲液和20颗陶瓷珠（直径=0.5 mm）的1.5 mL离心管中，使用匀浆器高速研磨30秒。每管再加入800 μL裂解缓冲液，样品可储存于-80 °C，或立即进行RNA提取和qRT-PCR。</li>
		<li>准备无RNase的枪头、离心管以及去离子、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理并经0.22 µm膜过滤的水。向样品中加入200 μL氯仿（≥99.5%），手动剧烈振荡15秒。室温孵育5分钟或更长时间，直至水相与有机相明显分离。 
		注意：氯仿具有极高危险性，操作时必须格外小心。切勿涡旋样品，以免增加DNA污染风险。</li>
		<li>在4 °C条件下以13,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>吸取400 μL上清液转移至新离心管中，加入等体积异丙醇（≥99.5%），手动轻轻颠倒混匀20次，室温沉淀10分钟或更长时间。 
		注意：在-20 °C沉淀可提高RNA得率。</li>
		<li>在4 °C条件下以13,000 × g离心10分钟。可见管底有白色RNA沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL 70%乙醇（乙醇溶于DEPC水），轻轻颠倒数次以洗涤RNA。</li>
		<li>在4 °C条件下以13,000 × g离心5分钟。弃去上清液，将RNA干燥5–10分钟，直至RNA变为透明。</li>
		<li>向样品中加入50 μL DEPC水，用移液器吹打数次并涡旋。</li>
		<li>取3 μL RNA用于测定RNA浓度。在260 nm波长下定量RNA。通常情况下，本方案提取的RNA浓度约为100–500 μg/μL，适用于cDNA合成。</li>
		<li>使用2 μg RNA进行cDNA合成。用ddH2O稀释至100 μL，储存于-20 °C。</li>
		<li>按照试剂盒说明书进行qRT-PCR操作并运行qRT-PCR。 
		注意：在本实验中，用于DCV cDNA合成时，随机引物的效果明显优于Poly A引物。DCV mRNA表达水平以内源性核糖体蛋白49（rp49）mRNA为参照进行标准化。本部分所用寡核苷酸引物如下：rp49 5’ AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3’（正向）和 5’ CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3’（反向）；DCV：5’ TCATCGGTATGCACATTGCT 3’（正向）和 5’ CGCATAACCATGCTCTTCTG 3’（反向）；vago：5’ TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3’（正向）和 5’ AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3’（反向）；病毒诱导RNA 1（vir-1）：5’ GATCCCAATTTTCCCATCAA 3’（正向）和 5’ GATTACAGCTGGGTGCACAA 3’（反向）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文详细介绍了一种利用纳米注射技术在成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中建立病毒感染系统的详细实验流程。该方法包括合适的果蝇品系和病毒原液的制备、感染操作技术、感染指标的评估以及抗病毒反应的检测。尽管本文以双链RNA病毒（DCV）作为病毒病原体的示例，但已有数十种不同类型的病毒成功应用于果蝇系统的研究。此外，通过在果蝇中进行的大规模筛选，已鉴定出数百种来自病毒或宿主的调控因子。因此，该方法具有高度的可适应性，并不仅限于DCV与Drosophila之间的相互作用研究。
为了成功扩增并收获高滴度的DCV，必须采取一些预防措施。细胞应保持健康状态，以适当的密度培养，并及时收获。减少细胞培养体积对病毒滴度无显著影响。通常，以MOI=0.01感染107个细胞，最终可获得约108-109 TCID50的DCV，足以满足大多数in vivo和in vitro实验的需求。本方案中描述了通过CPE实验和qRT-PC...

新发病毒性感染，尤其是虫媒病毒引起的感染，例如 的 基孔肯雅病毒1，登革病毒，黄热病毒2 和寨卡病毒病毒3，已通过引发大流行对公共健康构成巨大威胁4因此，深入了解病毒与宿主之间的相互作用对于控制传染病及治疗人类病毒性疾病变得愈发重要。为实现这一目标，必须建立更为恰当且高效的模型，以研究病毒感染背后的机制。
果蝇 Drosophila melanogaster (D. melanogaster) 是研究病毒与宿主相互作用的有力体系5,6，已被证明是研究人类病毒性疾病的最高效模型之一7,8,9。其高度保守的抗病毒信号通路以及无与伦比的遗传工具，使果蝇成为获得对人类抗病毒研究具有实际意义成果的理想模型。此外，果蝇在实验室中易于饲养且成本低廉，便于在病毒感染过程中对病毒和宿主中新的调控因子进行大规模筛选6,10。
四种主要的高度保守的抗病毒通路（例如，RNA干扰（RNAi）通路11JAK-STAT 信号通路12NF-κB 通路和自噬通路13）在研究中已有充分探讨 果蝇 近年来6RNAi 通路是一种广泛的抗病毒机制，能够抑制大多数类型的病毒感染6,14. 通过突变破坏该通路中的基因，例如 Dicer-2 (Dcr-2) 或 Argonaute 2 (AGO2) 可导致病毒滴度升高和宿主死亡率增加15,16,17JAK-STAT 通路已被证实在控制病毒感染方面发挥作用，该病毒属于 Dicistroviridae 家族和 黄病毒科 昆虫中的科 例如，果蝇中的果蝇C病毒（DCV）16 以及蚊子中的西尼罗病毒（WNV）和登革病毒18,19。该 黑腹果蝇 Toll通路（与人类NF-κB通路同源）和免疫缺陷（IMD）通路（类似于人类NF-κB和TNF通路）均参与抵御病毒感染20,21,22自噬是另一种参与调控病毒感染的保守机制，该机制在 果蝇23,24因此，可轻松建立用于鉴定这些通路中的新型调控因子，并解析抗病毒信号通路与其他生物通路（如代谢、衰老、神经反应等）之间相互串扰的实验体系 黑腹果蝇 系统。
尽管大多数已建立的病毒性感染模型在 果蝇 由RNA病毒诱导，无脊椎动物虹彩病毒6型（IV-6）和Kallithea病毒的感染已显示出在果蝇中研究DNA病毒的潜力25,26此外，该病毒还可被改造以允许感染 果蝇，例如 流感病毒9。这极大地拓展了该技术的应用范围 果蝇 筛选平台。在此流程中，我们以DCV为例，描述如何构建病毒感染系统 果蝇DCV 是一种正义单链 RNA 病毒，基因组长约 9300 个核苷酸，编码 9 种蛋白质27. 作为一种天然病原体 D. melanogaster，DCV被认为是在宿主-病毒相互作用及共同进化过程中研究宿主生理、行为和基础免疫反应的合适病毒28此外，野型果蝇在感染后迅速出现死亡率，这使得DCV可用于筛选宿主中与抗性或易感性相关的基因29.
然而，在研究病毒感染时存在若干值得关注的方面 果蝇例如，共生细菌 Wolbachia 能够抑制多种RNA病毒增殖 果蝇 和蚊子30,31,32最近的证据显示了一种可能的机制 Wolbachia 通过上调宿主甲基转移酶Mt2的表达来阻断辛德毕斯病毒（SINV）感染33此外，昆虫的遗传背景对病毒感染也至关重要。例如，基因中的自然多态性 pastrel (pst)，决定对DCV感染的易感性 果蝇34,35，而位点的 Ubc-E2H 和 CG8492 参与蟋蟀麻痹病毒的相关作用&#160;（CrPV）和Flock house病毒（FHV）感染36.
建立果蝇中病毒与宿主相互作用的具体方法，必须根据研究目的进行选择，例如用于筛选宿主细胞组分的高通量筛选 果蝇 细胞系37,38，口服感染以研究肠道特异性抗病毒反应22,39,40，针刺41,42 或通过纳米注射穿透上皮屏障以刺激全身免疫反应。纳米注射可精确控制病毒剂量，从而诱导可控的抗病毒反应和生理性损伤43从而确保实验具有高度的可重复性44本研究中，我们描述了一种纳米注射方法，用于研究病毒与宿主之间的相互作用 黑腹果蝇，强调了果蝇背景效应的重要性。

<table><tbody><tr><td>0.22 µm 滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Brand</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 无RNase微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Sigma</td><td>CLS430167</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>100 根替换用毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 qPCR 系统</td><td>ABI</td><td>7500</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>151858</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Sigma</td><td>95284-100ML</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>果蝇培养箱</td><td>Percival</td><td>I-41NL</td><td>果蝇饲养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>12657-029</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>平底96孔板</td><td>Sigma</td><td>CLS3922</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>裂解液（RNA提取用）</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td>TRIzol 试剂</td></tr><tr><td>裂解液（液体样本RNA提取用）</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296028</td><td>TRIzol LS 试剂</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 自动纳升级注射仪</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Nanoject II 可调体积（2.3 至 69 nL）自动注射仪，配玻璃毛细管（110V）</td></tr><tr><td>光学粘合膜</td><td>ABI</td><td>4360954</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（液体）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>qPCR 板</td><td>ABI</td><td>A32811</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s 昆虫培养基</td><td>Sigma</td><td>S9895</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>GraphPad Prism 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransScript Fly 第一链 cDNA 合成超混合液</td><td>TransScript</td><td>AT301</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>IKA</td><td>VORTEX 3</td><td>RNA 提取</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster 中病毒感染的建立及宿主-病毒相互作用分析

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

病毒传播是导致流行性疾病的主要原因。因此，深入了解病毒与宿主之间的相互作用，对于拓展病毒感染的预防和治疗知识具有重要意义。果蝇黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其强大的遗传学工具和高度保守的先天免疫信号通路，已被证明是筛选抗病毒因子和研究病毒-宿主相互作用最高效且成果最丰富的模式生物之一。本文所述方法展示了一种纳米注射技术，用于在成年果蝇中建立病毒感染并诱导系统性抗病毒反应。该方法可精确控制病毒注射剂量，从而实现较高的实验可重复性。本研究中描述的实验方案包括果蝇与病毒的制备、注射方法、存活率分析、病毒载量测定以及抗病毒通路评估。文中还提到了果蝇遗传背景对病毒感染效应的影响。该感染方法操作简便且具有定量可重复性，可用于筛选参与病毒-宿主相互作用的宿主或病毒因子，并解析病毒感染响应中先天免疫信号通路与其他生物学通路之间的交互作用。

本节结果是在DCV感染后获得的 D. melanogaster. 图1 显示病毒感染的流程图 果蝇果蝇通过胸腔内注射接种，随后采集样本用于测定病毒的TCID50 基因组RNA水平（图1）。病毒感染可导致细胞裂解，感染后3天可观察到细胞病变效应（CPE）。图 2A）。通过CPE实验测得的病毒载量与qPCR测得的结果一致（图2B）。如图所示 图3, Wolbachia 抑制 DCV 感染 果蝇. wol-16S rRNA 和 wsp 引物用于检测 Wolbachia 存在图 3A）和 Wolbachia无病毒果蝇在感染DCV后表现出显著降低的存活率（图3B). 图4 展示如何验证 pst 利用...

本方案描述了如何建立病毒感染 体内 在 黑腹果蝇 采用纳米注射法及基础技术分析病毒-宿主相互作用。

Drosophila Melanogaster 中病毒感染的建立及宿主-病毒相互作用分析

病毒传播是导致流行性疾病的主要原因。因此，了解病毒与宿主之间的相互作用对于拓展我们对……的理解至关重要。

该方法有助于解答病毒-宿主相互作用领域中的关键问题，例如如何在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中有效建立病毒感染。这种纳米注射方法能够精确控制病毒感染剂量，并可轻松应用于其他微生物病原体的感染研究。首先，在25°C条件下，将每毫升含一乘十的七次方个活性S2*细胞的细胞悬液，以10毫升完全Schneider果蝇培养基接种于10厘米细胞培养皿中，培养一小时，形成疏松的半贴壁单层细胞，无需额外添加二氧化碳。孵育期间，将新解冻的果蝇C病毒（Drosophila C Virus，DCV）用1毫升完全培养基重悬，使其感染复数为0.01，并将病毒溶液加入细胞培养皿中。然后将培养板放回25°C培养箱中继续孵育3至5天。当细胞形态变得模糊、培养基中充满黑色颗粒（提示细胞碎片）时，病毒即可收集。将细胞培养物全部转移至15毫升离心管中，于-80摄氏度裂解宿主细胞前，先用移液器反复吹打上清液数次。为制备病毒工作浓度，将细胞悬液在25摄氏度水浴中振荡解冻，随后通过离心去除细胞碎片。然后将上清液转移至新的无菌15毫升离心管中，涡旋混匀，并每管分装最多200 µL病毒溶液。为了确定平均病毒组织培养感染剂量，首先将每100微升完全培养基中接种5×10⁴个S2*细胞，每列8个孔，共12列，置于96孔板中。然后将该板放回25°C培养箱中。从-80°C保存条件下随机选取5管病毒。在细胞沉降的同时，将10个无菌的1.5毫升微量离心管各加入450微升无菌完全培养基，并向第一个含有450微升无菌完全培养基的1.5毫升管中加入50微升病毒原液，逐管进行10倍梯度稀释至第12孔。孵育结束后，将每种稀释度的50微升分别加入对应病毒管的各列相应孔中，每列另设一孔加入50微升不含病毒的培养基作为阴性对照孔。随后将培养板置于25摄氏度培养箱中培养三天，每天在20倍明场显微镜下观察各病毒原液的细胞病变效应。将细胞形态模糊且培养基中充满碎片的孔判定为阳性孔，将细胞形态正常的孔判定为阴性孔。在交配前，将400微升浓度为50微克/毫升的四环素与4克新鲜的标准玉米粉果蝇食物充分混合，并将食物置于4摄氏度环境下过夜，以挥发乙醇。次日早晨，将食物恢复至室温，然后将食物、20只雌性及10只雄性新羽化的成年果蝇放入一个繁殖小瓶中，在25摄氏度、60%湿度及正常明暗循环条件下进行为期三至四天的繁殖培养。当产卵数量足够后，在轻微的二氧化碳气流下收集新羽化的成虫，并按照上述方法再次繁殖果蝇，重复两代。经过三代四环素处理后，在轻微的二氧化碳气流下收集五只果蝇，加入250微升双蒸水和数颗0.5毫米无菌陶瓷珠，将果蝇匀浆。一分钟后，向样品中加入250微升2倍浓度缓冲液A，涡旋混匀，随后将样品置于-80摄氏度冰箱中冷冻保存。接下来，将样品从–80 °C冰箱中取出，在25 °C水浴中快速解冻，随后在70 °C水浴中孵育30分钟，然后根据标准方案提取基因组DNA，并通过聚合酶链式反应扩增DNA。根据标准方案，通过凝胶电泳确认每份果蝇匀浆中不存在沃尔巴克氏体16S小RNA和wsp。随后，如示例所示，将无沃尔巴克氏体的果蝇品系饲养在标准玉米粉果蝇培养基上。进行病毒感染实验时，首先使用体视显微镜和细镊子将玻璃毛细管针头的尖端折断至适合纳米注射的适当直径。组装注射器时，将顶盖O形环和白色垫片套在注射器金属推杆上，确保较大的凹面朝外。使用装有30号针头的注射器将矿物油注入玻璃针中，然后将针穿过针筒套管。将较大的 O 型圈放置在针头钝端约一毫米处的套管底部，并将针头安装到注射器的推杆上。固定针头与推杆连接处，按下空按钮，推动显微注射器的推杆直至听到可听见的信号。然后按填充按钮，将推杆回缩五毫米，并将针头浸入含有 100 个噬斑形成单位的病毒悬液中。轻轻摇动一个或至少三个装有20只无沃尔巴克氏体（Wolbachia-free）雄性果蝇的西林瓶，将果蝇转移至注射培养皿中。在交配过程中，雄性果蝇更具交配优势，且其繁殖能力可能影响雌性。随后，在每只果蝇中胸侧板与翅侧板之间颜色略浅的区域，向其胸部注射50.6纳升病毒溶液，并通过细胞病变效应检测法及定量RT-PCR法，对研磨后的果蝇样本进行DCV载量测定，方法如前所述。注射后，小心将果蝇转移到新的培养管中，并将培养管水平放置，以防止果蝇在麻醉恢复期间粘附于培养基上。注射过程耗时较长，但DCV的复制非常迅速，因此在每管果蝇全部注射完成后，立即在管壁上记录准确的注射时间至关重要。病毒感染可诱导细胞裂解，并在感染后三天观察到细胞病变效应。如所示，可使用 Wolbachia 的 16S rRNA 和 wsp 引物来检测 Wolbachia 和果蝇的存在。经检测无 Wolbachia 的果蝇在感染 DCV 后存活率显著降低，且呈剂量依赖性。DCV 会激活宿主中的抗病毒信号通路，这些通路对果蝇抵抗病毒感染至关重要，这一点在 Dicer-2 突变果蝇中表现为存活率降低和病毒载量升高。在进行该实验操作时，需要注意沃尔巴克氏体（Wolbachia）基因型的污染可能会影响黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）对DCV感染的易感性。完成该操作后，可进一步开展更大规模的遗传筛选等其他方法，以探究在病毒侵染或抗病毒反应中所需的特定宿主基因。该技术建立后，为研究人类病毒性疾病的研究人员提供了利用黑腹果蝇模型探索地方性人类病毒感染暴发机制的新途径。请注意，操作病毒可能具有极高危险性，在进行本实验时，务必采取佩戴适当防护装备等预防措施。

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免疫学与感染

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