Name: 流式细胞术测定小鼠胸腺、胰腺干淋巴结和脾脏的调节 t 细胞亚群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 了解如何使用流式细胞术分析小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中的调节性T细胞亚群。该方案提供了一种经济高效的手动方法来制备单细胞悬液，用于免疫学研究。

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本研究得到了瑞典研究理事会、EXODIAB、瑞典糖尿病基金会、瑞典儿童糖尿病基金、SEB糖尿病基金会以及O.E.和Edla Johansson科学基金会的经费支持。作者还要感谢Per-Ola Carlsson和Stellan Sandler提供的支持与讨论。

乌普萨拉大学当地动物伦理委员会批准了动物实验。
1. 动物器官的采集
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>将胸腺和脾脏置于含有 5 mL Hanks 平衡盐溶液（HBSS）的 20 mL 闪烁瓶或 15 mL 圆锥管中。将 PDLN 置于含有 1 mL RPMI 1640 的 1.5 mL 微量离心管中。使用完整的胸腺和脾脏，以及所有 PDLN。 
	注意：整个操作过程中器官应保持在冰上，研究人员在制备单细胞悬液时应尽量迅速，尤其是在处理胸腺组织时，因为胸腺免疫细胞在较高温度下会迅速降解。</li>
</ol>
2. 胸腺和脾脏中单细胞的分离
<ol>
	<li>用镊子充分挤压胸腺和脾脏，以释放免疫细胞。弃去剩余的胸腺和脾脏包膜。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液。</li>
	<li>为裂解红细胞，将细胞沉淀重悬于5 mL 0.2 M NH4Cl溶液中，室温孵育10分钟。每2分钟轻柔颠倒混匀一次。孵育结束后加入5 mL HBSS终止裂解反应。</li>
	<li>在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于约5 mL HBSS中，并用HBSS充满离心管。</li>
	<li>在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于约5 mL HBSS中，并用HBSS充满离心管。</li>
	<li>在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>将胸腺细胞沉淀重悬于5 mL HBSS中，脾脏细胞沉淀重悬于10 mL HBSS中。</li>
	<li>取1 mL胸腺细胞悬液和500 µL脾脏细胞悬液，分别加入含细胞筛网帽的5 mL圆底管中。将细胞悬液通过筛网帽过滤。 
	注意： 筛网帽内置35 µm尼龙滤网。每管大约收集500万至1000万个细胞。</li>
</ol>
3. 从 PDLN 中分离单细胞
<ol>
	<li>将无菌的250 µm金属筛网置于架上的15 mL锥形管上，用1 mL RPMI冲洗筛网。</li>
	<li>将淋巴结转移至金属筛网上，使用一对镊子将其研磨过筛。在筛网上加入1 mL RPMI，以冲洗细胞进入管中。重复此操作3次，然后移除筛网。</li>
	<li>在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用约5 mL RPMI重悬细胞沉淀。用RPMI充满离心管。</li>
	<li>在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用约5 mL RPMI重悬细胞沉淀。用RPMI充满离心管。</li>
	<li>在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用2 mL RPMI重悬细胞沉淀。将2 mL细胞悬液转移至带有细胞筛网帽的5 mL圆底管中。将细胞悬液加至细胞筛网帽上。</li>
</ol>
4. 流式细胞术
<ol>
	<li>将来自胸腺、PDLN和脾脏的细胞悬液在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在100 µL流式细胞术染色缓冲液（FACS缓冲液）中，使用以下表面抗体对细胞进行染色：0.75 µg/100 µL FITC标记的CD4抗体、0.60 µg/100 µL APC-H7标记的CD8抗体、0.30 µg/100 µL PE标记的CD25抗体、5 µL（1:20）APC标记的Nrp1抗体。将样品管置于冰上孵育40分钟。</li>
	<li>向每管中加入200 µL FACS缓冲液，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
	<li>用500 µL通透固定缓冲液（PFB）重悬细胞沉淀，以进行细胞固定和通透。 
	注意：PFB通过将1份固定/通透浓缩液与3份固定/通透稀释液混合配制而成。</li>
	<li>将样品管置于4 °C冰箱中过夜。 
	注意：孵育1小时也可达到效果。</li>
	<li>在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用500 µL通透洗涤缓冲液（PWB）重悬细胞沉淀，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。 
	注意：PWB通过将10倍浓度的通透缓冲液按1:10比例用蒸馏水稀释配制而成。</li>
	<li>在100 µL PWB中，使用以下细胞内抗体对细胞进行染色：0.30 µg/100 µL PE-Cy7标记的Foxp3抗体、4 µL（1:25）PacificBlue标记的Helios抗体。将样品管置于冰上孵育1小时。</li>
	<li>向每管中加入500 µL PWB，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用500 µL PWB重悬细胞沉淀，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用300 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在流式细胞仪上分析细胞。</li>
	<li>根据侧向散射-面积、高度和宽度，以及前向散射-面积、高度和宽度对单细胞进行设门，每份样品采集一百万个事件用于分析。</li>
	<li>导出实验的FCS文件，并使用流式细胞术分析软件进行数据分析。</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们从NOD小鼠的胸腺、外周淋巴结（PDLNs）和脾脏中分离出单个细胞，并通过流式细胞术检测CD4+CD8-CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg细胞）中Helios和Nrp1的表达。本研究所使用的NOD小鼠是1型糖尿病的小鼠模型。在之前的研究中，我们曾使用野生型小鼠品系CD-1和C57BL/6小鼠，以探讨Helios或Nrp1哪一个更适合作为区分胸腺来源Treg细胞（tTreg）与外周诱导Treg细胞（pTreg）的标志物。在该研究中，我们采用类似方案分析了未免疫小鼠体内Treg细胞亚群的分布9，结果发现Helios在此背景下是更优的标志物。因此，本研究进一步在血糖正常的NOD小鼠模型中验证了我们先前的发现，并证实结果与之前一致10。本方案提供了一种高效且经济的方法，用于制备单细胞悬液并进行后续的流式细胞术分析。已有若干文献报道使用自动组织解离仪来制备单细胞悬液11,...

调节性T（Treg）细胞对免疫系统的稳态至关重要。Treg细胞的特征是表达表面抗原CD4和CD25，以及转录因子叉头框P3（Foxp3）1,2,3。Sakaguchi等首次发现CD25在小鼠的T抑制细胞上组成性表达4，这一发现为人类Treg细胞的鉴定提供了开创性的依据。Treg细胞通过多种机制发挥抑制功能，在免疫耐受中起核心作用，这些机制包括通过分泌颗粒酶诱导细胞凋亡的细胞溶解作用、细胞因子消耗以及通过表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）实现抑制5。此外，它们还可分泌抑制性细胞因子，如转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）和IL-355。Treg细胞可天然来源于胸腺，此时被称为胸腺来源的Treg（tTreg）细胞，也可在外周器官中被诱导产生，此时称为外周诱导的Treg（pTreg）细胞。
Helios 是 Ikaros 转录因子家族成员，据报道可作为区分胸腺来源调节性T细胞（tTreg细胞）与外周来源调节性T细胞（pTreg细胞）的标志物6。随后，另外两个研究团队报道，在特定条件下，神经纤毛蛋白1（Neuropilin 1, Nrp1），即一种神经纤毛蛋白III受体，可作为tTreg细胞的表面标志物7,8。然而，Singh 等人已证明，在未致敏小鼠中，Helios 是更为优越的标志物9。
调节性T细胞（Treg细胞）的不同亚群在维持免疫系统稳态以及抵御自身免疫和感染方面发挥着关键作用。因此，确定这些细胞群体在淋巴组织和非淋巴组织中的数量和比例具有重要意义。为实现这一目标，需要从这些器官制备单细胞悬液。已有多种方案在先前的研究中被描述或使用。在以往发表的研究中，主要采用自动组织解离仪10,11。使用自动解离仪操作便捷且节省时间，但成本较高。因此，我们采用了一种手动方法，从血糖正常的非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的胸腺、胰腺引流淋巴结（PDLNs）和脾脏中制备单细胞悬液，并分离出单个细胞。该方法已在我们之前的研究中应用，我们发现，手动制备单细胞悬液的效率与使用自动解离仪的方法相当9,12,13,14。此外，我们采用流式细胞术检测了CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg细胞及其亚群——胸腺来源的Treg细胞（tTreg）和外周诱导的Treg细胞（pTreg）的比例。tTreg细胞通过Helios和Nrp1作为标志物进行区分。因此，我们的结果表明，手动制备单细胞的方法确实高效，所获得的单细胞悬液可进一步用于流式细胞术相关研究。

<table><tbody><tr><td>NOD 小鼠</td><td></td><td></td><td>本单位繁育</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&amp;auml;rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>包含固定/透化浓缩液、固定/透化稀释液和透化缓冲液（10倍浓度）</td></tr><tr><td>eBioscience 流式细胞术染色缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 单克隆抗体 (RM4-5)，FITC，eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 单克隆抗体 (PC61.5)，PE，eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;APC-H7 大鼠抗小鼠 CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Neuropilin-1 APC 标记抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 单克隆抗体 (FJK-16s)，PE-Cyanine7，eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue 抗小鼠/人 Helios 抗体</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>双位置 snap cap 中集成了 35 &amp;micro;m 尼龙网膜</td></tr><tr><td>15 mL 试管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>一次性闪烁瓶</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术分析软件</td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性t细胞亚群

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

我们的免疫系统由多种多样的免疫细胞组成，包括调节性T细胞（Treg细胞）。Treg细胞可分为两个亚群：胸腺来源的Treg（tTreg）细胞和外周诱导产生的Treg（pTreg）细胞。这些细胞存在于我们身体的不同器官中，并可通过特定标志物（如Helios和Neuropilin 1）加以区分。已有研究报道，tTreg细胞在功能上比pTreg细胞具有更强的抑制能力。因此，在研究异质性细胞群体时，确定tTreg和pTreg细胞各自的比例非常重要。本文中，我们采集了血糖正常、非肥胖型糖尿病小鼠的胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏，通过流式细胞术来区分tTreg细胞与pTreg细胞。我们手动制备了来自这些器官的单细胞悬液。使用荧光染料标记的表面抗体CD4、CD8、CD25和Neuropilin 1对细胞进行染色，并将样本在冰箱中过夜保存。次日，再用荧光染料标记的细胞内Foxp3和Helios抗体对细胞进行染色。这些标志物用于鉴定Treg细胞的两个亚群。本实验方案展示了一种简单且实用的方法，用于从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中制备单细胞悬液，并用于后续的流式细胞分析。

为了研究Nrp1和Helios在胸腺来源调节性T细胞（tTreg）和外周来源调节性T细胞（pTreg）中的表达情况，我们制备了血糖正常NOD小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结（PDLN）和脾脏的单细胞悬液，并使用调节性T细胞标志物CD4、CD25、Foxp3、Helios和Nrp1进行染色，随后进行流式细胞术分析。结果按照代表性设门策略进行分析（图1）。我们发现，在三种器官中，CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg细胞中Helios+细胞的比例均高于Nrp1+细胞的比例（图2A）。胸腺中超过80%的Treg细胞表达Helios，高于PDLN和脾脏中的比例（图2A）。在Helios+ Treg细胞中，PDLN中Nrp1+细胞...

本文介绍了一种从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏制备单细胞悬液的实验方案，以便进一步通过流式细胞术对这些细胞进行研究。此外，该方案还可用于通过流式细胞术鉴定调节性T细胞的不同亚群。

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

我们的免疫系统由多种多样的免疫细胞组成，包括调节性T细胞（Treg细胞）。Treg细胞可分为两个亚群，……

本方案有助于研究免疫细胞在特定器官的健康与疾病状态中的作用。该技术的主要优势在于其成本较低，因为这是一项手动操作的技术。本实验操作将由我实验室的博士研究生 Zhengkang Luo 进行演示。首先，将先前处死的小鼠的胸腺和脾脏放入装有 5 ml Hanks 平衡盐溶液的 20 ml 闪烁瓶或 15 ml 圆锥形离心管中。将胰腺引流淋巴结放入装有 1 ml RPMI-1640 的 1.5 ml 微量离心管中。确保使用完整的胸腺和脾脏，以及全部的 PDLN（胰腺引流淋巴结）。整个操作过程中需将器官保持在冰上。使用剪刀充分挤压胸腺和脾脏，以释放免疫细胞。弃去残留的胸腺和脾脏囊膜。将细胞悬液转移至15 ml锥形管中，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。为裂解红细胞，用5 ml 0.2 M氯化铵重悬细胞悬液，并在室温下孵育10分钟。每两分钟轻轻倒置试管一次。孵育结束后，加入 5 ml HBSS 以终止裂解。将试管在 433 × g、4 摄氏度条件下离心五分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于约 5 ml HBSS 中。然后用 HBSS 充满离心管。从样品离心到用 HBSS 填充离心管的整个过程重复一次。将离心管再次在433 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于HBSS中。准备带有细胞筛网帽的5 ml圆底管。将1 ml胸腺细胞悬液和500微升脾细胞悬液加入到管中，加样时将悬液直接加至细胞筛网上。首先，将一个15 ml锥形管放入支架中，然后将无菌的250微米金属筛网置于管口上方。用 1 ml RPMI 冲洗滤网。接着，将淋巴结转移至金属滤网上，使用一对镊子将其研磨通过滤网。在滤网上加入 1 ml RPMI，以冲洗细胞进入离心管中。对每个样本重复此转移和研磨淋巴结的操作共三次，然后移除滤网。将试管在433 ×g、4°C条件下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重新悬浮于约5 ml的RPMI培养基中。然后，用 RPMI 填充试管。从离心样品到用 RPMI 填充试管的整个过程重复一次。再次于 433 × g 离心力下、4 摄氏度条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 2 ml RPMI 培养基中。取 2 ml 细胞悬液转移至带有细胞筛帽的 5 ml 圆底试管中。首先，将来自胸腺、脾脏和 PDLN 样本的细胞悬液在 433 × g 离心力下、4 摄氏度条件下离心 5 分钟。弃去上清液。根据文本方案中所述，用表面抗体对细胞进行染色，并将各管置于冰上孵育40分钟。接着，向每管中加入200 µL FACS缓冲液。在433 × g、4摄氏度条件下离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤一次，加入缓冲液，离心并弃去上清液。用500 µL破膜固定缓冲液重悬细胞沉淀，以固定并破膜细胞。将试管转移至4°C冰箱中过夜。次日，在4°C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于500 µL透化洗涤缓冲液中。将细胞再次在433 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。按照文本方案中的说明，用细胞内抗体对细胞进行染色。将试管置于冰上孵育1小时。此后，向每根试管中加入 500 µL 透化洗涤缓冲液。在 4 °C 条件下，以 433 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 500 µL 透化洗涤缓冲液中。再次在433 × g、4摄氏度条件下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于300 µL FACS缓冲液中。随后，按照文本方案中所述，使用流式细胞仪分析细胞。本研究中，从血糖正常的NOD小鼠的胸腺、PDLN及脾脏中分离单个细胞，并用Treg细胞标记物CD4、CD25、Foxp3、Helios和神经纤毛蛋白-1进行染色，用于流式细胞术分析。结果经分析后以代表性设门策略展示。在三个器官中，CD4阳性、CD8阴性、CD25阳性、Foxp3阳性Treg细胞中Helios阳性细胞的比例均高于Nrp1阳性细胞的比例。超过80%的胸腺Treg细胞表达Helios，这一比例高于PDLN和脾脏中的比例。在Helios阳性Treg细胞中，PDLN中NrP1阳性细胞的比例高于胸腺或脾脏。大多数Nrp1阳性Treg细胞也表达Helios，而在Nrp1阳性Treg细胞中，胸腺和脾脏中Helios阳性细胞的比例高于PDLN。综上所述，这些结果表明 Helios 是比 Nrp1 更佳的 Treg 细胞检测标志物。淋巴结体积较小，但某些细胞内标志物在流式细胞术中需要大量细胞才能获得良好的信号。由于细胞已经染色并死亡，因此无法在此步骤之后进行其他方法检测。但该动物的四个细胞标记物可被替换，以研究其他类型的免疫细胞。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

流式细胞术测定小鼠胸腺、胰腺干淋巴结和脾脏的调节 t 细胞亚群

这是一种快速且全面的免疫表型分析髓系来源抑制性细胞（MDSC）并富集Gr-1的方法+ 从小鼠脾脏中分离白细胞。该方法利用流式细胞术和AutoMACS细胞分选技术富集活的Gr-1+ 在使用流式细胞荧光分选（FACS）分离髓源性抑制细胞（MDSC）之前，对白细胞进行处理 体内 和 体外...

从 naïve 小鼠和胰腺肿瘤荷瘤小鼠中分离制备髓系来源抑制性细胞（MDSC）的流式细胞术与自动磁性激活细胞分选（AutoMACS）方法

关键词：MDSC，髓系来源抑制性细胞，naïve 小鼠，胰腺肿瘤荷瘤小鼠，流式细胞术，自动磁性激活细胞分选，AutoMACS

我们介绍一种基于流式细胞术的方法来检测T细胞发育 体内...

通过流式细胞术检测胸腺阳性与阴性选择

在本视频中，我们介绍了一种从小鼠胰腺引流淋巴结（PDLNs）中分离单个细胞的方案，并通过流式细胞术对单细胞群体中的调节性T细胞（Tregs）进行表征。Tregs的鉴定依据是细胞表面标志物CD4、CD25和Nrp1的阳性表达，以及核转录因子Foxp3和Helios的表达。...

从小鼠胰腺引流淋巴结中鉴定调节性T细胞亚群

Th17细胞的效应功能与其他T细胞亚群不同，其在炎症性自身免疫疾病中具有核心作用。本体外Th17细胞分化方案提供了一种方法，用于确定初始CD4+...

初始CD4 T淋巴细胞的分离与Th17分化

初始CD4+ T细胞在激活时会根据所处环境极化为不同的亚群。体外诱导初始CD4+...

小鼠初始型CD4+ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。...

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

本文介绍一种流式细胞术方案，仅使用两种荧光染料而非七种，即可鉴定人外周血中的CD4+和CD8+ T细胞、γδ...

通过双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。...

小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

体外调节性T细胞功能分析：聚焦增殖与分化

了解如何使用流式细胞术分析小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中的调节性T细胞亚群。该方案提供了一种经济高效的手动方法来制备单细胞悬液，用于免疫学研究。

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

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