活体小鼠肠道移植物抗宿主病的诱导及其微型内镜评估

在活体小鼠中通过微型内窥镜对结肠进行评估，可为研究同种异体造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病（GvHD）相关的肠道表现提供关键的实验支持。这种对急性GvHD相关结肠炎的无创性评估可作为金标准组织病理学检查的有效替代方法，从而避免为获取组织样本而反复处死实验动物。本实验操作将由本实验室的博士后研究员Vera Buchele进行演示。

在受体 BALB/c 小鼠接受全身照射后一天，将一只 CD-45.1 活体 5B6 SJL 供体小鼠置于清洁的操作套管上，呈俯卧位。使用 Simkin 止血钳的 13 厘米弯曲带齿尖端提起一侧跟腱处的毛发。用 8.5 厘米直头精细剪刀在止血钳与一侧足跟之间剪开皮肤，并将切口向头侧延长，以便去除后肢的皮肤和毛发。当后肢皮肤去除后，分别切断每个髋关节、踝关节和膝关节。

将每条后肢的股部和小腿置于一个盛有PVS并放在冰上的92 mm培养皿中，小心地尽可能去除每根骨骼上的肌肉组织，并将清理干净的股骨和胫骨转移至含有湿冰的50 mL离心管中，管内预先加入无菌RPMI 1640培养基。为分离骨髓，每次取一根骨骼转移至另一个盛有新鲜RPMI 1640培养基的92 mm培养皿中，使用解剖刀切除骨骼两端。随后，使用配备26号针头的1 mL注射器，每次用1 mL新鲜培养基冲洗骨骼，将冲洗液收集至含有5 mL培养基的50 mL收集管中。

当所有骨骼均完成冲洗后，轻轻吹打松散的骨髓组织数次，以获得单细胞悬液，随后通过40微米孔径的细胞滤筛过滤至新的50 mL收集管中。离心沉淀细胞，并将细胞重悬于5 mL氯化铵-钾裂解缓冲液中，在室温下孵育3分钟。孵育结束后，加入10 mL PBS终止反应，并再次离心细胞。

将沉淀重悬于2 mL新鲜PVS中用于计数，并保留六乘十的六次方个细胞等分试样，用于后续流式细胞术分析。接下来，按照生产商说明书，使用 commercially available 细胞纯化试剂盒通过磁性去除骨髓单细胞悬液中CD90.2阳性的T细胞，并保留一乘十的六次方个细胞的T细胞耗竭流出液等分试样，用于分离前后细胞纯度和组成的后续流式细胞术分析。然后，使用配备30号针头的1 mL注射器，将五乘十的五次方个T细胞耗竭的骨髓细胞溶于100 µL PVS中，静脉注射至每只经辐照受体动物的眼后静脉窦内。

第二天，将从供体动物获取的脾脏置于50 mL收集管中的40微米细胞筛网上，用注射器活塞将脾组织压过筛网进入管中。用PVS冲洗细胞筛网和活塞以收集全部脾细胞，并通过离心形成细胞沉淀。在完成红细胞裂解后，重新悬浮白细胞进行计数，并保留6 × 10⁶个细胞用于后续流式细胞术分析。

为了从总脾细胞中分离出全部 CD3 阳性 T 细胞，应根据制造商说明书使用 commercially available cell purification kit（商品化细胞纯化试剂盒），并从阳性细胞组分中预留一份 1 × 10⁶ 个 CD3 阳性 T 细胞的等分试样，用于分离前后通过流式细胞术分析细胞纯度与组成。随后，将 7 × 10⁵ 个同种反应性 CD3 阳性 T 细胞溶于 100 µL PVS 中，通过眼球后静脉注射至每只受体小鼠体内，以诱导移植物抗宿主病（GvHD）。为通过微型内窥镜检查远端直肠结肠区域的 GvHD 相关病变，用一只手在受体动物尾根上方提起尾巴，另一只手则小心地将内窥镜经肛门插入直肠。

当气流使结直肠管腔膨胀时，缓慢而谨慎地将内窥镜向远口方向推进。为避免结肠损伤，应通过实时视频屏幕辅助，将内窥镜保持在管腔的中央区域。开始录制视频流并进行炎症评分，根据所示参数对与移植物抗宿主病（GvHD）相关的结肠炎症进行评估和评分。

当找到评分区域后，轻柔地前后移动内镜以评估各项参数。为评估透光性和粪便性状，应将内镜置于距离结肠壁较远的位置。为评估病灶的颗粒感和血管分布情况，应将内镜靠近结肠壁，并使用内镜前端对结肠壁施加适当且控制良好的张力。

完成评分过程后，停止录像。与对照组相比，同种异体造血干细胞移植所诱导的系统性移植物抗宿主病（GvHD）表型具有可重复且显著的表现，受体动物的临床GvHD评分呈进行性升高。这些可通过微型内窥镜评估的标准是根据既往报道的在同基因型结肠炎模型中、针对异体反应驱动的结肠炎评分参数专门改进而来，用于精确描述、评分和分级远端结肠中与肠道GvHD疾病相关的病变。

事实上，基于微型内窥镜的分级系统能够轻松区分接受供体淋巴细胞且表现出严重肠道炎症的小鼠与基本无移植物抗宿主病（GvHD）的对照小鼠。通过组织病理学研究对基于微型内窥镜的分级系统进行验证，结果证实，受GvHD相关炎症严重影响的小鼠结肠表现出类似的显著组织病理学炎症征象。相比之下，对照小鼠的结肠组织显示无或至多仅有轻度的组织病理学炎症征象，这与微型内窥镜下几乎无法检测到结肠炎征象的结果一致。

此外，微型内镜评估的结肠炎活动度与组织病理学评估的结肠炎活动度及系统性移植物抗宿主病（GvHD）评分之间的相关性研究表明，微型内镜评估得分小于或等于3分可可靠地预测组织病理学分级中不存在中至重度与GvHD相关的结肠炎症。同时，内镜下评估的肠道GvHD严重程度与系统性GvHD疾病活动度之间存在相关性。为了标准化微型内镜对结肠炎症评估的结果，并确保不同小鼠及随时间推移的不同实验之间具有可比性，应选择特定的解剖部位进行评分。

除了评估结肠炎症外，微型内窥镜系统内置的工作通道还可获取在内窥镜引导下进行的组织活检样本，适用于多种后续分析，例如常规组织病理学检查。由于微型内窥镜具有非侵入性的特点，可在几乎任何时间对同一动物反复评估急性移植物抗宿主病（GvHD）相关的结肠炎，从而为肠道GvHD的研究提供引人入胜的深入见解。