Name: 利用可活性可选位的激光光致发光体研究小鼠脑片中的烟碱乙酰胆碱受体功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 了解利用激光光致发光体在小鼠脑片中研究烟碱乙酰胆碱受体功能的方法。该技术结合双光子激光扫描显微镜与膜片钳记录，实现精确的时空控制，揭示胆碱能神经信号传导机制。

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作者感谢以下美国西北大学主要研究者实验室成员的支持：Ryan Drenan、D. James Surmeier、Yevgenia Kozorovitskiy 和 Anis Contractor。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）（R.M.D. 获资助号 DA035942 和 DA040626）、PhRMA 基金会（M.C.A. 获博士后奖学金）以及霍华德·休斯医学研究所（HHMI）资助。

与脑切片制备相关的工作已通过西北大学动物护理与使用委员会审查并获得批准（方案编号：IS00003604）。
警告： 用于点状光刺激的激光器属于可见光IIIb类激光器，可能对眼睛造成伤害。双光子激光扫描显微镜（2PLSM）需要使用近红外（NIR）IV类激光器（&#62;500 mW），此类激光器可能对眼睛造成严重伤害，甚至导致其他组织灼伤。为确保激光设备的安全运行，必须采取适当的激光束封闭措施、系统联锁装置，以及工程和管理控制措施。在使用激光器时，务必咨询当地的激光安全管理人员。
1. 解笼激光器的校准与验证
<ol>
	<li>量化输送至样品的激光功率。
	<ol>
		<li>打开405 nm激光器（最大功率100 mW，控制信号5 V），并让激光系统预热约10分钟。 
		注意： 激光器仍处于快门关闭状态（驱动电压为0 V），在未向激光器发送控制电压以调节输出功率之前，无输出功率。</li>
		<li>将功率计置于组织样本平面或聚光镜位置。手动将功率计相对于光路/物镜居中。</li>
		<li>将仪表设置为正确的波长范围（400-1100 nm）。通过按下相应的按钮对仪表进行归零。</li>
		<li>使用软件控制，为405 nm激光功率选择100（最大值为1000；1000 = 5 V），即将激光功率设置为满功率的10%。如有需要，也可将激光控制电压输入到 普拉特维尔 系统 通过 电压记录 用于提供命令信号时序和功率水平的数字记录。</li>
		<li>记录功率计的读数。</li>
		<li>选择405 nm激光器输出功率为150（最大值1000的15%），并记录功率计读数。依次对以下输出功率进行相同操作，以获取激光功率曲线：200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950和1000。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准解笼激光扫描振镜。每当系统光学组件发生变更、对光斑定位准确性存疑，或定期每月一次时，执行以下步骤。
	<ol>
		<li>安装将用于光刺激和成像实验的60倍水浸显微镜物镜。在采集/成像软件中，选择60倍物镜和1倍光学变焦（见步骤3.1.4.2）。</li>
		<li>用红色永久性记号笔在干净的玻璃显微镜载玻片上标记一个实心圆。将载玻片放置在显微镜载物台上，记号朝向物镜。</li>
		<li>使用4倍或10倍物镜预先对红标记区域进行聚焦。在红标记点/区域上方加入1-2 mL水，然后切换至60倍物镜，并将物镜浸入水中。将物镜聚焦于薄层红标记区域。</li>
		<li>切换至双光子激光扫描模式。对于大多数系统，将物镜转盘移至位置#1，将三目棱镜移出光路，将扫描头镜片移至前方，并将激光波长设置为约900 nm。在图像采集参数中选择512 × 512像素框选项，此为刺激镜校准程序的默认像素设置。</li>
		<li>以高于最低值的成像激光功率启动系统扫描，并微调物镜焦点至薄层红色标记物荧光处。选择一个荧光视野中无碎片、标记物覆盖均匀的区域。 
		注意： 本方案中使用的装置采用 普拉特里维尤 5.4 采集/成像软件。</li>
		<li>打开 解笼式检流计校准 功能在 工具——校准/对齐 软件菜单&#160;逐步演示 灼伤斑点 第二组振镜对的空间校准教程
		<ol>
			<li>在……之内 灼伤斑点 教程：选择405 nm激光，设定激光刺激功率为400，刺激持续时间为20 ms。此参数应在红色标记上产生较小的孔洞（直径约1–5 µm）。 
			注意： 通常使用约 2-4 mW 和 1-10 ms 的参数设置，但具体设置需根据样本确定。PA-Nic 光刺激的功率设置可能远低于校准过程中在红色标记载玻片上烧蚀出可见孔洞所需的功率。该校准程序有助于定位光刺激位点，但不应据此推断生理反应期间的绝对光刺激体积。</li>
			<li>选择 更新 在中心光斑灼烧后，刺激并刷新图像，然后将圆形红色指示器移至实际光斑位置。依次对中心光斑、右中心光斑、下中心光斑，以及最终的九点网格（包括图像的所有角点、边缘中点和中心点）执行此操作。 
			注意： 中心、右侧和下侧校正点的位置决定了刺激检流计的电压，以定义真实中心以及X和Y方向的缩放因子，从而使刺激镜组与成像镜组相匹配。软件将对所有后续内容进行缩放和更新 标记点 在与空间校准放大倍数不同的缩放设置下进行的实验。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过打开校准结果进行测试 标记点 窗口中，手动激活样品新区域中定义位置的刺激参数。确保已将正确且最新的校准文件加载到系统中。 标记点 窗口。激活 标记点/组 或 MarkPoints 系列 在指定位置（或多个位置）进行特征操作或利用 活体/消融 在图像任意位置右键/左键单击鼠标的功能 在……期间 活体扫描以施加测试脉冲并验证校准正确性。 
		注意： 激光灼烧点现在应精确地位于中心 标记点 指示剂</li>
		<li>通过分接驱动电压至监测设备，实时监控并记录激光脉冲功率及其时间持续长度 电压记录 程序（见步骤 1.1.4）。类似地，利用来自光刺激检流计镜对的反馈信号中的标定电压信号，记录每个刺激位点的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 光激活型尼古丁（PA-Nic）的制备
<ol>
	<li>从储存处取出一份冻干的光激活药物 aliquot。 
	注意： 以下方案专用于PA-Nic；若用于其他光激活药物，请根据需要进行调整。尽管PA-Nic表现出极佳的稳定性5在制备和/或实验过程中，应采取合理预防措施，避免其暴露于强光下。只需在低光照条件下操作即可，无需使用红光滤光片。</li>
	<li>局部施用 PA-Nic。
	<ol>
		<li>使用程序化拉针仪拉制玻璃微量移液管，使其开口直径为20–40 µm。</li>
		<li>用 0.22 µm 滤器过滤约 1 mL 记录液。将适量 PA-Nic 用过滤后的记录液重悬，使其终浓度为 2 mM。例如，将一份 100 nmol 的冻干粉溶解于 50 µL 过滤后的记录液中。 
		注意： 近期发表的文献中可找到建议的记录液成分5,6 采用PA-Nic光解。</li>
		<li>用50 µL的2 mM PA-Nic反向填充局部给药移液管。</li>
		<li>将局部给药移液管固定在安装于显微操作器上的移液管架中。连接移液管架 通过 合适的管路连接至可持续施加低压（1-2 psi）的压力喷射系统。</li>
		<li>使用显微操作器将局部给药移液管移入细胞外记录液中，并将移液管尖端定位在距离目标细胞约50 μm的小鼠脑组织上方。有关小鼠脑片制备和膜片钳记录的详细方案，请参考先前的文献报道。8.</li>
		<li>通过施加短暂压力（1-2 psi）检查施加参数。目标细胞应无明显位移或仅有轻微移动。如果出现显著移动，应将局部施加移液管重新定位至距离目标细胞更远的位置（横向和/或轴向方向）。</li>
		<li>在获得稳定的全细胞膜片钳记录后（具体步骤详见先前发表的文章8），打开压力喷射装置上相应的手动开关，施加低压力（1-2 p.s.i.）。在进入下一步之前，用PA-Nic浸润细胞周围的组织1-2分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对脑切片进行PA-Nic的浴式给药（灌流）。
	<ol>
		<li>将适量PA-Nic溶解于适合持续循环灌流的记录液中，使其终浓度为100 μM。例如，取1 μmol的PA-Nic样品，溶于10 mL记录液中，使用标准的15 mL离心管进行操作。</li>
		<li>以1.5–2 mL/min的流速打开灌流系统中相应的流量控制阀，开始PA-Nic溶液的循环灌流。循环过程持续至记录结束。为节约珍贵的药物，可通过使用内径尽可能小的管路和/或缩短灌流系统中管路的总长度，以尽量减少循环体积。 
		注意： 通过采取这些步骤，浴液循环的体积可减少至5 mL的PA-Nic溶液。若将PA-Nic溶液储存于4 °C避光环境中，通常可在同一周内连续使用两个记录日。</li>
		<li>在循环过程中，持续用碳氧混合气体（5% O₂ + 95% CO₂）通入溶液。2，95% CO2并将浴温维持在 32 °C。</li>
		<li>在低光照条件下操作PA-Nic时，将脑片保存在记录液中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用双光子激光扫描显微镜成像神经元
<ol>
	<li>进行细胞的活体可视化观察。
	<ol>
		<li>使用透射光或红外微分干涉差（IR/DIC）光学系统结合视频摄像机识别/观察内侧缰核（medial habenula, MHb）神经元，并建立稳定的全细胞膜片钳记录。有关急性制备的小鼠脑切片神经元膜片钳记录的详细步骤，请参考先前的实验方案。8.</li>
		<li>在建立高阻抗（&#62;1 GΩ）细胞贴附构型，但在破膜之前，将设备和软件切换至激光扫描模式。</li>
		<li>破膜后，使用激光扫描确认成像染料（按先前所述标准细胞内电极液稀释至终浓度100–200 µM）8）通过扩散被动地填充神经元。让染料（例如， Alexa Fluor 488 用绿色光电倍增管 [PMT] 通道（PMT 2）检测，或 Alexa Fluor 568 或 594 用红色 PMT 通道（PMT 1）检测，在需要观察胞体外任何细胞区室的实验前，至少孵育 20–30 分钟以充分填充细胞区室。 
		注意： 远端区室（树突结构、树突棘、轴突等）.可能需要 30-40 分钟才能完全充满25.</li>
		<li>使用软件 活体扫描 用于可视化目标神经元及其亚细胞区室。选择合适的成像参数，以准确实现神经元特征的实时观察。调节各项设置以调整显示效果（对比度）、分辨率、信噪比（S/N）以及图像帧采集时间：
		<ol>
			<li>查找表（LUT. 使用任意图像窗口侧边的相应图标打开查找表（LUT）窗口。打开后，调整LUT的下限（min）和上限（max）设置 特定图像通道 增强 可视化 屏幕上显示的信号对比度。将最大值降低至约1000（4096中的值，12位检测），这有助于在初次寻找细胞、信号和结构时增强较弱信号的可见性。 
			注意：这些设置仅影响显示的信号，不影响检测或记录的数值。人眼通常只能分辨约50级灰度的对比度。26.</li>
			<li>光学变焦使用软件控制选择1倍光学变焦，并利用平移控制定位组织中的目标区域。此变焦设置可获得最大方形扫描视野，并向检流计镜发送最大的电压/扫描角度。 
			注意： 默认配置下，扫描头内的视场为12 mm × 12 mm，对应于样品内12 mm除以物镜放大倍数的范围。因此，使用60倍物镜时，在1倍光学变焦下所获得的扫描图像边长为200 µm。更高的光学变焦值将扫描更小的区域。2倍光学变焦通常是最适合观察完整神经元的设置，4倍光学变焦则有助于观察神经元的亚细胞结构。</li>
			<li>像素数量 为配合1倍光学变焦，请使用软件控制将每行像素数设置为1024 × 1024像素。设定所捕获和显示图像中每行的像素数量。 以免丢失物镜可能提供的细节使用以下适用于60倍/1.0数值孔径（NA）物镜的实际像素值：缩放倍数为1时采用1024 × 1024，缩放倍数为2时采用512 × 512，缩放倍数为4时采用256 × 256。最终像素尺寸（约0.17 µm；12 mm/放大倍数/缩放倍数/像素）应小于或等于物镜所定义的横向分辨率的一半。 
			注意： 图像分辨率仅由激光波长和物镜数值孔径（NA）决定（使用920 nm激光和1.0 NA物镜进行双光子激发[2PE]时，分辨率为0.4 µm）27镜头上标注的全激发数值孔径（NA）的标准是1/e处的条件2 激光束的直径强度应匹配（或“充满”）物镜的入瞳直径（2 × 管镜焦距 × 数值孔径 / 放大倍数）。本文所述系统中的管镜焦距为 180 mm。</li>
			<li>像素驻留时间. 使用软件控件将像素驻留时间设置为 4 µs，这是一个常用的默认值。&#160; 
			注意： 改变像素驻留时间不会改变检测到的平均信号，仅影响像素内的平均采样过程，这些变化可通过信噪比（S/N）反映在图像质量上。图像像素驻留时间始终为0.4 µs单位的整数倍；对于较长的驻留时间，每个图像像素的12位强度限值是多个0.4 µs采样值的平均结果。由于信噪比随每个像素驻留时间内采样次数的平方根而提升（例如4 µs对应10次采样，信噪比提升3.16倍），当驻留时间远大于12 µs时，图像质量的改善将趋于平缓。</li>
			<li>扫描旋转与感兴趣区域（ROI） 使用软件控件将图像角度设置为 0° 旋转（多数成像系统的默认设置即为 0° 旋转，可能无需操作）。若样本处于“倒置”方向，则选择 180° 旋转以“翻转”图像。 
			注意： 旋转图像至任意角度，可使填充细胞的整个目标区域获得更佳的适配效果。旋转还能为结构变化的对齐提供更清晰的依据，并有利于后续分析的进行。在设定特定缩放倍数（步骤 3.1.4.2）后，于扫描图像中选择目标区域 保留 原生像素数量（步骤 3.1.4.3），但对总面积和像素总数的限制可显著提高帧率，从而改善信号变化的时间分辨率。</li>
			<li>帧平均使用软件控件选择起始帧平均设置为2帧。 
			注意： 最终图像的对比度（信噪比）由图像中信号像素内收集/检测到的总光子数决定。若样品在成像过程中不发生移动或漂白，对多帧图像进行平均可提高信噪比。在帧平均过程中，感兴趣信号的值保持不变，而图像噪声则随所平均帧数的平方根而降低。荧光图像中的微小结构通常需要进行像素间平均，即对图像内特定区域（常称为感兴趣区域，ROIs）的像素进行合并，和/或进行帧平均。帧平均会使得扫描时间延长，延长倍数等于所选择平均的图像帧数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 全景控制, 扫描旋转，以及 光学变焦 用于在扫描过程中定位样本位置的工具。如果需要通过电机载物台调整样本位置，应避免在X、Y和Z轴上设置过大的步长，以防止物镜/聚光镜碰撞、振动或激光束暴露于反射表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集Z轴堆栈图像。使用 Z系列 工具，选择包含目标细胞的起始和终止位置。设置步长（1 µm），然后连续采集包含该细胞的每个Z平面的神经元图像。 
	注意： Z-stack 采集参数会因神经元类型和填充染料的不同而有所差异。Z-stack 采集的最佳参数应独立于活体成像所用参数进行确定。Z-stack 采集可在光药理学实验之前和/或之后进行。如条件允许，建议在光药理学实验后进行 Z-stack 采集，以避免双光子激光扫描显微镜（2PLSM）可能引起的细胞损伤，并有利于小细胞区室的染料充分填充。</li>
</ol>
4. 电生理记录期间的激光闪光光解
注意：使用 ≥ 1 mW 的 405 nm 或 473 nm 激光功率会在物镜和聚光镜的玻璃内部产生磷光。这种产生的光与激光照射功率直接相关，其发射光存在于绿色和红色光谱窗口中，激发态寿命在毫秒（ms）量级。该背景激发伪影在所有测试过的镜头以及各大物镜制造商生产的浸水物镜中均可见。聚光镜产生的磷光远高于物镜。这种“信号”促使在光刺激过程中使用机械快门，以保护对光敏感的砷化镓磷化物（GaAsP）光电倍增管（PMT）阴极。采用常闭式机械快门（在非主动扫描时保持关闭）是保护冷却型 GaAsP PMT 的最佳解决方案。
<ol>
	<li>对于沙漏型光刺激光束几何结构，移除光路光学系统中的任何聚焦透镜，以避免激光束进入物镜入瞳时被收窄或限制。</li>
	<li>使用 MarkPoints，选择单点设置。 
	注意：MarkPoints 内还可选择其他光刺激设置（如多点、点阵、螺旋扫描）。单点设置最为简单，但实验目标和生物学差异可能需要采用不同的设置。</li>
	<li>使用 实时扫描 选项更新图像，短暂成像并定位感兴趣的亚细胞区域。定期更新图像以识别可能发生的微小焦平面漂移。</li>
	<li>如有必要，使用软件控制提高光学变倍倍数（即选择高于当前值的光学变倍设置），以便观察微小结构（如树突棘或远端树突）。</li>
	<li>将 MarkPoints 单点十字准线放置在紧邻细胞膜的位置（约 0.5 μm），切勿将光刺激点直接置于细胞结构上方，以免造成光损伤。</li>
	<li>使用 MarkPoints 中的软件控制设置光刺激参数。初始参数建议如下：持续时间 1–50 ms，激光功率 1–4 mW，重复次数 ≥1 次。</li>
	<li>选择 运行 MarkPoints 以启动 MarkPoints 协议，并实时观察电生理数据的采集过程。</li>
	<li>重复步骤 4.2–4.7 多次，以评估反应幅度和动力学的一致性与稳定性，或其不稳定性。</li>
</ol>

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</ol>

D.L.W. 担任布鲁克纳米荧光显微镜公司的付费顾问。

PA-Nic 应用/递送方法的选择是该局部光刺激技术中最关键的步骤。两种方法——浴式给药和局部灌流——各有其独特的优缺点。选择方法在很大程度上取决于目标细胞类型中烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的功能表达水平。当功能表达水平较高时，通常更倾向于使用浴式给药，因为浴式给药可使记录细胞周围探针浓度均匀，有利于数据解读。此外，浴式给药无需在组织中额外使用灌流微管，使整个操作更为简便。然而，对于昂贵化合物而言，浴式给药会增加每次实验的成本。
通常，故障排查的重点是尝试理解为何在闪光光解后未观察到烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的激活。当使用先前未用PA-Nic研究过的细胞类型时，研究者应局部施加乙酰胆碱（ACh）或尼古丁，以确定是否有足够数量的功能性受体表达5。为验证系统具备检测光解反应的能力，应在表达大量受体的内侧缰核神经元中进行对照实验30。在该脑区，可采用PA-Nic浴式施加，这更有利于验证实验。只有在完成这些验证实验后，才应转向未研究过的细胞类型。若实验系统已通过验证，但反应仍非常微弱或无法检测，可考虑提高PA-Nic浓度、增加闪光强度或脉冲持续时间，或加入nAChR正向变构调节剂以增强nAChR活性6，或联合使用上述方法。
偶尔，解笼反应过大，烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的显著激活会导致电压门控Na+通道的间接激活，以及由于空间钳制不良而产生的非钳制内向电流。这些伪迹会完全掩盖nAChR的内向电流，使数据无法解读，可通过在记录电极内加入QX-314（2 mM）来消除。也可通过降低PA-Nic的浓度、降低闪光强度或缩短脉冲持续时间来消除此类伪迹。在所有可见光光刺激实验中，选择刺激位点时必须谨慎，以避免在目标焦平面之上或之下发生非预期的刺激/光解。此外，在适用情况下，必须对激光功率进行滴定，以重现生理学反应。当使用笼锁配体时，尤其需要注意Z轴方向的光刺激，因为在焦点上方或下方被激活的配体仍可能扩散并与所研究的生物系统（即, 受体）相互作用。
PA-Nic 激光闪光光解法可能并不适用于所有研究者，因其存在若干局限性。首先是合适的实验装置成本相对较高。在使用完整脑片进行实验时，若需在树突等小直径结构附近进行光解笼锁，就需要配备如双光子显微镜等复杂的可视化系统。除了用于实现双光子显微成像的钛宝石可调谐红外脉冲激光器价格昂贵之外，能够独立定位两束激光的双振镜系统也会进一步增加整体系统成本。如果研究者具备足够的专业知识、时间来构建、调试和维护系统，则采用自行搭建的系统&#160;可在一定程度上降低总成本。第二个常见局限是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）功能性表达水平较低，尽管可通过前述措施部分缓解，但这并不能保证实验成功。通常情况下，若无法在喷射施加激动剂后记录到配体激活的电流，则在电压钳制条件下进行 PA-Nic 闪光光解可能也无法获得可接受的结果。第三个局限涉及 PA-Nic 本身的固有荧光特性。PA-Nic 吸收约 405&#160;nm 的光，并在与绿色荧光蛋白（GFP）或 Alexa 488 相近的波长范围发射荧光5。当 PA-Nic 浓度超过约 1 mM 时，这种荧光特性会干扰对神经元结构的同步观察。为缓解此问题，关键在于能够方便地控制灌流移液管中 PA-Nic 的流动。实验中需周期性地暂停 PA-Nic 的灌流，以允许荧光分子扩散离开。这使得可以重新成像神经元，以确认光解束照射位置的准确性。第四个潜在局限是使用 405 nm 光进行光解。较短波长（如 405 nm）在脑片等复杂组织中更容易发生散射。因此，在给定的闪光强度和持续时间下，光解反应的幅度和衰减速率可能会因光解焦点在脑片中的深度不同而产生差异。在得出有关 nAChR 生物学特性的结论时，必须充分考虑这一重要限制因素。
这种局部化激光闪光解笼技术最近被用于揭示烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）神经生物学的新细节。例如，长期尼古丁暴露可增强内侧缰核神经元胞体周围及树突区域nAChR的功能5。该技术还首次帮助证实了腹侧被盖区的谷氨酸能神经元在其胞体周围和树突区室中表达功能性nAChR6。该技术具有诸多潜在的未来应用方向，其方法可拓展至其他已知表达nAChR的关键神经元类型，如大脑皮层的锥体神经元31，或大脑皮层32、纹状体33和海马19中的中间神经元。该技术还可与药理学手段和/或nAChR基因编辑技术相结合34，以将特定受体亚型定位至神经元的不同区室。该方法也可轻松适配于其他香豆素类解笼化合物，包括但不限于与PA-Nic同步开发的其他化合物5。最终，PA-Nic闪光解笼技术未来有望应用于清醒、行为活动中的动物，以研究尼古丁在新型行为药理学范式中的作用。

胆碱能信号传导调节多种大脑功能，包括注意力控制、自主运动和奖赏1,2。增强乙酰胆碱（ACh）传递的药物被用于治疗阿尔茨海默病相关的认知障碍，表明胆碱能系统在认知过程中具有重要作用3。深入理解健康与疾病状态下胆碱能受体及其神经环路的功能，可能为多种神经系统疾病/障碍提供更有效的治疗策略。
烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）是一类配体门控离子通道，可在内源性乙酰胆碱或烟草制品中的外源性尼古丁作用下介导阳离子流动。由于这类受体是最早被描述的神经递质受体之一4，肌肉型nAChRs的药理学特性及其在肌纤维中的定位已较为明确。相比之下，关于脑内天然nAChRs的药理学特性及其亚细胞分布的研究则相对有限。近期，研究人员开发出一种新型化学探针，可在细胞成像和电生理记录过程中实现对脑组织中nAChRs的空间局限性和快速激活，从而填补了这一知识空白5。本文将详细描述该方法的关键技术步骤，旨在提升将nAChR功能与神经元结构相联系的研究能力。
光激活型尼古丁（PA-Nic；化学名称：1-[7-[双(羧甲基)氨基]香豆素-4-基]甲基-尼古丁）可通过约405 nm的激光脉冲高效释放尼古丁5,6。在光解之前，PA-Nic在溶液中稳定，且无不良药理或光化学特性5。光解后释放的尼古丁可预期地激活烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs），而光解副产物在药理学上呈惰性5。光解光源采用连续波激光器，样品处测得输出功率&#62;1 mW。当局部靶向光刺激与双光子激光扫描显微镜（2PLSM）对细胞膜的定位能力相结合时，该方法的两个关键优势得以充分实现：光解速度与空间精度。
在大多数方面，PA-Nic 的光解作用在向脑切片内烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）递送配体方面优于其他方法。此类方法包括浴式给药7 局部药物递送 通过 一个吹打移液器8前者方法往往过度强调所用药物的长期效应，而后者方法则可能因试验之间以及不同细胞之间的反应动力学存在变异性而受限。这两种替代方法均无法充分区分同一神经元中不同细胞定位的受体活性。光遗传学激活的乙酰胆碱释放已被用于研究内源性nAChRs9,10,11，但该方法在定位亚细胞水平的nAChR分布方面尚未显示出实用性。此外，大多数采用该方法的研究依赖于表达ChR2的细菌人工染色体转基因小鼠，而这种小鼠具有异常的胆碱能传递功能12,13,14,15,16,17.
PA-Nic 光解并非研究胆碱能受体的唯一光学方法。已有研究使用笼锁型卡巴胆碱在培养细胞18和脑切片19中功能性地定位乙酰胆碱受体活性，但在 PA-Nic 开发期间，该试剂无法商业化获取，限制了其比较研究。据报道，钌双联吡啶-尼古丁复合物（RuBi-nicotine）可用于释放尼古丁20，但在直接对比实验中，市售的 RuBi-nicotine 表现劣于 PA-Nic5。使用非商业化且高纯度的 RuBi-nicotine 重复此类比较实验可能具有价值，因其可见光吸收特性或可补充 PA-Nic 在胆碱能研究中的优势。最后，烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）也可通过光控开关配体与基因改造受体的组合实现光学操控21。该方法在脑组织研究中与 PA-Nic 光解互为补充，其对改造后 nAChR 进行遗传靶向的能力既被视为优势，也被视为局限。
应注意到该方法的几个关键要求。首先，需要一种适当的可视化方法以准确定位神经元膜。在研究培养细胞时，使用传统的落射荧光显微镜成像可能已足够；但在脑片或其他较厚组织样本中记录神经元活动时，则必须采用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）或共聚焦显微镜。其次，需要一种合适的方法来定位光解激光束。本方法采用带有两个独立x-y镜的双振镜扫描头，分别用于成像光束的光栅扫描和解笼激光束的定点光激活22,23,24。也可采用其他较为有限的方案，例如：（1）使用单振镜扫描头交替进行成像光束和解笼光束的光栅扫描，或（2）将解笼光束直接导向视场中心，使细胞移至该位置进行闪光光解。&#160;第三，若希望在实验过程中同步采集生理信号，则必须具备电生理记录系统。上述要求可通过一种合适的全光学成像技术实现，如近期文献所述5。下文提供了一个详细的操作方案，描述了该方法的关键步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;仪器、耗材及各类化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices 公司</td><td></td><td>膜片钳放大器</td></tr><tr><td>气动皮升泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>振动刀片切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC 离心滤器</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC30GV0S</td><td>内液过滤器</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td>膜片与局部施加移液管</td></tr><tr><td>(-)-烟碱酒石酸氢盐</td><td>格伦塔姆</td><td>GL9693</td><td>烟碱盐</td></tr><tr><td>7-羧甲基氨基-4-甲基香豆素</td><td>珍利亚研究园区</td><td></td><td>PA-Nic副产物</td></tr><tr><td>1-[7-[双(羧甲基)氨基]香豆素-4-基]甲基-烟碱</td><td>珍利亚研究园区</td><td></td><td>PA-Nic</td></tr><tr><td>Euthasol（戊巴比妥钠和苯妥英钠）</td><td>Virbac</td><td>ANADA #200-071</td><td></td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 488 肼</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A10436</td><td>绿色填充染料</td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 568 肼</td><td>ThermoFisher</td><td>A10437</td><td>红色填充染料</td></tr><tr><td>6-羧基-AF594（Alexa Fluor 594）</td><td>珍利亚研究园区</td><td></td><td>红色填充染料</td></tr><tr><td>QX 314 氯化物</td><td>Tocris</td><td>2313</td><td>电压门控钠通道阻滞剂</td></tr><tr><td>功率计&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>S120C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;溶液配制用化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-甲基-D-葡糖胺</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>(+)-抗坏血酸钠</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;&lt;/em&gt;四乙酸</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;prime;三磷酸镁盐</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷-5′&amp;prime;三磷酸钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;双光子显微镜的组成部分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;nbsp;Olympus BX51显微镜用Ultima激光扫描仪&lt;/strong&gt;</td><td>布鲁克纳米公司</td><td></td><td>成像软件和振镜</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 成像X-Y检流计</td><td>剑桥技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Mai Tai HP1040&lt;/strong&gt;</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>可调谐红外激光器</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;Pockels盒 M350-80-02-BK 配 M302RM 驱动器&lt;/strong&gt;</td><td>Conoptics, Inc.</td><td></td><td>用于红外激光衰减</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 积分球光电二极管功率传感器</td><td>Thorlabs, Inc</td><td></td><td>激光功率分束光电二极管</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 解笼X-Y检流计</td><td>剑桥技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Helios 双线激光发射系统&lt;/strong&gt;</td><td>布鲁克纳米公司</td><td></td><td>解笼激光组件</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; OBIS LX/LS 405 nm（100 mW）</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; OBIS LX/LS 473 nm（75 mW）</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;Limo Sidecar 的点光激活/光纤输入模块——解笼</td><td>布鲁克纳米公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;正置显微镜&lt;/strong&gt;</td><td>&amp;nbsp;奥林巴斯</td><td>BX51WIF</td><td>直立式显微镜机身</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 目标：奥林巴斯 M Plan FL 10倍物镜；数值孔径 0.3，工作距离 11 mm</td><td>&amp;nbsp;Olympus</td><td></td><td>10倍物镜</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 目标：奥林巴斯 M Plan 萤石 60x/1.0 工作距离=2 mm 近红外</td><td>&amp;nbsp;Olympus</td><td></td><td>60倍水浸式物镜</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; X-Cite 110，四LED LLG耦合落射荧光光源</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>LED光源</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 落射荧光滤光片：用于落射转塔的ET-GFP（FITC/CY2）</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>用于蓝光激发的LED滤光片</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 落射荧光滤光片：用于落射转塔的 ET-DsRed（TRITC/CY3）</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>用于绿光激发的LED滤光片</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; B&amp;amp;W CCD相机；Watec，0.5英寸黑白CCD</td><td>Watec Co., LTD.</td><td></td><td>用于膜片钳记录的CCD相机</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;外部探测器 - 双通道反射发射 - 奥林巴斯直立显微镜（多碱，GaAsP）&lt;/strong&gt;</td><td>布鲁克纳米公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 多碱侧窗光电倍增管</td><td>滨松</td><td>R3896</td><td>红色通道PMT</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 595/50m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>红色通道发射滤光片</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 565lpxr</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>二向色镜分光器</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; GaAsP端窗型光电倍增管</td><td>滨松</td><td>7422PA-40</td><td>绿色通道PMT</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 525/70m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>绿色通道发射滤光片</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 用于滨松H7422光电倍增管的高速快门</td><td>Vincent Associates / Bruker</td><td>517329</td><td>PMT快门支架</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;Dodt梯度反差透射检测模块&lt;/strong&gt;</td><td>布鲁克纳米公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 多碱侧窗光电倍增管</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>Dodt PMT</td></tr></tbody></table>

通过光激活型尼古丁的激光闪光光解法探查小鼠脑片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

乙酰胆碱（ACh）通过受体调控多种神经元过程，但将ACh受体功能与其在细胞内执行功能的亚细胞定位相联系一直具有挑战性。为了研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）在原生脑组织中的亚细胞定位，开发了一种光学方法，可在电生理记录期间，在靠近神经元膜的特定位置精确释放尼古丁。在脑切片中对神经元进行膜片钳记录并用染料填充，以便在双光子激光扫描显微镜下观察其形态；通过聚焦405 nm激光束至一个或多个细胞膜附近，以光脉冲实现尼古丁的解笼。测量细胞电流偏转，并对记录的神经元生成高分辨率三维（3D）图像，从而将nAChR反应与细胞形态相对应。该方法可对复杂组织样本中nAChR的功能分布进行详细分析，有望加深对胆碱能神经传递的理解。

光解刺激中，曝光剂量（强度和时间）、曝光位置和光束几何形状是关键变量。本文所述系统可提供两种不同的光刺激光束，并可调节 通过 在光刺激光路进入振镜系统之前，将透镜移入或移出光路。若不使用此透镜，光刺激光束将充满60倍/1.0数值孔径水浸式[60x WD]物镜的入瞳，从而产生接近衍射极限的亚微米级光斑。µm 样品内部焦平面上的光斑。这与具有沙漏形状的光刺激光相关，该光斑沿光轴对称地向上和向下延伸。当透镜插入光路后，光刺激激光被聚焦到物镜的入瞳，并随后以类似铅笔状的光束射出。该光束预计约为10 µm 直径为60倍物镜的激发区域在整个样品中均匀/垂直延伸。在此模式下，激发光斑内任意位置的光强约为接近衍射极限的小光斑光强的1%。因此，使用约10 µm 点刺激。本文报道的所有实验均采用沙漏形光刺激光束。
在使用功率计测量样品处的激光功率后，可将输出到样品的功率随输入电压设定值作图。本研究采用数值孔径（NA）为60倍、工作距离为2 mm的物镜，但在进行功率测量时物镜未浸入水中，以避免可能对探测器元件造成损坏。当在空气中（无浸液）测量标称NA > 0.95的物镜时，由于空气折射率较低，物镜前表面元件处可能发生全内反射损耗。在此情况下，为更准确地测量样品处的激光功率（以校正全内反射损耗），应将空气中测得的1.0 NA物镜的功率乘以(1.0/0.95)2进行修正。 图1a 展示了本研究中所用激光发射系统集成的405 nm和473 nm可见激光器典型的输入/输出关系曲线。这些激光系统非常适合用于光刺激暴露剂量的控制，原因如下：（1）系统出厂前已校准，输出功率相对于输入电压（0–5 V）呈严格的线性关系；（2）具备静音快门操作功能（关闭时无激光输出）；（3）具备快速、亚毫秒级的光强脉冲持续时间控制能力（响应时间0.1 ms）。在使用激光/振镜系统进行点状光刺激时，对MarkPoints点位进行常规校准是一项关键任务。图1b（左图）展示了一个未校准的系统（预期的光刺激点未能准确激发目标位置，如灼烧孔位置所示），经校准后点位定位恢复准确（图1b，右图）。 
PA-Nic 具有较弱的荧光性（发射峰位于约 510 nm），在 350–450 nm（单光子激发）或 700–900 nm（双光子激发）范围内表现出有效的激发。5为了在局部施用过程中可视化PA-Nic，将PA-Nic（1 mM）施加于脑组织附近，同时成像以下两项内容：（1）通过Dodt反差法获取脑组织光学切片的透射图像，以及（2）PA-Nic在900 nm激发下产生的发射荧光。在通过局部施用移液管加压喷射过程中，PA-Nic的双光子荧光可被清晰检测到。图2a尼古丁和一种单烷基香豆素，即7-羧甲基氨基-4-甲基香豆素，是PA-Nic光解反应的主要光化学产物。5使用与PA-Nic成像相同的成像设置/参数，在递送尼古丁（1 mM）或7-羧甲基氨基-4-甲基香豆素（1 mM）期间对组织进行成像。未检测到荧光信号（图 2a，中图和下图），证明了PA-Nic结果的特异性。最后，将PA-Nic应用于脑组织中，并对PA-Nic的荧光发射进行成像（图 2b）。该方法证实了PA-Nic存在于100-200 µm 局部给药移液管的应用。这些数据共同证实了PA-Nic可有效递送至脑组织 通过 局部应用
为可视化细胞结构而进行同时的电生理记录与双光子激光扫描显微成像（2PLSM），要求研究者兼顾实验中两个部分的条件，通常从封接细胞后获得有效样本数据的时间窗口较窄（约20分钟）。若不考虑细胞可视化，最佳实践是在破膜后尽快开始记录，因为记录稳定性通常随时间推移而下降。然而，当需要成像时，电生理操作必须为荧光物质在细小或远端结构中的充分富集留出足够时间。这一点可通过分析染料浓度填充曲线28加以说明，该曲线在对新型细胞进行成像时常有助于确定最佳成像时机。图3展示了通过2PLSM获取的多个Z轴层扫图像，并将其合并为最大强度投影以供展示。图3a显示了高质量图像，神经元形态完整，背景噪声最小，且无碎片干扰对细胞形态的判断。图3b图像质量较低，表现为信噪比较低且存在大量碎片。这些碎片常呈现为强荧光的球形团块，源于移液管在接近细胞过程中将成像染料排出所致。值得注意的是，在灌流实验中若在浴液中加入100 µM PA-Nic，往往会降低信噪比，导致图像对比度次优。在局部应用实验中，Alexa Fluor 568或594常作为定位染料或用于双光子激发（2PE）的参考/归一化信号，具有较高实用性。这些染料的有效双光子激发波长约为780 nm27，可实现PA-Nic与细胞区室的同时可视化。然而，该波长仍无法完全避免对PA-Nic的双光子光解5。在PA-Nic浴液应用实验中，Alexa Fluor 488更具优势；当使用合适波长（≥900 nm）激发时，可在保持细胞区室良好可视化的同时，有效避免PA-Nic的双光子光解5。
图4展示了在脑片中MHb神经元上进行局灶性PA-Nic激光闪光光解的示例数据。图4a（上图）显示了一个“参考”图像的示例，该图是运行MarkPoints程序前最后一次双光子激光扫描显微镜（2PLSM）图像的屏幕截图，并叠加了光刺激位点的位置。图4a（下图）显示了叠加在细胞形态上的光刺激位点的放大视图。相应的PA-Nic光解时间相关电生理反应如图4a下图所示。先前的研究表明，这些电流对nAChR拮抗剂敏感5。图4b展示了在不同细胞中进行单点光解的代表性数据，光解间隔分别为1 s或10 s。10 s的间隔足以使静息保持电流恢复至基线水平，而较短的1 s间隔则导致随着实验程序的进行，保持电流逐渐增加。电流的持续上升表明，在1 Hz的时间间隔下，尼古丁没有足够的时间从系统中扩散出去29。对于任何新研究的细胞类型，都必须重新进行此类时间反应分析，因为不同细胞类型的nAChR神经药理学特性可能存在差异。
<img alt="激光校准图表和显微镜图像；显示功率标定和光束聚焦校准结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：光刺激激光校准。（a）光刺激激光输出功率。通过60倍/1.0 NA水浸物镜，在样品平面上测量了405 nm和473 nm光刺激激光在指定输出设置下的功率。（b）光刺激激光校准。MarkPoints软件校准前后，预期光刺激位点与实际发生光刺激位置（烧蚀孔）之间空间关系的屏幕截图（校准前为左图，校准后为右图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用GaAsP光电倍增管强度进行尼古丁检测的光子计数显微成像，图示分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：PA-Nic 的局部施用。 （a）通过局部施用移液管检测 PA-Nic。将 1 mM PA-Nic、光解副产物或尼古丁溶解于人工脑脊液（ACSF）中，装入局部施用移液管，并在双光子激光扫描显微成像（2PLSM，激发波长 900 nm）过程中以相同的成像参数施加于脑组织。激光扫描 Dodt 反差透射图像显示组织与移液管位置，同时使用 GaAsP 阴极光电倍增管（PMT）采集荧光发射信号。（b）将 PA-Nic（1 mM）灌注至脑组织，并如（a）中所述进行 2PLSM 成像，以显示其通过本征荧光的侧向扩散情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控液滴形成的比较；显微镜图像；流体动力学，液滴尺寸。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：双光子激光扫描显微成像的获取。（a）优质的双光子激光扫描显微镜（2PLSM）Z轴层扫图像。展示了两个MHb神经元的2PLSM Z轴层扫最大强度投影示例，其树突结构清晰，且几乎没有杂质干扰。（b）次优的2PLSM Z轴层扫图像。展示了两个被杂质包围的MHb神经元的2PLSM Z轴层扫最大强度投影示例（杂质为移液管接近细胞时排出的染料）。此类图像比（a）中的图像更难解读。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示神经元活动及电流测量的荧光显微镜与电生理学图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：PA-Nic 的激光闪光光解。 （a）MarkPoints 参考图像及由 PA-Nic 光解诱发的内向电流。针对一个 MHb 神经元，展示了在单一（已标明）细胞位置进行 MarkPoints 光刺激实验时的原始参考图像。请注意，对于某些光刺激位置（本系列中最右侧图像），树突结构处于焦平面，但胞体和近端树突则不在焦平面。每个参考图像下方绘制了尼古丁光解诱发的内向电流。（b）PA-Nic 光解的刺激间间隔。展示了 MHb 神经元的代表性记录，其中尼古丁在同一围胞体区域以 1 s 或 10 s 的刺激间间隔重复光解释放。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过尼古丁光解技术在小鼠脑切片中研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的方法。当该技术与同时进行的膜片钳记录和双光子激光扫描显微镜相结合时，尼古丁光解能够将烟碱型受体功能与细胞形态联系起来，从而加深对胆碱能神经生物学的理解。

乙酰胆碱（ACh）通过受体发挥作用，调控多种神经元过程，但将ACh受体功能与……联系起来一直具有挑战性

该技术利用多光子激光扫描显微镜结合光激活型尼古丁分子的激光闪光光解，实现对烟碱型胆碱能受体的精确激活。该方法可在时空上精细控制烟碱型受体激动剂的应用，为研究受体功能表达模式以及胆碱能突触传递或容积传递提供了强有力的工具。开始实验前，使用可编程的拉针仪将玻璃微电极拉制成直径为20至40微米的开口。将约一毫升记录液通过0.22微米滤膜过滤。然后将足量的冻干型光激活尼古丁溶解于过滤后的记录液中，使其终浓度为2毫摩尔。用50微升光激活药物回填已拉制的局部给药微移液管，并将移液管固定在安装于显微操作仪的移液管架上。通过适当长度的管路将移液管架连接至可维持低压力持续给药的压力喷射系统。使用显微操作仪将局部给药移液管移入细胞外记录液中。将移液管尖端置于小鼠脑组织样本上方约50微米处，靠近目标细胞。短暂施加1至2磅每平方英寸的压力至移液管。目标细胞应几乎无位移或完全无位移。在建立稳定的全细胞膜片钳记录后，打开压力喷射装置的低压力模式，用光激活型尼古丁对细胞周围组织灌注 1 至 2 分钟，使其充分饱和。局部给药会增加实验的复杂性，但可节省化合物用量，并允许使用更高浓度的光激活型尼古丁（PA-Nic）。对于光激活型尼古丁的浴式给药，首先将足量的冻干药物溶解于适量的记录液中，配制成终浓度为100微摩尔的溶液，并将其加入灌流系统。然后以每分钟1.5至2毫米的流速开始循环灌注光激活型尼古丁溶液，使用内径最小且总长度最短的管路，以尽量减少所需的循环体积。在循环过程中，持续用碳氧混合气体（carbogen）鼓泡通入溶液，并在弱光条件下将浴液温度维持在32摄氏度。浴式给药具有操作简便且光敏尼古丁（PA-Nic）在组织中渗透均匀的优点，但必须使用较低的微摩尔浓度PA-Nic，且会消耗更多的化合物总量。为了实时观察内侧缰核神经元，使用透射光或红外微分干涉差光学系统，并结合视频摄像机建立稳定的全细胞膜片钳记录。在形成高阻封接的细胞贴附构型后，但在破膜之前，将装置和软件切换至激光扫描模式。破膜后，利用激光扫描确认目标成像染料是否通过扩散被动填充神经元。在使用活体扫描功能观察目标神经元及亚细胞结构之前，让染料至少填充细胞区室 20 至 30 分钟。选择合适的成像参数，以准确地实时显示神经元特征，并根据需要调节相应设置，以调整显示效果、分辨率、信噪比和图像帧采集时间。为增强信号对比度，打开查找表窗口，并调节查找表的下限（floor）和上限（ceiling）设置。为了在组织中定位感兴趣的区域，选择1倍光学变焦，并使用平移控件。使用Z系列工具选择包含目标细胞的起始和终止位置。设置步长为1微米，并选择能够获得最高分辨率图像的图像尺寸。通常每行 1,024 × 1,024 像素。随后连续对包含细胞的每一个 Z 平面中的神经元进行成像。为校准激光刺激，启动系统扫描，使用高于最低功率的成像激光功率，并微调物镜焦点至薄红色标记荧光层。选择荧光视野中无碎片且标记物覆盖均匀的区域，打开工具、校准与对齐菜单，选择解笼galvocalibration功能。按照烧蚀斑点教程对第二对振镜进行空间校准，选择405纳米激光，激光刺激功率设为400，刺激持续时间为20毫秒，以在红色标记物上形成直径为1至5微米的孔洞。选择“更新”以在中心点烧蚀后激发并刷新图像，并将圆形红色指示器移至中心、右中和下中位置的实际光斑处，以获得一个由九个光斑组成的网格。为测试校准效果，打开标记点窗口，并在样品的新区域手动激活已定义光斑的刺激参数，注意确保标记点窗口中已加载最新的校准文件。然后施加测试脉冲以验证校准是否正确。为了快速成像并定位感兴趣的亚细胞区域，选择实时扫描，并根据需要增加光学放大倍数以观察微小结构。将标记点单点十字光标放置在细胞膜附近，设置光刺激参数为1至50毫秒持续时间、1至4毫瓦激光功率，并至少设置一次重复。然后选择运行标记点以启动标记点实验程序，并实时观察电生理数据的采集过程。如图所示，在通过局部施加移液管加压喷射时，一毫摩尔浓度的光激活尼古丁（PA-Nic）的双光子激发（2PE）荧光信号可被轻松检测到。而在相同浓度、激发功率和波长条件下，光激活尼古丁光解反应的主要光化学产物均未产生任何荧光信号，从而证明了光激活尼古丁结果的特异性。如图所示，将光激活型尼古丁施加于脑组织后进行成像，结果显示药物存在于局部施加移液管周围 100 至 200 微米范围内，证实光激活型尼古丁可通过局部施加有效递送至脑组织。此处展示的高质量图像中，神经元形态完整，噪声被最小化，且碎片不干扰细胞形态的判读。然而，这些图像质量较低，原因在于信噪比较低以及存在大量碎片。将脑切片中内侧缰核神经元的双光子激光扫描显微成像与PA-Nic的激光闪光光解技术结合使用，如本研究所示，可实现电生理反应与细胞形态学之间的相互印证。以10秒间隔进行单点光解，可为基线保持电流提供足够的恢复时间。而使用1秒的较短间隔则会导致随着实验方案的进行，保持电流逐渐增加，提示尼古丁在较短时间间隔下未能充分从系统中扩散出去。在设计使用光可激活分子的实验时，重要的是要选择激发和发射光谱相匹配的荧光指示剂和报告荧光基团。由于PA-Nic具有短波长的光解峰，因此可与大多数常见荧光基团兼容。在选择最合适的PA-Nic应用技术时，必须仔细考虑目标神经元中烟碱型受体的功能表达及其生理活性。熟练运用该技术可实现对尼古丁施加的精细时空控制，从而为研究天然烟碱型受体的结合动力学、亚细胞定位以及烟碱型受体激活对神经元活动的调控开辟了令人振奋的新途径。

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