将微流控技术与微电极阵列结合用于研究神经元通讯及轴突信号传导

本实验方案的总体目标是展示如何将微流控技术与微电极阵列结合，构建适用于研究神经元通信和轴突信号传导的平台。大家好，我是保罗·阿吉亚尔（Paulo Aguiar），葡萄牙波尔图大学INEB神经工程与计算神经科学实验室的课题负责人，此前曾在该校生物医学工程专业任教。理解神经回路中的信息传递机制，仍是神经科学领域面临的最大挑战之一。

今天，我将向您展示如何将我们实验室开发的单个微驱动器阵列与微流控技术及软件工具相结合，以检测和表征传播的动作电位。我们在多种研究中使用该装置，主要包括神经编码与解码，以及感觉神经元与其他细胞类型之间的通讯。我们认为，对该实验方案进行可视化演示至关重要。

由于微流控和微电极阵列的组装难以操作，且仅通过重复实验方案难以重现。对于市场而言，该平台上的培养销售并不像传统的ABAs那样直接，且需要特别关注细胞接种相关操作以及培养磁体。该装置使我们能够在高度可控的环境中研究多种与通信相关的特性，例如信号传播速度和方向。

尽管记录过程较为简单，但数据分析需要具备相关知识并使用合适的计算工具。在细胞贴附实验的前一天，首先通过使用乙烯基胶带清洁微流控装置来准备设备。轻轻将胶带按压在装置表面，以确保覆盖微流控装置的所有区域。

将MEA置于空气等离子体中清洗三分钟，以清洁表面并使其更具亲水性。在超净工作台内，将微流控器件浸入70%乙醇中，随后使其自然晾干。

将每块MEA置于培养皿中，通过15分钟紫外光照射进行灭菌。然后，在MEA的中央区域加入500微升PEI溶液，孵育至少1小时。

在超净工作台内，吸除MEA表面的PEI包被液。随后，用一毫升无菌水将MEA清洗四次。操作过程中使用置于超净工作台内的无菌显微镜辅助完成。

将MEA芯片居中放置，并向MEA的中央区域加入一毫升无菌水。接着，将微流控装置置于MEA表面之上，小心对齐微通道与MEA的微电极阵列。吸除多余的水分，并在37摄氏度下孵育过夜，以确保细胞完全贴附。

第二天，向孔板中加入层粘连蛋白，并再次孵育。收集胚胎悬浮液后，进行前额叶皮层解剖。首先使用一对镊子小心暴露脑组织。

然后，轻柔地将脑组织从颅腔中取出，用冷的 H-HBSS 覆盖。若存在嗅球，应将其去除并丢弃。

最后，解剖前额叶皮层。确保完全去除软脑膜。对两个半球重复此操作。

根据您的研究所需的脑组织数量，在超净工作台内，将先前解剖得到的皮层组织碎片收集至总共5毫升的H-HBSS溶液中。随后，将这些组织碎片转移至一个无菌的15毫升离心管中。

用移液器将2.3毫升 freshly prepared trypsin 溶液加入含有皮质碎片的试管中。混匀悬浮液，在37°C下孵育15分钟，每5分钟振荡一次。

然后，弃去含有胰蛋白酶的上清液，加入含胎牛血清（FBS）的 H-HBSS 以灭活残留的胰蛋白酶。轻轻振荡。让皮质碎片沉降，随后弃去上清液。

用H-HBSS洗涤两次，以去除FBS，再次弃去上清液。加入添加物的神经基础培养基，通过缓慢吹打重悬液来机械解离组织。将盐悬浮液经细胞滤网过滤，以去除残留组织。

然后，取20微升细胞悬液与20微升台盼蓝混合。取10微升混合液加入血细胞计数板（Neubauer chamber），计数活细胞数量。在细胞接种前立即从微流控装置（micro EF）的所有孔中去除层粘连蛋白。随后，将少量上清培养基加入轴突室的每个孔中。

缓慢将5 µL细胞悬液接种至胞体区室。在37°C孵育1小时，使细胞贴附于基质。1小时后，轻轻向每个孔中加入温热的完全培养基。

添加少量液体以避免细胞脱落。然后将微电场装置转移至培养箱中。此处显示的是体外培养五天的细胞培养物。

一周后，培养物开始出现自发活动。在进行记录之前，使用温度控制器加热前置放大器的底板。然后，将微电极阵列放置在前置放大器上，并盖上盖子并扣紧。

开始记录时，打开多通道实验软件。将采样率设置为 20 千赫兹。拖动滤波器和记录模块，并将它们依次连接，以同时记录原始数据和滤波后的数据。

启动数据采集以可视化信号，并快速记录。可使用多通道分析仪快速浏览所记录的数据。在此，信号沿微沟槽的传播已清晰可见。

为了识别和表征这种传播性事件，请在 micro spike hunter 中打开您的记录文件。单击文件信息按钮以访问记录设置，并选择用于分析的微电极阵列。设置传播性事件检测的阈值。

以及快速读取数据。软件将列出所有检测到的序列。用户随后可根据成对微电极之间的信息，结合它们之间的距离和互相关性，评估传播速度。

化学图工具允许用户手动估算传播速度。此处显示的是一个沿微沟道内四个微电极检测到的传播事件。

这些事件可以在Rasser图中表示。此处显示的是记录前两分钟内沿11条微沟槽传播的活动。高活性和低活性的微沟槽分别用黄色和红色表示。

注意沿11条微沟槽的活动同步性。这种同步性与活动速率无关。从两条微沟槽瞬时放电率的变化中可以明显看出这一点。

微沟槽还可作为轴突信号放大器，如箱线图所示。我们已向您展示了如何将微流控技术与多电极阵列（MEAs）结合，以及如何在这些装置上培养神经元，同时还介绍了如何进行记录并从记录数据中提取有意义的信息。

我们希望本演示对您的研究有所帮助，特别是当您希望研究神经回路中的信息传递时。