自体影像学作为一种简单而有力的药理靶标可视化和表征方法
2019年3月12日
自体影像学方法通常用于研究放射线与组织切片的结合, 以确定定性或定量药理学。
自动造影是一种强大而简单的技术，用于研究使用特定放射性基因在组织中蛋白质结合位点分布。它也是免疫基础化学的合适替代品。该技术通过比传统胶片曝光更快的数字图像，以空间分辨率可视化蛋白质表达。
它也可用于蛋白质靶点的药理分析。该方法涉及安装在玻璃上的小鼠组织，但可以扩展到其他物种，甚至扩展到在盖玻片上生长的细胞。演示程序将由纳内格里姆-克雷，一个博士生在我的实验室。
首先，将组织淹没在粉状干冰中，以捕捉冻结。将冷冻组织直接转移到温度设置为零下 20 摄氏度的低温恒温器。让组织在低温恒温器中适应零下20摄氏度20分钟。
然后用低温恒温器外的嵌入介质覆盖组织支架，并快速将冷冻组织标本放在所需方向，而嵌入介质仍然是液体。将组织支架转回低温恒温器，将嵌入介质暴露在零下 10 摄氏度以下的温度下进行硬化。将组织支架放置到低温恒温器的微原子中。
调整组织的方向以避免倾斜部分。在所需厚度部分的立体税图集的指导下切割组织，如有必要，用小刷子展开剖面。将截面安装到显微镜幻灯片上。
然后按顺序从感兴趣的区域收集部分，以进行所需的技术重复。在进一步处理之前，让幻灯片上的部分风干一小时。在经过认证的放射性实验室中，使用铅笔将幻灯片与实验条件标记。
水平将幻灯片放在塑料托盘中。小心地将调整到有关目标的 SA 缓冲区的适当卷应用于幻灯片上安装的部分。确保每个部分都完全覆盖。
为确定非特异性结合，用相关浓度的未标记化合物补充SA缓冲液。然后用盖子盖住托盘，避免蒸发。在设定为 20 rpm 的板摇床上，在相关温度下预孵育 30 分钟。
接下来，从每张幻灯片中倒出预孵化液，然后将幻灯片重新转移到塑料托盘中。立即用 SA 缓冲液的相关浓度完全覆盖各部分。为确定非特异性结合，补充放射性利甘溶液与相关浓度的未标记化合物。
用盖子盖住托盘，并在所需条件下孵育，在 20 rpm 时持续轻轻摇晃。在此之后，倒掉孵化溶液，将幻灯片转移到显微镜幻灯片架中。立即清洗幻灯片。
对于 GHB 协议，用冰冷 SA 缓冲液洗两次 20 秒，然后通过将滑动架浸入装满冰冷蒸馏水的托盘中冲洗两次。将滑梯垂直放置在机架中，风干至少一小时。然后将幻灯片转移到含有甲状甲醛的固定器中，在室温下进行隔夜固定。
第二天，在室温下将幻灯片转移到含有硅胶的干燥器盒中。将幻灯片放在干燥器盒中三小时，以消除水分。首先，将部分放入辐射屏蔽成像板盒中，组织朝上。
在每个盒式磁带中包括放射性微尺度，以便随后对放射性结合进行定量。在使用前，立即将钛敏感磷成像板加载到荧光成像机中，然后根据制造商的指示将其暴露在可见光下。然后从荧光成像机上取下成像板，并立即将其放在盒式磁带的截面上。
确保盒式磁带完全关闭。将各部分暴露在荧光成像板上，在室温下优化曝光时间，同时屏蔽光线。曝光后，小心地在黑暗中打开盒式磁带，并立即将成像板转移到荧光成像仪的暗盒中。
以尽可能高的分辨率扫描板以获得数字图像。首先，打开适当的图像分析程序。通过选择菜单项区域确定，确定每个校准标准的相对光学密度。
选择用于区域创建的工具，并用它来为放射性微尺度的每个点选择大小相等的区域。单击菜单项标签下的数字，为每个选定区域分配一个数字。单击"文件导出"，然后单击 2D 区域报告，以导出校准标准每个点的 OD 值。
在专有成像软件中，使用区域创建工具选择每个部分中感兴趣的区域并测量其 OD，以开始执行自动放射图的量化。通过为感兴趣区域创建模板，选择每个部分中的同一区域，并复制并调整其以适应每个自动放射图中大脑解剖学的细微变化。之后，单击"文件导出 2D 区域报告"将所选区域的 ROD 值和大小导出到电子表格中。
确定文本协议中概述的无线电绑定。在这项研究中，高亲和力GHB结合位点的解剖分布与小鼠大脑中的放射性标记GHB模拟放射性 HOCPCA进行可视化，该分布被切成冠状、下垂和水平部分。在海马和皮层中可以看到高水平的结合，而在线状体中可以看到较低的结合水平，在小脑中未检测到结合。
如这里所示，解剖结构可以使用不同的平面进行可视化，解剖完整性可能由紫红色染色支持。老鼠、老鼠和猪的代表性自动放射图说明了哺乳动物大脑中高亲和力GHB结合位点的进化保护。在所有三个物种中检测到放射性 HOCPCA 结合位点，从而比较它们之间的大脑解剖量。
高亲和力GHB绑定站点使用GHB无线电基安，这些辐射点显示绑定站点的不同亲和力，但具有可比性的特定活动。放射性 HOCPCA 具有高灵敏度和出色的信噪比。由于放射性NCS-382的灵敏度较低，必须使用较高的放射性利甘浓度才能获得类似的结合水平。
放射性 GHB 达到可比的结合水平，甚至更高的放射性利格和浓度也是必要的。然而，较高的放射性和浓度也会增加非特异性结合水平，从而降低信噪比。优化测定条件（如放射性浓度、洗涤和曝光时间）非常重要，以便获得最佳的信号与噪声比，并且记住之前擦除板也很重要。
该过程可以扩展到体内条件，以获得关于活动物的化合物结合的想法，这可能对发现项目有用。记得在经过认证的全放射性物质实验室工作，在处理放射性或甲状甲醛时穿穿防护服。
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概述
这项研究展示了自动放射自显影作为一种量化组织切片中放射配体结合的有效技术。通过使用小鼠组织，该方法以高空间分辨率可视化结合位点，为传统成像方法提供了一种更快的替代方案。
研究的关键组成部分
科学领域
- 药理学
- 神经科学
- 成像技术
背景
- 自动放射自显影允许检查蛋白质结合位点的分布。
- 它作为免疫组织化学的合适替代方案。
- 该方法提供比传统方法更快的数字可视化。
- 该技术也可用于药理学分析。
研究目的
- 说明组织样品中自动放射自显影的程序。
- 展示蛋白质表达的空间分辨率。
- 突出不同脑区中的结合位置差异。
使用的方法
- 使用小鼠组织，这些组织被快速冷冻和切片。
- 自动放射自显影方法包括用放射配体标记并孵育组织切片。
- 重要步骤包括组织准备、孵育、洗涤和成像。
- 使用磷光成像板进行数字成像以量化结合。
主要结果
- 观察到高亲和力GHB结合位点的明显解剖分布。
- 在海马和皮层中发现高结合水平。
- 在纹状体中发现较低的结合水平，在小脑中未检测到结合。
- 该研究提供了不同平面上解剖结构的关键可视化。
结论
- 该研究强调自动放射自显影作为可视化组织中蛋白质结合的强大工具。
- 它增强了对脑区结合位点分布的理解。
- 该方法可以为药理学评估和神经机制的理解提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Autoradiography enables precise visualization and quantification of pharmacological target distribution in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides spatially resolved binding data that informs ligand selectivity and affinity measurements, directly impacting lead identification and portfolio triage decisions. Its compatibility with multiple species and tissue types enhances translational continuity from discovery through preclinical assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Visualizes anatomical distribution of high-affinity binding sites to interrogate therapeutic hypotheses and clarify target engagement.
- Operational Value: Enables pharmacological characterization of ligand affinity through Kd, Ki, and Bmax measurements in selected tissues.
- Strategic Value: Supports predictive confidence by quantifying target density and selectivity across brain regions for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative autoradiograms with high spatial resolution for reliable compound evaluation in validated biological systems.
- Operational Value: Standardizes binding assay parameters including radioligand concentration, washing, and exposure time to optimize signal-to-noise ratios.
- Strategic Value: Facilitates assay reproducibility and scalability across species (mouse, rat, pig) demonstrating evolutionary conservation of targets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates evolutionary conservation of high-affinity GHB binding sites across mammalian species, supporting cross-species target validation.
- Operational Value: Enables comparison of gross brain anatomy between species using consistent radioligand binding patterns.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing binding site distribution data relevant to neurological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative binding data that supports mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing target distribution in distinct anatomical structures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and imaging protocols that yield reproducible quantitative outputs.
- Analytics: Enables measurement of relative optical densities and region-of-interest quantification for comparing binding levels across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by demonstrating target conservation across species and anatomical planes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for pharmacological target characterization applicable to diverse discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target localization and ligand selectivity characterization reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding assays across tissue types and species.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative binding site density and distribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radioligand handling, tissue sectioning, and radioactive material safety protocols.
- Dependent on specialized instrumentation including cryostat, phosphor imaging plates, and image analysis software for quantification.
- Necessitates cross-team standardization of binding assay parameters such as incubation temperature, washing steps, and exposure times.
- Involves adaptation considerations across model systems including tissue mounting, section thickness, and blocking agents for non-specific binding.
- Includes practical limitations such as the need for certified radioactivity laboratories, signal-to-noise optimization, and careful selection of radioligand concentration to minimize non-specific binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Tissue Preparation by Cryosectioning
2:13
In vitro Autoradiography
4:44
Exposure to Phosphor Imaging Plates and Scanning
6:04
Densitometric Analysis of Digital Image
7:34
Results: Visualization and Characterization of Pharmacological Targets Using Radiography
9:34
Conclusion
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