Name: 在成细胞分化和融合过程中利用活成像跟踪核 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解利用活细胞成像技术跟踪成肌细胞分化过程中细胞核动态的方法。本研究展示如何结合原代细胞分离与自动追踪算法，定量分析细胞核在肌管形成中的运动轨迹，为肌肉发育研究提供重要见解。

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本工作获得了法国肌肉萎缩症协会-电信基金会（AFM-Telethon）对 E.V. 的资助（项目编号 #21545）以及圣拉斐尔医院（OSR）对 S.Z. 的种子基金资助（项目编号 ZAMBRA5X1000）。特此感谢巴斯德研究所影像分析中心的 Jean-Yves Tinevez 博士公开分享其 &#34;Simple Tracker&#34; MATLAB 程序。

所有涉及动物实验的操作均经圣拉斐尔机构动物护理与使用委员会批准。
1. 小鼠后肢肌肉的解剖
<ol>
	<li>通过高压灭菌法对镊子和剪刀（包括直头和弯头）进行灭菌。</li>
	<li>实验开始前，配制并过滤（0.22 µm）所有培养基（封闭培养基、消化培养基、增殖培养基和分化培养基）（见材料表）。</li>
	<li>在35 mm培养皿中加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于肌肉组织的收集。</li>
	<li>采用颈椎脱位法或CO2处死小鼠，并用乙醇对皮肤进行消毒。使用剪刀和镊子去除后肢和前肢的皮肤，以便于肌肉的分离。 
	注意：肌肉可从小鼠新生期或成年期个体中分离。与成年小鼠相比，新生小鼠的卫星细胞数量更多。然而，从单只成年小鼠中可分离出的卫星细胞总数足以完成下述实验。</li>
	<li>分离胫骨前肌、比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）、腓肠肌、股四头肌和肱三头肌，并将其置于含有PBS的培养皿中。将培养皿置于冰上。使用灭菌的剪刀和镊子仔细去除肌腱和脂肪组织。</li>
</ol>
2. 原代成肌细胞的分离
注意：所有细胞培养操作均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>从 PBS 中取出肌肉组织，使用无菌弯剪将其剪碎，直至获得均匀的组织块。将肌肉碎片放入 50 mL 离心管中。</li>
	<li>向肌肉碎片中加入 10 mL 消化液，在 37 °C 水浴中剧烈振荡（250 min-1）孵育 30 分钟，以进行酶解消化。</li>
	<li>加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素和 1% 庆大霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（阻断液），以终止消化反应。</li>
	<li>以 40 × g 离心 5 分钟，将上清液收集至 50 mL 管中。将沉淀物置于冰上保存。 
	注意：离心后，上清液中含有部分卫星细胞、血细胞、内皮细胞和成纤维细胞，而沉淀物中则含有未完全消化的肌肉碎片和结缔组织。为增加分离细胞的数量，需对沉淀物进行如下所述的进一步消化处理。</li>
	<li>将上清液以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中，并将重悬液置于冰上保存。</li>
	<li>对步骤 2.4 中获得的剩余沉淀物重复步骤 2.2–2.5 两次，并将后续获得的重悬沉淀物合并至先前保存在冰上的重悬液中。</li>
	<li>将合并的重悬液依次通过 70 µm 和 40 µm 滤膜过滤。加入 15 mL 含 10% FBS 的 DMEM，以 650 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀物重悬于 3 mL 红细胞裂解缓冲液中，以去除红细胞。室温孵育 5 分钟后，加入 40 mL PBS 终止裂解反应，再以 650 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 5 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中。</li>
	<li>作为预贴壁步骤，将细胞接种于 20 mL 增殖培养基中，置于 150 mm 未包被的培养皿中。在细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 1 小时后，收集培养基。 
	注意：成纤维细胞会贴附于培养皿表面，因此被去除，而卫星细胞则保留在悬浮液中。</li>
	<li>重复步骤 2.9 三次，在最后一次预贴壁步骤中收集含有悬浮卫星细胞的培养基。</li>
	<li>以 650 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>在细胞离心过程中，用胶原蛋白（10 mL 0.1% 的 0.1 M 乙酸溶液）包被两个 150 mm 培养皿。操作时将胶原溶液加入培养皿，孵育 5 分钟后吸除，室温晾干 30 分钟。</li>
	<li>弃去步骤 2.11 中获得的上清液，将细胞沉淀物重悬于 40 mL 增殖培养基中（材料表）。将细胞接种至两个胶原包被的 150 mm 培养皿中（每皿 20 mL），并在细胞培养箱（37 °C，5% CO2, 5% O2）中用含 1 µg/mL 多西环素的增殖培养基培养 2–3 天，以诱导 H2B-GFP 表达。 
	注意：此步骤可促进成肌细胞增殖，从而获得足够数量的细胞用于后续实验。细胞密度保持较低，以避免成肌细胞自发分化为肌管细胞。</li>
</ol>
3. 成肌细胞增殖与分化实验
注意：当成肌细胞密度较高时，部分细胞会启动伸长过程，此时需要对细胞进行传代。通常情况下，传代2至3次不会影响细胞的表型。
<ol>
	<li>弃去培养基，用 5 mL PBS 洗涤细胞，加入 2 mL 胰蛋白酶（1x），在细胞培养箱中 37 °C 孵育 5 分钟。在显微镜下观察，当细胞变圆并脱落时，加入 5 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 以灭活胰蛋白酶。计数细胞数量（通常每只小鼠可获得约 1 × 106 个细胞）。 
	注意：通常孵育 5 分钟胰蛋白酶即可使增殖中的成肌细胞脱落。</li>
	<li>将细胞用于以下所述的其中一项检测。
	<ol>
		<li>增殖检测 
		<ol>
			<li>在胶原包被的 12 孔板中，每孔接种 50,000 个细胞，每孔加入 1 mL 增殖培养基，在细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育。在 24、48 或 72 小时时固定并计数细胞。 
			注意：每 48 小时更换一次培养基，以避免营养耗尽。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分化检测 
		<ol>
			<li>用 350 µL 含基底膜基质（1:100）的分化培养基包被 12 孔板。在 37 °C 孵育 30 分钟后弃去培养基。</li>
			<li>在基质包被的孔板中，每孔接种 200,000 个细胞于分化培养基中。在细胞培养箱（37 °C，5% CO2, 5% O2）中孵育，直至细胞贴壁（通常 2 小时足以使细胞贴附并启动分化）。</li>
			<li>为评估分化情况，按照先前所述方法11对肌球蛋白重链和细胞核进行染色。或者，按照下文所述进行活细胞成像分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成肌细胞分化及核追踪的活体成像
<ol>
	<li>进行活细胞成像时，将第3.2.2节中获得并接种于12孔板中的细胞置于共聚焦显微镜下，显微镜需配备孵育系统，以维持细胞在37 °C、5% CO2的环境中。</li>
	<li>使用20倍干镜（0.7 NA）获取包含数百个细胞的视野，足以监测肌纤维的形成。H2B-GFP细胞可使用低强度488 nm氩离子激光进行成像。 
	注意：开放针孔可确保成像深度（约10 µm）包含细胞厚度，从而使细胞在整个实验过程中保持聚焦。使用共聚焦显微镜具有优势，因其可提高图像的信噪比，尽管宽场显微镜也可用于此目的。肌纤维的形成可通过透射光通道进行监测。</li>
	<li>每6分钟采集一次图像，持续16小时，每帧图像为16位、1,024 × 1,024像素。针对每个采集位置，生成一个多帧.tif文件（示例见补充文件）。 
	注意：本方案中使用了与显微镜配套的商业软件（材料表）；若使用其他显微镜，请使用相应软件实现相同目标。</li>
	<li>下载以.zip格式提供的补充文件软件。 
	注意：这些程序是必须在MATLAB中运行的脚本。该软件改编自已发表的软件12，并针对肌管形成过程中细胞核的追踪进行了优化。该软件分为两部分：第一部分通过分割识别每帧中的细胞核，第二部分生成细胞核运动的“轨迹”（路径）。完整的细胞核分割与追踪代码以及逐步操作指南均提供在补充文件中。</li>
	<li>解压zip文件，并将其保存至所用个人计算机（PC）上的指定路径。所有后续操作均应在已安装必要软件的PC上进行。请注意，该.zip文件包含以下所述的三个文件夹。 
	注意：分割程序文件夹包含用于执行分割的函数。追踪程序文件夹则包含执行追踪所需的函数。示例分割追踪文件夹提供了用于熟悉系统的基础脚本和文件。用于细胞核分割与追踪的软件可在MATLAB R2015a或更高版本中正常运行。</li>
	<li>从.tif文件中分割细胞核时，将文件命名为例如NameFile.tif。
	<ol>
		<li>打开示例分割追踪文件夹，点击DoSegmentation.m，这将在MATLAB中打开命令窗口。</li>
		<li>检查左侧的当前文件夹窗口，查看示例分割追踪文件夹中的所有内容。双击DoSegmentation.m。 
		注意：脚本中需修改的详细信息可在StepbyStep.txt文件中找到。必须修改脚本，使变量filenameinput为NameFile.tif，且folderinput为包含该.tif文件的文件夹。</li>
		<li>运行脚本（点击绿色的运行按钮）。分割结果将保存为.mat文件（SegmentedNameFile.mat），而细胞核的分割结果可在输出图像中可视化。 
		注意：脚本中描述的分割参数可根据需要进行修改。可使用脚本CheckSegmentation.m检查分割质量（参见StepbyStep.txt文件）。若分割质量较差（仅检测到少数细胞核），请调整DoSegmentation.m脚本中明确标示的分割参数，并重复该过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用分割所得的细胞核位置信息，生成轨迹（即每个细胞核随时间变化的运动路径），在相同工作目录下运行脚本GenerateTracks.m。务必正确添加此前获得的分割文件作为输入（详见StepbyStep.txt文件）。 
	注意：输出结果将生成一个名为TrackedNameFile.mat的文件，其中包含一个用于轨迹x坐标的矩阵和另一个用于y坐标的矩阵。</li>
	<li>使用CheckTracking.m评估轨迹质量（详见StepbyStep.txt文件）。利用该步骤的输出图像可帮助可视化每个细胞核随时间的位置变化。在图像左侧查看绿色十字标记，其表示每个已分割的细胞核。使用下方滚动条选择特定细胞核，所选细胞核将以红色圆圈标出；在右侧，可通过上方滚动条随时间追踪所选细胞核的运动轨迹。</li>
</ol>

<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846(2014).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).</li>
<li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells%2FPrimary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047(2017).</li>
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<li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).</li>
<li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li>
<li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li>
<li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100(2016).</li>
<li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016).</li>
<li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurkard%2C+R+%22Assignment+Problems%2C+Revised+Reprint%22">Assignment Problems, Revised Reprint</a>. , SIAM. (2009).</li>
<li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2%2FBIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li>
<li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肌纤维（myofibers）是多核细胞，由起源于肌肉干细胞（卫星细胞）的肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblasts）经过增殖和分化后融合形成2,3,4。为了评估成肌细胞的分化情况，常规方法是将成肌细胞在诱导分化培养基中培养，并在不同时间点固定细胞，随后进行免疫荧光染色以检测分化标志物MyHC，同时使用DNA嵌入分子（如Hoechst）对细胞核进行染色5。该方法可用于通过测量多种参数来评估成肌细胞分化，例如分化指数（MyHC阳性细胞数/总细胞数）或融合指数（含有至少两个细胞核的肌管数/总细胞数）。然而，成肌细胞的融合及肌管的形成是高度动态的过程，依赖于细胞核的运动能力8。事实上，细胞核在肌纤维内的精确定位对于肌肉的正常再生和功能至关重要17。成肌细胞及其细胞核的运动性可能成为评估成肌细胞分化以及揭示肌肉疾病中新缺...

骨骼肌是人体最大的组织，占体重的35%-40%1。卫星细胞是肌肉干细胞，其解剖学特征在于其位置（紧邻肌纤维质膜，位于基底膜下方），可产生增殖的成肌细胞（肌源性前体细胞），这些细胞最终分化并融入现有的肌纤维和/或融合形成新的肌纤维2,3,4。卫星细胞的发现及其生物学研究的进展，为肌肉发育和再生机制提供了重要的科学认识。
分离成肌细胞并将其分化为肌管的实验方案早在多年前就已建立，至今仍被广泛用于研究骨骼肌分化5,6,7。然而，这些方法大多为静态流程，依赖于对固定细胞的分析，因此无法使研究人员充分探究诸如成肌细胞融合和肌纤维成熟等高度动态的过程。最显著的例子是细胞核的定位，这一过程受到严格调控：在肌纤维未成熟时，细胞核位于肌纤维中央；而在肌纤维成熟后，细胞核则迁移至肌纤维周边8,9。活体成像技术是深入研究此类特殊现象的最合适方法。
本文介绍了一种方法，可使科研人员通过延时显微镜记录成肌细胞分化及肌管形成过程，并通过对成肌细胞核的自动追踪进行定量分析。该方法可对分化与融合过程中细胞核动态及成肌细胞行为进行高通量定量表征。本实验方案分为四个部分：（1）从小鼠后肢采集肌肉组织；（2）通过机械法和酶解法分离原代成肌细胞；（3）成肌细胞的增殖与分化；（4）活细胞成像，以追踪成肌细胞分化最初16小时内的细胞核动态。
在以下实验步骤中，从小鼠H2B-GFP中分离成肌细胞，并用1 µg/mL的多西环素处理以诱导H2B-GFP表达，具体方法如前所述10。 alternatively，也可从小鼠其他表达核定位荧光蛋白的转基因品系中分离成肌细胞，或如Pimentel等9所述，将从小鼠野生型中分离的细胞转染以表达核内荧光蛋白。

<table><tbody><tr><td>鸡胚提取物</td><td>Seralab</td><td>CE-650-J</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C9263-1G</td><td>125单位/毫克</td></tr><tr><td>小牛皮肤胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>1.78 单位/毫克</td></tr><tr><td>doxyciclin</td><td>Sigma</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050-098</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>life technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>康宁</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;消化培养基&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>40 mg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>70 mg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>20 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 μm 过滤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;封闭液&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>10%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>1 &amp;permil;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 μm 过滤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;增殖培养基&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>20%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>1 &amp;permil;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡胚胎提取物</td><td>3%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22微米滤膜过滤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;分化培养基&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>2%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>1 &amp;permil;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 μm 过滤</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

细胞内细胞核的定位对于发育和再生过程中的多种细胞活动至关重要。其中最引人注目的例子发生在骨骼肌分化过程中。肌纤维（myofibers）是由肌肉干细胞（卫星细胞）衍生的肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblasts）经过增殖和分化后融合形成的多核细胞。肌纤维内细胞核的正确分布对于肌肉的正常再生和功能至关重要。目前评估成肌细胞分化和肌纤维形成的标准方法主要依赖于固定细胞的免疫荧光分析，这种方法限制了对细胞核运动和细胞行为随时间变化的动态研究。本文中，我们描述了一种利用活细胞成像技术分析成肌细胞分化和肌纤维形成的方法。我们提供了一款软件，可实现细胞核的自动追踪，从而对分化和融合过程中细胞核动态及成肌细胞行为（即运动轨迹）进行高通量的定量表征。

为了在活体成像过程中自动追踪成肌细胞分化期间的细胞核运动，应优先对细胞核进行荧光标记。需要注意的是，使用DNA嵌入型分子并不可行，因为这类分子会干扰原代成肌细胞的增殖与分化13。例如，已在培养时添加或未添加Hoechst的原代成肌细胞中分析了其增殖与分化能力（图1）。显然，在添加Hoechst 33342的培养条件下，成肌细胞的增殖（图1A、B）和分化（图1C，中图）均受到显著抑制。相反，从H2B-GFP小鼠分离并在含多西环素的培养基中培养的成肌细胞，其细胞核呈现绿色荧光，且分化能力与来自野生型小鼠的成肌细胞相似（图1C，右图和左图分别为H2B-GFP与野生型）。
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骨骼肌分化是一个高度动态的过程，尤其依赖于细胞核的定位。本文介绍了一种通过活细胞成像技术在成肌细胞分化及肌管形成过程中追踪细胞核运动的方法，并通过自动追踪获取的信息对细胞核动态进行定量表征。

细胞内细胞核的定位对于发育和再生过程中的多种细胞活动具有重要意义。最引人注目的例子之一是细胞核的……

通过活细胞成像技术，可以在无特定方案的情况下研究成肌细胞分化及肌纤维形成的动态过程，特别是细胞核的定位。对含有外源细胞核的成肌细胞进行活细胞成像，可实现对活细胞中成肌细胞分化的研究，并实现对细胞核的自动追踪。直观的演示有助于理解如何将原代细胞分离与活体成像及成像分析技术相结合。由我们实验室的博士生Giorga Careccia演示该操作，协助者为Frederica Colombo。首先，将成年小鼠双侧后肢的胫骨前肌、比目鱼肌、趾长伸肌、腓肠肌、股四头肌和肱三头肌取出，放入盛有冰上预冷PBS的培养皿中。使用无菌剪刀和镊子仔细剥离每块肌肉的肌腱和脂肪组织，然后将肌肉转移至另一个空的培养皿中。使用无菌弯剪将肌肉剪碎并研磨，直至获得均匀的组织块，然后将肌肉组织转移至一个50毫升离心管中。随后加入10毫升消化液，于37°C水浴中以250转/分钟的转速孵育30分钟。酶消化结束后，加入10毫升阻断液以终止反应。通过离心沉淀样品。将离心管置于冰上，将上清液转移至新的50毫升离心管中。再次离心上清液。将沉淀重悬于1毫米的DMEM中。在冰上加入终浓度为10%的胎牛血清（FBS）。将保留的沉淀物按前述方法用10毫升新鲜消化液进行消化，并在冰上将消化后的沉淀物与备用的细胞悬液混合。将收集的细胞先通过70微米滤器，再通过40微米滤器过滤，然后用15毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的新鲜DMEM培养基洗涤细胞。离心结束后，在室温下用3毫升红细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀。五分钟后加入40毫升PBS终止裂解，并进行额外离心。将沉淀重悬于20毫升DMEM中，DMEM中添加10%胎牛血清，然后将细胞接种至未包被的培养皿中进行预贴壁。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时后，收集含有卫星细胞的上清液。按照上述方法再将细胞悬液预铺板两次。最后一次铺板后，通过离心收集卫星细胞，并将细胞沉淀重悬于40毫升新鲜增殖培养基中。随后将细胞分至两个经胶原蛋白包被的150毫升培养皿中，每皿加入1微克/毫升的多西环素，以诱导H2BGFP表达。将细胞放回细胞培养箱中培养两到三天。当成肌细胞达到适当的实验密度时，用5毫升PBS洗涤每皿细胞，并在37摄氏度下每皿加入2毫升胰蛋白酶消化5分钟，使细胞从培养皿底部脱落。通过光学显微镜观察确认细胞脱落，然后每皿加入5毫升含10%胎牛血清的DMEM终止反应。进行活细胞成像时，将2 × 10⁵个细胞接种至已包被基底膜基质的12孔板中，每孔加入350 µL分化培养基，置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育2小时。待细胞贴壁后，将培养板转移至共聚焦显微镜载物台上，在37°C、5% CO₂条件下，使用20倍干镜物镜选取包含数百个细胞的视野，以每帧1024 × 1024像素、16位深度，每隔6分钟采集一次图像，持续16小时。对每个采集的位置，生成多帧dot tif文件，并下载指定文件夹中提供的dot zip软件进行解压和处理。打开分割追踪示例文件夹，点击“do_segmentation.m”以在Matlab中打开命令窗口。修改“do_segmentation.m”脚本，使变量“filename_track”为tif文件的名称，而“path_input_track”为包含该“.tif”文件的文件夹路径。点击“运行”以执行该脚本。分割结果将保存为 .mat 文件，而细胞核的分割结果可以在输出图像中进行可视化。为了生成轨迹，首先在相同的工作文件夹中双击“generate tracks.m”文件。接着，将文件名更改为对应已分割细胞核的 .mat 文件。单击“运行”以执行脚本。跟踪结果将另存为一个点矩阵文件，生成的轨迹将被绘制出来。用于评估轨迹的质量。首先双击检查追踪点 M，并将文件名修改为相应的点 tif 名称。然后点击文件名以追踪轨迹，使用轨迹的 dot mat 文件，点击运行。在图形窗口中，使用下方的滚动条选择细胞核。所选细胞核将以红色圆圈标出，可通过上方滚动条随时间推移跟踪所选细胞的运动轨迹。绿色十字表示检测到的细胞核。在含有Hoechst的培养条件下，成肌细胞的增殖与分化能力显著受损。与从H2BGFP小鼠分离并在含多西环素或野生型条件下培养的成肌细胞相比，肌球蛋白重链标记的成肌细胞。通过表达H2BGFP蛋白的原代成肌细胞进行活细胞成像，可追踪分化过程中的细胞核动态。分化期初始和终末时间点的透射光与GFP通道合并图像，可用于鉴定肌管以及最终整合入肌管或未能融合入肌管的细胞核。通过共聚焦荧光显微镜成像后，可对细胞核进行分割，并利用分水岭变换分离相邻物体。采用该方法，图像中大多数细胞核均可被识别，从而实现对细胞核运动的追踪。例如，使用Hoechst染色的细胞，其轨迹总长度似乎略长。尽管差异不显著，但计算一段时间内的总位移发现，经Hoechst染色的细胞总位移显著小于未染色细胞。与预测一致，未染色细胞的年总变异显著小于经Hoechst染色的细胞。必须严格按照演示的方案进行操作，尤其是在将生物学步骤的技术技能与共聚焦显微镜及其软件操作步骤相结合时。若要研究其他感兴趣的肌肉模型中的成肌细胞分化及细胞核定位，可将表达荧光核蛋白的分离成肌细胞进行移植。该技术为探索肌肉分化过程中的细胞与细胞核动态变化，以及进一步研究此过程中存在的缺陷奠定了基础。在各种病理条件下，例如肌营养不良症。

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科研

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Biology

生物学

在成细胞分化和融合过程中利用活成像跟踪核

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本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

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利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

肌细胞是最复杂的真核细胞之一。我们提出了一种用于 体外...

体外成熟肌纤维的活体成像分化

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出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

了解利用活细胞成像技术跟踪成肌细胞分化过程中细胞核动态的方法。本研究展示如何结合原代细胞分离与自动追踪算法，定量分析细胞核在肌管形成中的运动轨迹，为肌肉发育研究提供重要见解。

利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

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