利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

通过活细胞成像技术，可以在无特定方案的情况下研究成肌细胞分化及肌纤维形成的动态过程，特别是细胞核的定位。对含有外源细胞核的成肌细胞进行活细胞成像，可实现对活细胞中成肌细胞分化的研究，并实现对细胞核的自动追踪。直观的演示有助于理解如何将原代细胞分离与活体成像及成像分析技术相结合。

由我们实验室的博士生Giorga Careccia演示该操作，协助者为Frederica Colombo。首先，将成年小鼠双侧后肢的胫骨前肌、比目鱼肌、趾长伸肌、腓肠肌、股四头肌和肱三头肌取出，放入盛有冰上预冷PBS的培养皿中。使用无菌剪刀和镊子仔细剥离每块肌肉的肌腱和脂肪组织，然后将肌肉转移至另一个空的培养皿中。

使用无菌弯剪将肌肉剪碎并研磨，直至获得均匀的组织块，然后将肌肉组织转移至一个50毫升离心管中。随后加入10毫升消化液，于37°C水浴中以250转/分钟的转速孵育30分钟。酶消化结束后，加入10毫升阻断液以终止反应。

通过离心沉淀样品。将离心管置于冰上，将上清液转移至新的50毫升离心管中。再次离心上清液。

将沉淀重悬于1毫米的DMEM中。在冰上加入终浓度为10%的胎牛血清（FBS）。将保留的沉淀物按前述方法用10毫升新鲜消化液进行消化，并在冰上将消化后的沉淀物与备用的细胞悬液混合。

将收集的细胞先通过70微米滤器，再通过40微米滤器过滤，然后用15毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的新鲜DMEM培养基洗涤细胞。离心结束后，在室温下用3毫升红细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀。

五分钟后加入40毫升PBS终止裂解，并进行额外离心。将沉淀重悬于20毫升DMEM中，DMEM中添加10%胎牛血清，然后将细胞接种至未包被的培养皿中进行预贴壁。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时后，收集含有卫星细胞的上清液。

按照上述方法再将细胞悬液预铺板两次。最后一次铺板后，通过离心收集卫星细胞，并将细胞沉淀重悬于40毫升新鲜增殖培养基中。随后将细胞分至两个经胶原蛋白包被的150毫升培养皿中，每皿加入1微克/毫升的多西环素，以诱导H2BGFP表达。

将细胞放回细胞培养箱中培养两到三天。当成肌细胞达到适当的实验密度时，用5毫升PBS洗涤每皿细胞，并在37摄氏度下每皿加入2毫升胰蛋白酶消化5分钟，使细胞从培养皿底部脱落。通过光学显微镜观察确认细胞脱落，然后每皿加入5毫升含10%胎牛血清的DMEM终止反应。

进行活细胞成像时，将2 × 10⁵个细胞接种至已包被基底膜基质的12孔板中，每孔加入350 µL分化培养基，置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育2小时。待细胞贴壁后，将培养板转移至共聚焦显微镜载物台上，在37°C、5% CO₂条件下，使用20倍干镜物镜选取包含数百个细胞的视野，以每帧1024 × 1024像素、16位深度，每隔6分钟采集一次图像，持续16小时。对每个采集的位置，生成多帧dot tif文件，并下载指定文件夹中提供的dot zip软件进行解压和处理。

打开分割追踪示例文件夹，点击“do_segmentation.m”以在Matlab中打开命令窗口。修改“do_segmentation.m”脚本，使变量“filename_track”为tif文件的名称，而“path_input_track”为包含该“.tif”文件的文件夹路径。点击“运行”以执行该脚本。

分割结果将保存为 .mat 文件，而细胞核的分割结果可以在输出图像中进行可视化。为了生成轨迹，首先在相同的工作文件夹中双击“generate tracks.m”文件。接着，将文件名更改为对应已分割细胞核的 .mat 文件。

单击“运行”以执行脚本。跟踪结果将另存为一个点矩阵文件，生成的轨迹将被绘制出来。用于评估轨迹的质量。

首先双击检查追踪点 M，并将文件名修改为相应的点 tif 名称。然后点击文件名以追踪轨迹，使用轨迹的 dot mat 文件，点击运行。在图形窗口中，使用下方的滚动条选择细胞核。

所选细胞核将以红色圆圈标出，可通过上方滚动条随时间推移跟踪所选细胞的运动轨迹。绿色十字表示检测到的细胞核。在含有Hoechst的培养条件下，成肌细胞的增殖与分化能力显著受损。

与从H2BGFP小鼠分离并在含多西环素或野生型条件下培养的成肌细胞相比，肌球蛋白重链标记的成肌细胞。通过表达H2BGFP蛋白的原代成肌细胞进行活细胞成像，可追踪分化过程中的细胞核动态。分化期初始和终末时间点的透射光与GFP通道合并图像，可用于鉴定肌管以及最终整合入肌管或未能融合入肌管的细胞核。

通过共聚焦荧光显微镜成像后，可对细胞核进行分割，并利用分水岭变换分离相邻物体。采用该方法，图像中大多数细胞核均可被识别，从而实现对细胞核运动的追踪。例如，使用Hoechst染色的细胞，其轨迹总长度似乎略长。

尽管差异不显著，但计算一段时间内的总位移发现，经Hoechst染色的细胞总位移显著小于未染色细胞。与预测一致，未染色细胞的年总变异显著小于经Hoechst染色的细胞。

必须严格按照演示的方案进行操作，尤其是在将生物学步骤的技术技能与共聚焦显微镜及其软件操作步骤相结合时。若要研究其他感兴趣的肌肉模型中的成肌细胞分化及细胞核定位，可将表达荧光核蛋白的分离成肌细胞进行移植。该技术为探索肌肉分化过程中的细胞与细胞核动态变化，以及进一步研究此过程中存在的缺陷奠定了基础。

在各种病理条件下，例如肌营养不良症。