在成细胞分化和融合过程中利用活成像跟踪核

没有协议，可以研究肌细胞分化和肌纤维形成的动态过程，特别是利用活细胞成像进行核定位。用异质细胞核对肌细胞进行活细胞成像，可以研究活细胞中的肌细胞分化，并自动跟踪核。视觉演示有助于了解如何将原细胞隔离与实时成像和成像分析相结合。

与弗雷德里卡科伦坡演示程序，将是乔加卡雷西亚，在我们的实验室的博士生。首先从成年小鼠的两个后肢采集头骨底，挤出数字龙，胃肠，四头肌和三头肌肌肉到冰上的PBS的培养皿。使用无菌剪刀和钳子小心地去除每个肌肉的肌腱和脂肪，将肌肉转移到空的培养皿中。

使用无菌弯曲剪刀切割和切碎肌肉，直到获得均匀的质量，并转移肌肉碎片到50毫升管。然后向肌肉片中加入10毫升的消化介质，在37摄氏度的水浴中孵育30分钟，每分钟旋转250次。在酶消化结束时，停止与10毫升的阻尼介质的反应。

通过离心旋转样品。将管子放在冰上，将上一液转移到新的50毫升管中。再次将上一代离心机离心。

并在一毫米DMEM中重新悬浮颗粒。在冰上补充10%的胎儿血清，或FBS。消化保留颗粒在10毫升新鲜消化介质，刚刚证明，并结合消化的颗粒与保留细胞悬浮液，在冰上。

将拉扯的细胞通过70微米过滤器，然后是40微米过滤器。并在15毫米的新鲜DMEM中清洗细胞，辅以10%的FBS。在离心结束时，在室温下将颗粒重新悬浮在三毫升红细胞解液缓冲液中。

五分钟后停止解解，使用 40 毫升 PBS 和额外的离心。在 20 毫升 DMEM 中重新悬浮颗粒，并辅以 10% FBS，并在未涂覆的培养皿中预镀细胞。在37摄氏度和百分之五的二氧化碳下一小时后，收集含有上经液的卫星细胞。

预镀电池悬浮两次，如证明。最后电镀后，通过离心收集卫星细胞，并在40毫升新鲜增殖介质中重新悬浮颗粒。将两个胶原蛋白涂层的150毫升培养皿之间分裂，每盘每毫升一微克多氧环素，诱导H2BGFP表达。

将细胞返回到细胞培养箱两三天。当肌细胞达到适当的实验密度时，用5毫升PBS清洗每道菜中的细胞，并在37摄氏度下用每盘两毫升的三辛丁普辛将细胞从板底分离5分钟。通过光显微镜确认分离，并停止与5毫升DMEM加10%FBS每板的反应。

对于活细胞成像，将两倍十至第五细胞板放入12孔板的每个孔中，并涂上350微升的分化介质，每孔辅以地下膜基质两小时。当细胞粘附在板的底部时，将板放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中，放在共物显微镜阶段，并使用20倍的干燥目标获得数百个细胞的视野，以每6分钟获得1024个1024像素的16位图像，每6分钟16小时。对于每个获取的位置，生成一个多帧点 tif 文件，并下载并提取所选文件夹中提供的点 zip 软件。

打开分段跟踪文件夹的示例，然后单击"执行分段点 M"以打开 Matlab 中的命令窗口。更改应有的分段点 M 脚本，使可变文件名轨道是 tif 文件的名称，路径输入轨道是包含点 tif 的文件夹。单击"运行"以运行脚本。

分割结果将保存为文件点垫，而核的分段可以在输出图中可视化。要生成轨道，请先双击在同一工作文件夹中生成轨道点 M。接下来，将文件名更改为文件名点，为分段的核提供适当的点 Mat 文件。

单击"运行"以运行脚本。跟踪的结果将保存为另一个点垫文件，生成的轨道将被绘制。评估轨道的质量。

首先双击检查跟踪点 M，然后将文件名修改为相应的点 tif 名称。然后单击文件名轨道以使用轨道的点垫文件，然后单击"运行"。在图形窗口中，使用下部滚动条选择原子核。

所选原子核将用红色圈出，并且可以使用上滚动条及时跟踪所选细胞的轨迹。绿色十字表示检测到的核。在用 Hoechst 培养的肌细胞中，增殖和分化受到强烈损害。

与与H2BGFP小鼠分离并培养多氧环素或野生类型相比，肌素重链标记了肌细胞。使用表达H2BGFP蛋白的原发肌细胞进行活细胞成像，允许在分化过程中跟踪核。在分化期的初始和最后时间点，在GGF通道中合并传输的图像，允许识别最终集成到 myotube 或不融合到 myotube 的核。

通过共声荧光显微镜成像后，核可以按演示进行分割，流域变换可用于分离附近的物体。使用这种方法，大多数核在图像中被识别，从而允许像所示跟踪核运动。例如，对于沾有 Hoechst 的细胞，轨迹的总长度似乎略高。

虽然差异并不显著。然而，计算时间推移期间的总位移表明，沾染着 Hoechst 的细胞的总位移明显小于未染色细胞的总位移。正如预测的那样，与沾染于 Hoechst 的细胞相比，未染色细胞的年变化要小得多。

在将生物步骤的技术技能与共生显微镜和软件使用步骤相结合时，必须遵循与所证明的协议完全一样。为了研究另一个感兴趣的肌肉模型中的肌细胞分化和核定位，有可能将分离的肌细胞与荧光核蛋白转移。这项技术为探索肌肉分化期间的细胞和核动力学以及进一步研究这一过程中的缺陷铺平了道路。

在各种病理条件下，如肌肉营养不良。