从大鼠骨髓中分离、纯化及诱导破骨细胞前体细胞分化

该方法具有重要意义，因为它可用于在体外获得大量完全分化的破骨细胞。该方法的主要优势在于，与传统操作相比，其更为稳定和安全，且分离骨髓所需时间更短、操作更简便。该技术可提供稳定的破骨细胞来源，而破骨细胞是骨代谢疾病（包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解）研究中的重要对象。

经过少量修改后，本方案也可适用于获取大鼠或其他动物的各种骨髓来源细胞。首先，将已处死的动物仰卧置于消毒板上。使用无菌剪刀在股骨近端处做一长约一厘米的切口，以剥离皮肤。

接下来，解剖取出股骨和胫骨。仔细而轻柔地切断髋关节、膝关节和踝关节周围的双侧连接部分，以分离胫骨和股骨。切除骨骼周围的部分组织，并确保清理彻底。

然后，将清洗后的骨骼放入含有5 mL完全培养基的培养皿中。使用无菌剪刀剪下长骨，用1 mL注射器针头仔细冲洗骨髓腔，共使用10 mL完全培养基，直至骨髓腔变为白色。

将该细胞悬液转移至50毫升离心管中，并使用70微米细胞筛过滤，以去除残留组织。加入5毫升红细胞裂解缓冲液，将细胞置于冰上孵育8分钟。随后，以250 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。

吸弃上清液，并将细胞重悬于10毫升完全培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算执行本方法各操作步骤所耗时间。首先，将已处死的动物仰卧置于消毒过的板面上。

使用无菌剪刀在股骨近端处做一切口，长度约一厘米，以剥离皮肤。接着，分离出股骨和胫骨。剪除骨骼周围的部分组织，但无需完全去除组织。

用 12 毫升 PBS 冲洗胫骨和股骨，然后将其切成两半。将剪断的胫骨和股骨放入预先准备好的 1 毫升移液器吸头中，并将该吸头放入预先准备好的微量离心管中。在 4 °C 条件下，以 1,000 ×g 离心 3 次，每次 45 秒。

此后，将含有骨骼的移液枪头从离心管中取出，使骨髓留在管内。向管中加入 200 µL PBS，反复吹打以充分分散骨髓。将此细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，并使用 70 µm 滤网过滤，以去除任何残留的组织。

然后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算本步骤所耗时间。向无菌硅化离心管中加入6 mL细胞分离液，再将稀释后的细胞悬液加入该管中。

加入悬液后，细胞层与分离液之间将出现清晰的界面。接下来，以45度角将移液器吸头贴附于试管内壁表面。将分层后的溶液在水平离心机中以500 × g离心30分钟。

此后，从上到下吸出含有目标细胞的浑浊第二层。将目标细胞转移至新的离心管中。加入 5 毫升 PBS 洗涤细胞，然后在 250 × g 下离心 5 分钟。

通过添加 PBS 并离心，重复此洗涤过程，共洗涤三次。用骨髓诱导培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

然后，加入5至8毫升骨髓诱导培养基，制备终浓度为每毫升30万个细胞的细胞悬液。将1毫升该细胞悬液加入24孔板的每个孔中。在37摄氏度培养24小时后，轻轻吸除培养基，并向每孔加入1毫升破骨细胞诱导培养基。

轻轻振荡培养板，然后放回培养箱。每48小时，从每个孔中移除并更换0.8毫升破骨细胞诱导培养基。在将培养板放回培养箱前，需轻轻振荡。

开始预处理骨片时，使用微型电动锯沿新鲜牛股骨骨干的纵轴方向切割成两厘米厚的骨片。切割并研磨后，将骨片浸入盛有去离子水的烧杯中，于100赫兹条件下超声处理一小时进行清洗。重复此清洗过程三次。

将洗涤后的切片浸入75%乙醇中两小时。然后吸除乙醇，并将每张切片置于洁净平台上，暴露于紫外光下照射一小时。开始进行甲苯胺蓝染色时，将预处理后的骨切片放入24孔板的各孔中。

此后，向24孔板中加入培养基，浸泡骨片2小时。按照之前所示的方法接种并诱导细胞。待破骨细胞在4至6天出现后，用1毫升0.25摩尔的氢氧化铵洗涤骨片。

将骨片超声处理三次，每次五分钟，以去除活细胞，并便于分析骨片上的吸收陷窝。然后，除去氢氧化铵，并用1%甲苯胺蓝溶液对骨片进行染色，每片加入一毫升，染色两分钟。用PBS洗涤染色后的骨片。

随机选择五个视野，使用图像分析软件对骨吸收区域进行半定量分析。首先，每片骨片加入一毫升 2.5% 戊二醛，在室温下固定两小时。随后用一摩尔氢氧化铵对固定后的骨片进行超声处理，每次三分钟，共三次，以去除细胞成分。

然后，去除氢氧化铵，并用 PBS 清洗骨片三次，每次清洗持续 12 分钟。用 1% 锇酸在室温下固定清洗后的骨片，固定时间为两小时。按照文本方案中的说明进行乙醇梯度脱水。

此后，用乙酸异戊酯替换乙醇，处理15分钟。用金钯对切片进行镀膜，并通过扫描电子显微镜进行分析。本研究中，分离并纯化了大量破骨细胞前体，并成功诱导其分化为破骨细胞。

通过添加 M-CSF 和 RANKL，可在第5至6天观察到巨大的破骨细胞。通过TRAP染色可成功鉴定这些破骨细胞的形成。体积较大、呈紫色且具有多个细胞核的细胞被视为TRAP阳性细胞。

通过该方法，通常可在24孔板中获得800个破骨细胞，每个破骨细胞可含有多达30个细胞核。与传统方法相比，该改进方法在整个分离过程中可节省约20分钟。使用骨片评估骨吸收活性是一种典型的体外方法。

通过甲苯胺蓝染色，吸收区域呈现浅绿色。骨陷窝的结构和特征可通过扫描电子显微镜清晰观察。降钙素受体（CTR）是破骨细胞特异性细胞标志物之一，对于鉴定破骨细胞以及研究破骨细胞在骨组织中的形成过程具有重要意义。

降钙素受体（CTR）的阳性表达可明确识别破骨细胞，并将其与巨噬细胞多核细胞区分开来。在免疫荧光检测中，CTR 以绿色显示，而蓝色则指示细胞核。操作时应避免骨折股骨和胫骨，以防骨髓丢失。

从未操作过该技术的人员在辅助细胞操作溶液时可能会遇到困难。移液器吸头必须紧贴试管内壁，并与内壁保持45度角。