单个脂质体测量用于研究质子泵膜酶的电化学与荧光显微技术

该方法可用于在天然脂质双层环境中研究呼吸膜酶（如细胞色素bo3）的质子转运活性。这种单酶技术的主要优势在于可通过电化学手段在任意时刻启动或终止酶促反应。使用玻璃注射器将200微升大肠杆菌脂质极性提取物的氯仿储备液转移至玻璃小瓶中，制备成每份5毫克的样品。

加入 50 微升浓度为 1 毫克/毫升的辅酶 Q10 至脂质中，使辅酶 Q10 与脂质的最终比例为 1:100。向该混合物中加入 20 微升浓度为 1 毫克/毫升的长波长荧光染料标记脂质（简称 FDLL）。短暂涡旋振荡以均质化氯仿溶液，并在温和的氮气或氩气流下蒸发大部分氯仿。

在真空条件下进一步蒸发至少一小时，以彻底去除氯仿残留。向一份泛醌10 FDLL干燥脂质混合物中加入312.5 µL的40 mM MOPS缓冲液（pH 7.4）。涡旋混匀，直至脂质膜完全重新悬浮，随后在超声水浴中处理两分钟。

接下来加入 125 微升 25 毫摩尔的 HPTS，这是一种 pH 敏感型荧光染料，将被包封在脂质体内部。现在加入 137.5 微升 250 毫摩尔的 OGP 表面活性剂。使用涡旋振荡混合后，将混合物置于超声水浴中处理 10 分钟，以确保所有脂质均溶解于表面活性剂胶束中。

然后将分散液转移至一个1.5毫升的塑料离心管中。加入所需量的细胞色素BO3，并加入超纯水至总体积为50微升。将重建混合物在4摄氏度下于滚轴混合器上孵育10分钟。

随后，将50毫克的聚苯乙烯微珠分别称量至两个1.5毫升离心管盖中。再将100毫克的聚苯乙烯微珠称量至另外两个1.5毫升离心管盖中。用石蜡膜封口，以防止干燥。

将装有聚苯乙烯微珠的管帽置于已准备好的分散液所在的1.5毫升塑料管上，加入首批50毫克聚苯乙烯微珠。随后短暂离心数秒钟，使微珠沉降至管底。将悬浮液置于4°C的滚轴混合器上孵育30分钟，使聚苯乙烯微珠充分吸附表面活性剂。

按照以下步骤重复添加聚苯乙烯微珠并进行孵育：加入50毫克微珠，孵育60分钟；随后加入100毫克微珠，继续孵育60分钟。

最后，加入100毫克微珠，孵育120分钟。使用带细尖的微量移液器将蛋白脂质体溶液与聚苯乙烯微珠分离。将分散液加入90毫升MOPS缓冲液中，置于TI 45超速离心管中。

使用45 TI型转子在超速离心机中以125,000 × g离心一小时，使蛋白脂质体沉淀。超速离心后，弃去上清液，并用MOPS缓冲液冲洗沉淀，注意不要重新悬浮沉淀物。弃去洗涤缓冲液后，用细尖移液器反复吹打，将蛋白脂质体重新悬浮于500 µL MOPS缓冲液中，然后将悬浮液转移至1.5 mL塑料离心管中。

离心5分钟（12,000 × g）以去除碎片后，将上清液（即重建的蛋白脂质体）转移至新的小瓶中。使用双组分低荧光环氧树脂将最多九片玻璃盖玻片粘附到蒸发金表面。在80°C下固化胶水4小时。

在使用自组装单分子层进行修饰之前，用刀片将玻璃盖玻片从硅胶基片上剥离。由于盖玻片较薄，剥离时需小心操作，避免玻璃片破裂或碎裂。将 freshly detached 的镀金盖玻片浸入 6-巯基己醇溶液中，在 20 至 25 摄氏度下静置过夜，以形成自组装单分子层。

第二天，将镀金盖玻片从溶液中取出，先用清水或甲醇快速清洗，再用异丙醇清洗。在温和的气体气流下吹干镀金盖玻片。按照文本方案中的示意图，将镀金盖玻片组装到光谱电化学池中。

使用平头导线在橡胶O形圈限定区域之外与金表面接触，并将电化学池紧密地固定在其上方。加入2 mL电解质缓冲溶液，将参比电极和辅助电极放入池中。随后按照文本方案中所述，检查自组装单分子层的质量并运行空白对照。

将蛋白脂质体加入电化学池中，使终浓度为每毫升0.5毫克脂质，用移液器轻轻混匀。室温下静置30至60分钟，直至蛋白脂质体在电极表面吸附完成。通过至少更换10次缓冲液清洗电化学池，但避免电极表面完全干燥。

现在，在开路电位下进行电化学阻抗谱测试，以确认金电极表面的自组装单分子层保持不变。以10和100毫伏每秒的扫描速率进行循环伏安扫描，观察在电化学醌还原起始电位下细胞色素BO3催化的过氧化氢型泛醇氧化和氧气还原反应。按照前述方法修饰金电极，但使用5微克每毫升的蛋白脂质体。

对于单酶研究，将细胞色素BO3与脂质的比例降低至0.1%至0.2%之间。在倒置荧光显微镜的60倍油镜上滴加一滴浸油，然后放置电化学池。使用适用于FDLL荧光的适当滤光片，聚焦于电极表面。单个脂质体应呈现为显微镜物镜衍射极限下的明亮斑点。

拍摄FDLL荧光的图像。在显微镜上切换至HPTS荧光滤光片组，以确认HPTS荧光清晰可见且可与背景区分。如果情况不是如此，则增加光照强度。

通过交替使用两组 HTPS 滤光片，设置显微镜软件进行定时图像采集。具体操作为：先设置一秒钟曝光，然后进入菜单应用程序，选择“定义/运行 ND 采集”，并选取两个 HTPS 通道。

将图像采集之间的延迟设置为最短。本实验中使用 0.3 秒延迟和 5 分钟总时长。根据文本方案中的说明，调整恒电位仪的设置，以在图像采集过程中改变电位。

现在，通过手动同时启动显微镜的定时图像采集和电化学工作站的电位序列程序，实现两者的同步运行。图中显示了在电极上吸附的脂质体在三种不同覆盖率下的荧光图像。含有染料的脂质体在图像中表现为明亮的斑点。

对图像中央部分进行光漂白，以显示背景荧光水平。两个HPTS通道的图像可完全重叠，其中两通道间的比值对应于本实验所用的pH值7.4。FDLL通道中可见更多的脂质体，表明存在未包封HPTS的脂质体。

在较高覆盖率下，HPTS 与 FDLL 通道之间的差异更为显著。这可能是因为在脂质体覆盖率较高时，脂质体更易在表面破裂或融合。此处展示了实验进行 300 秒期间，相应区域两个 HTPS 通道上脂质体荧光变化的三维表面图。

在60秒至180秒之间施加了还原电位。图中显示了两个HPTS通道的体积计量强度比随时间变化的相应曲线。此处展示的是当细胞色素BO3含量为1.3%时，单幅图像内所有囊泡pH变化的中位数。当施加0.1至0.3伏特之间的电位时，pH值的升高明显可见。

当细胞色素BO3含量较低至0.1%时，其中位曲线几乎与空脂质体的曲线无法区分。必须确保从脂质体分散液中完全去除表面活性剂，因为残留的表面活性剂可能会增加脂质体对质子的通透性。这些方法使我们能够针对天然的亲脂性醌类底物提出特定的科学问题，而不同于常用水溶性醌类似物的研究策略。

此外，单酶实验发现了一种先前未知的泄漏状态，在该状态下，蛋白质可作为质子通道，使质子自由地反向流动。