Name: 电化学和荧光显微镜在质子泵膜酶研究中的单脂质体测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习利用电化学与荧光显微镜技术研究cytochrome bo 3质子泵膜酶的单脂质体测定方法。该技术可在天然脂质双层环境中实时分析质子转运活性，为研究呼吸链酶机制提供精确控制手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目编号：BB/P005454/1）提供的资金支持。NH 受益于 VILLUM 基金会青年研究员计划的资助。

1. 脂质/UQ-10/FDLL 混合物的制备
注意：在重组之前，用于制备脂质体的大肠杆菌（E. coli）脂质应分装，并与泛醌-10（酶底物）及长波长荧光染料标记的脂质（用于测定脂质体大小）充分混合。
<ol>
	<li>使用玻璃注射器将200 µL来自大肠杆菌（Escherichia coli）的氯仿储存液形式的极性脂质提取物（25 mg/mL）转移至玻璃小瓶中，制成每份5 mg的分装样品。</li>
	<li>向脂质中加入50 µL泛醌-10（UQ-10；溶于氯仿，1 mg/mL），使UQ-10与脂质的最终比例为1:100（质量比1%）。</li>
	<li>向脂质/UQ-10混合物中加入20 µL长波长荧光染料标记的脂质（FDLL，1 mg/mL，即0.4% w/w）。</li>
	<li>通过短暂涡旋混合氯仿溶液，然后在温和的氮气或氩气流下蒸发大部分氯仿。再于真空条件下继续蒸发至少1小时，彻底去除残留的氯仿。 
	注意：脂质分装样品可在惰性气氛保护下于-20 °C保存数月。</li>
</ol>
2. 细胞色素 bo3 的重组
注意：用于细胞色素纯化的 bo3 从 E. coli，遵循 Rumbley 的实验方案 等.15 为确保天然折叠酶样品的高纯度，在 Rumbley 所述的亲和纯化步骤之后增加尺寸排阻色谱法 等 15
<ol>
	<li>添加 312.5 µL 40 mM MOPS-KOH/60 mM K2SO4，pH 7.4，加入至一份脂质/UQ-10/FDLL 干燥混合物（5 mg，步骤 1.4）中，涡旋混合直至脂膜完全重悬，随后在超声水浴中处理 2 分钟。</li>
	<li>添加 125 µL 25 mM 8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS），一种需包封于脂质体内部的pH敏感型荧光染料。</li>
	<li>添加 137.5 µL 加入250 mM的n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OGP）表面活性剂，涡旋混匀，并在超声水浴中处理10分钟，以确保所有脂质均溶于表面活性剂胶束中。将分散液转移至1.5 mL塑料离心管中。 
	注意：脂质混浊悬液在经表面活性剂溶解后应变为透明。</li>
	<li>加入所需量的细胞色素 bo3 （参见下方注释），并加入超纯水至终体积 50 µL （细胞色素 bo3 溶液加水）。在指定条件下孵育 4 °C 在滚轴混合器上混合10分钟。 
	注：单酶条件下的典型用量为 0.1 – 0.2%（w/w，蛋白质与脂质之比， 即. 5 – 10 µg 蛋白质），尽管可增加至1–2%（50– 100 µg （若目标仅为观察电化学活性，则无需考虑蛋白质含量，见下文）。作为阴性对照，使用不含细胞色素的脂质体 bo3 可以制备。</li>
	<li>称取两份50 mg和两份100 mg的聚苯乙烯微珠，分别放入四个1.5 mL离心管盖中，并用石蜡膜封口以防止干燥。 
	注意：使用前，应根据制造商说明书，用甲醇和水清洗聚苯乙烯微球，并保存在水中。 
	注意：如果使用水/微珠混合物，可使用带宽口吸头的移液器将聚苯乙烯微珠便捷地转移至离心管盖中，随后使用带细口吸头的移液器去除微珠中的水分。</li>
	<li>加入1st 50 mg 将带有聚苯乙烯微珠的管盖置于含有分散液的1.5 mL塑料管上（步骤2.4），短暂离心数秒钟，使聚苯乙烯微珠进入重悬混合液中。孵育于 4 °C 在滚轴混合器上混合聚苯乙烯微珠，以吸附表面活性剂 30 min.
	<ol>
		<li>重复加入聚苯乙烯微球并进行孵育，步骤如下：加入 50 mg 微珠的使用 60 min 孵育后；加入 100 mg 微珠的 60 min 孵育；并添加 100 mg 微珠的使用 120 分钟 孵育时间。 
		注意：在步骤 2.6 中，随着蛋白脂质体的形成，沉淀微珠上方的溶液将变为半透明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带细尖的微量移液器将蛋白脂质体溶液与聚苯乙烯微珠分离。将分散液在90 mL的20 mM MOPS-KOH/30 mM K中稀释2SO4，pH 7.4（MOPS 缓冲液），转移至 Ti45 超速离心管中。</li>
	<li>使用45 Ti型转子在125,000 × g（r处）条件下超速离心分散液最大) 1 小时以沉淀蛋白脂质体。 
	注意：虽然可以使用较小的离心管，但使用较大体积的缓冲液进行稀释有助于降低最终悬浮液中未包封HPTS的浓度。</li>
	<li>弃去上清液，用 20 mM MOPS-KOH/30 mM K 洗涤沉淀2SO4，pH 7.4 缓冲液（不要重悬沉淀）。弃去洗涤缓冲液后，将蛋白脂质体重新悬浮于 500 µL 用细尖微量移液器反复吹吸MOPS缓冲液，使其充分混匀，然后转移至1.5 mL塑料离心管中。</li>
	<li>以12,000 × g离心5分钟，去除碎片。将上清液（重悬的蛋白脂质体）转移至新的小瓶中。</li>
	<li>将重建的蛋白脂质体分散液储存于 4 °C 过夜，2 天内使用。</li>
</ol>
3. 半透明金电极的制备
注意：光滑的金表面是通过模板剥离法从原子级平整的硅晶圆上剥离一层30 nm厚、纯度为99.99%的金而获得的。金层的厚度较小至关重要，因其需具备半透明性以允许荧光观察。金的蒸发（物理气相沉积，PVD）细节可参见其他文献16，此处仅介绍模板剥离过程。此外，也可从其他供应商处购买超光滑金芯片（见材料表）。
<ol>
	<li>使用双组分低荧光环氧树脂将最多 9 片玻璃盖玻片（厚度为 0.17 mm）粘附至蒸发金表面。在 80 °C 下固化胶水 4 小时。</li>
	<li>在进行自组装单分子层修饰前（步骤 4），用刀片将玻璃盖玻片从硅晶圆上小心剥离。由于盖玻片较薄，剥离时需小心操作，避免玻璃片破裂或断裂。</li>
</ol>
4. 自组装单分子层（SAM）对金表面的修饰
<ol>
	<li>配制 5 mL 的 1 mM 6-巯基己醇（6MH）水溶液。</li>
	<li>将 freshly detached 金镀层盖玻片（步骤 3.1）浸入 6MH 溶液中，在 20 – 25 °C 下静置过夜（>16 h），以形成自组装单分子层（SAM）。 
	注意：巯基溶液具有难闻的气味，因此在孵育金镀层盖玻片时应使用密闭容器。</li>
	<li>次日，将金镀层盖玻片从 6MH 溶液中取出，先用去离子水或甲醇快速冲洗，再用异丙醇冲洗，然后在温和的气流下吹干。</li>
</ol>
5. 蛋白脂质体活性的电化学检测
注意：首先在紧密排列的脂质体层上验证酶的电化学活性（步骤 5），在单个囊泡实验中使用较低的囊泡覆盖率，以测量脂质体腔内的 pH 变化（步骤 6）。
<ol>
	<li>将镀金盖玻片组装到光谱电化学池中（参见图1）。通过橡胶O形圈限定区域外的扁平导线与金层接触。</li>
	<li>加入2 mL电解质缓冲溶液，并将参比电极和辅助电极放入电化学池中。 
	注意：如讨论部分进一步所述，应优先选用不含氯离子的参比电极，以防止电化学过程中生成Au(I)Cl。本实验采用Hg/Hg2SO4（饱和K2SO4）参比电极，电位数据均相对于标准氢电极（SHE）给出，Hg/Hg2SO4（饱和K2SO4）相对于SHE为0.658 V。</li>
	<li>在开路电位（OCP）下进行电化学阻抗谱测试（0.1 Hz – 100 kHz），以评估自组装单分子膜（SAM）的质量。将阻抗值转换为导纳，并除以2πω以绘制Cole-Cole图，其中ω为频率（有关阻抗谱的转换与解释细节，请参见以下参考文献16,17,18）。 
	注意：高质量且致密的6MH自组装单分子膜应呈现接近半圆形的Cole-Cole图，电容值应在2.5–3.0 µF/cm2范围内（图2A）。若Cole-Cole图明显偏离半圆形或电容值超出该范围，应更换电极。</li>
	<li>在电位范围-0.3 – 0.8 V内，以100和10 mV/s的扫描速率记录空白循环伏安图（CVs）。典型的CV曲线如（图2B，虚线）所示。 
	注意：即使在本实验所用的环境氧条件下，该曲线也应表现出几乎纯电容性行为，且无明显法拉第电流。</li>
	<li>向电化学池中加入蛋白脂质体（最终脂质浓度为0.5 mg/mL，细胞色素bo3与脂质的质量比为1–2% (w/w)），并用移液器轻轻混匀。室温下静置30–60分钟，直至蛋白脂质体在电极表面的吸附完成。 
	注意：可在蛋白脂质体吸附过程中以10 mV/s的扫描速率连续记录循环伏安图（CVs）以监测吸附进程。当连续测得的CV曲线不再变化时，表明吸附已完成。有关CV技术的更多信息可参见以下教科书19,20。</li>
	<li>通过至少更换10次缓冲溶液清洗电化学池，但避免电极表面完全干燥。</li>
	<li>在开路电位（OCP）下再次进行电化学阻抗谱测试（图2A，蓝色曲线），以确认金电极上的自组装单分子膜（SAM）保持稳定；同时以10和100 mV/s的扫描速率记录循环伏安图（CVs），以观察细胞色素bo3催化的泛醌醇氧化（及氧还原）反应，其起始电位约为0 V vs SHE（对应电化学醌还原的起始电位）（图2B）。</li>
</ol>
6. 通过荧光显微镜检测酶促质子泵活性
<ol>
	<li>参照步骤5的方法修饰金电极，但与步骤5.5相比，使用的蛋白脂质体减少100倍。即, 5 µg/mL）。对于单酶研究，降低细胞色素 bo3 脂质比例为0.1-0.2%（w/w）。 
	注意：脂质体将少量吸附在电极表面，从而可通过荧光显微镜对单个囊泡进行监测。在此单酶条件下，固定在电极表面的酶量不足以观察到催化电流。</li>
	<li>将电化学池置于倒置荧光显微镜的浸油物镜（60倍）上，滴加一滴浸油。使用适合FDLL荧光的滤光片，聚焦于电极表面。单个脂质体应呈现为显微镜/物镜衍射极限下的明亮斑点。采集FDLL荧光图像。</li>
	<li>切换至显微镜的HPTS荧光滤光片组，以确认HPTS荧光信号清晰可见且可与背景有效区分（曝光时间按步骤6.4选定）。若信号不清晰，应提高光照强度。</li>
	<li>通过交替使用两组 HPTS 滤光片（菜单 应用 | 定义/运行 ND 采集将图像采集之间的延迟设为最短。本实验中，采用 1 s 曝光时间和 0.3 s 延迟（由于物镜转盘移动所致）。 
	注意：这两个通道的荧光强度比值随后将转换为每个时间点脂质体内的 pH 值。采集时长可根据预期的 pH 变化速率进行调整；本文中使用 5 min。</li>
	<li>调节恒电位仪的设置，以在图像采集过程中改变电位。例如，在本实验中，使用以下序列：0 – 60 s：未施加电位（即 OCP）；60 – 180 s：-0.2 V（相对于SHE）；180 – 300 s：0.4 V（相对于SHE）。在此情况下，仅第二阶段施加的电位（-0.2 V vs SHE）已足以有效还原醌池。</li>
	<li>同时手动启动定时图像采集（显微镜）和电位序列（恒电位仪），以同步运行。 
	注意：可通过移动显微镜载物台至表面不同区域，在同一电极上多次重复该实验。两次采集之间的间隔应至少为5-10分钟，以确保表面脂质体的pH完全平衡。可根据需要施加不同的持续时间与电位模式，但由于HPTS在采集过程中的光漂白现象，成像时间受到限制。</li>
</ol>
7. 荧光图像分析
注意：典型的实验会产生一组具有时间步长的图像例如， 2.6 秒）针对两个通道中的每一个， 即， (持续时间 × 2 / 2.6) 张图像。此类在单次酶实验过程中记录的图像集示例可通过利兹大学研究数据存储库获取21图像处理包括使用 Fiji（ImageJ）和高级数学分析编程语言软件（以下简称脚本软件，参见 材料表 详情请见）。
<ol>
	<li>使用 Fiji 分离时间序列文件，对齐图像，并将其保存为独立的通道和时间帧。
	<ol>
		<li>使用 Fiji 内置的 Bioformats 导入器打开时间序列文件（宏命令：run ("Bio-Formats Importer")）。</li>
		<li>使用 StackReg 插件将每一帧图像与第一帧对齐，以校正采集过程中可能发生的载物台移动或热漂移（宏命令：run("StackReg ", "transformation=Translation")）。</li>
		<li>将每个通道和每个时间点的未压缩图像文件以 TIFF 格式保存到同一个文件夹中。</li>
		<li>从时间序列文件的元数据中提取每帧的确切时间戳，并将其保存为与图像同目录的 CSV 文件。或者，使用采集软件提取时间戳，并通过电子表格软件手动保存为 CSV 文件。 
		注意：包含图像和时间戳的文件夹现已准备好供脚本软件分析。步骤 7.1.1 – 7.1.4 可通过 Fiji 脚本实现自动化（提供了一个用 Python 编写的批量处理时间序列文件的脚本，可在 Windows 中使用“Ctrl-Shift-N”，然后选择 文件 | 打开 来加载该脚本）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用脚本软件对图像进行自动化处理。将提供的代码加载至软件中，点击 运行至结束。当提示时，选择包含步骤 7.1 所得图像的文件夹。 
	注意：提供了一个以 mlx 格式编写的活脚本用于分析，其中包含详细的注释，可用于识别单个脂质体，将其拟合至二维高斯函数，进行筛选并量化每个时间点的 pH 值。以下子步骤将由脚本自动执行。
	<ol>
		<li>将单次实验的所有时间帧图像加载到内存中。</li>
		<li>对单个通道的所有图像进行平均（选择荧光强度最高的通道），并使用平均图像识别所有可能对应于单个脂质体的极大值点。</li>
		<li>将平均图像上识别出的极大值点拟合至二维高斯函数，并保存每个脂质体的拟合参数（参见 图 4A 中拟合脂质体的示例）。</li>
		<li>根据预期的单个脂质体标准（如尺寸、圆度和强度）对极大值点进行筛选。排除因信噪比过低、邻近脂质体过近或过于靠近图像边缘而导致拟合不良的脂质体。</li>
		<li>从外部文件加载时间戳，并在每个时间帧图像上分别对每个筛选后的脂质体进行二维高斯函数拟合。 
		注意：在此阶段使用并行编程和多核 CPU 可显著提高计算速度。</li>
		<li>再次根据与步骤 7.2.4 类似的标准（但应用于每个时间帧）对脂质体进行筛选。</li>
		<li>在每个时间点，将脂质体的荧光强度比定义为两个通道中拟合的二维高斯函数所围体积的比值。根据两个 HPTS 通道测得的强度比，结合校准曲线（步骤 8）计算 pH 值。绘制脂质体的 pH-时间曲线，并观察施加电势时其 pH 值的变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. HPTS 荧光标准曲线的绘制
注意：为了将HPTS荧光比值转换为囊泡内pH值，必须首先建立校准曲线，以考虑实验的特定条件，例如金膜透射率、滤光片质量， 等等此步骤只需执行一到两次，只要步骤6中的装置和测量参数保持不变，校准数据即可持续使用。
<ol>
	<li>制备一个吸附稀疏脂质体的电极（不含细胞色素 bo3，操作如步骤5和6.1所述）。</li>
	<li>将2 µL浓度为0.1 mg/mL的短杆菌肽乙醇溶液加入2 mL缓冲液中，配制成终浓度为100 ng/mL的溶液。</li>
	<li>对两个HPTS通道分别采集两幅荧光图像。</li>
	<li>通过逐次加入少量1 M HCl或1 M H2SO4调节样品池的pH值。使用标准pH计测量缓冲液的pH值，并对两个HPTS通道分别采集两幅荧光图像。</li>
	<li>在pH 6至9范围内重复步骤8.4。</li>
	<li>根据7.2节中的算法，对每个pH值下单个脂质体的HPTS荧光比值进行拟合、筛选并计算平均值，再取所有脂质体的HPTS比值平均值。</li>
	<li>将所得pH-比值关系拟合至以下方程： 
	<img alt="Henderson-Hasselbalch方程，pH计算，缓冲溶液，化学公式。" src="/files/ftp_upload/58896/58896eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">，其中pKa、Ra和Rb为拟合参数。</li>
	<li>利用pKa、Ra和Rb参数，将7.2.7步骤中单个脂质体的HPTS比值转换为对应的pH值。</li>
</ol>

<ol><li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Biomolecule+Kinetics%3A+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li>
<li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).</li>
<li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li>
<li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLu%2C+HP+%22Single-molecule+enzymatic+dynamics%22">Single-molecule enzymatic dynamics</a>. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).</li>
<li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+enzymes+sleep+and+work%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Do enzymes sleep and work?</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Hsin, T. -M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li>
<li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li>
<li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Technologies+and+Analytical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+Not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li>
<li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li>
<li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li>
<li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarsoukov%2C+E+%22Impedance+Spectroscopy+Theory%2C+Experiment%2C+and+Applications%22">Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications</a>. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).</li>
<li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li>
<li>Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCompton%2C+RG+%22Understanding+voltammetry%22">Understanding voltammetry</a>. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).</li>
<li>Girault, H. H. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGirault%2C+HH+%22Analytical+and+Physical+Electrochemistry%22">Analytical and Physical Electrochemistry</a>. , EPFL Press. Lausanne. (2004).</li>
<li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMazurenko%2C+I+%22Timelapse+%28movie%29+of+single+vesicles+fluorescence+change+upon+potential+application%22">Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application</a>. , (2018).</li>
<li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li>
<li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22MATLAB+code+for+the+analysis+of+proton+transport+activity+in+single+liposomes%22">MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes</a>. , (2017).</li>
<li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Time-resolved+fluorescence+microscopic+data+%28traces%29+of+individual+lipid+vesicles+with+proton+transport+activity%22">Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity</a>. , (2017).</li>
<li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+of+protons%2C+potassium+ions%2C+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li>
<li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria%29+inner+membrane+phospholipids%3A+No+effect+of+fatty+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li>
<li>Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li>
<li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li>
<li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述方法适用于研究可重建入脂质体并能够与醌池进行电子交换的呼吸膜蛋白的质子泵功能。通过将pH敏感型（比率型）染料包裹在脂质体腔内，可在单酶水平上监测质子泵活性（图1A）。
该方法依赖于泛醌（或其他醌类）嵌入脂质双分子层后，能够与经自组装单分子膜（SAM）修饰的电极进行电子交换的能力。18金电极经自组装单分子层（SAM）修饰后具有非常特定的性质。脂质体需要能够吸附到SAM上，同时SAM必须足够薄，以实现脂质体中醌池的快速电化学氧化与还原。重要的是，电极与脂质体之间的相互作用必须足够弱，以免破坏脂质膜的完整性。此外，根据实验系统的具体情况，理想情况下SAM还应能抑制金催化引起的副反应，例如氧气还原反应。最后，SAM必须在所用的电势窗口内保持稳定。在细胞色素实验中，使用经高质量6MH自组装单分子层修饰的超平坦金电极可满足上述所有要求。 bo3从原子级平整的硅晶圆上剥离金电极可获得超光滑的金表面，并形成接近理想的自组装单分子膜（SAM），这由阻...

有关酶作用机制和动力学的信息通常在系综或宏观尺度上获得，所研究的酶分子数量从数千到数百万不等，测量结果代表统计平均值。然而已知，酶等复杂的生物大分子在行为上可能表现出异质性，因此在系综水平上观察到的分子机制未必适用于每一个单独的酶分子。过去二十年中，随着多种新技术的发展，通过单分子酶学研究已广泛证实了单个分子水平上的此类偏差。1值得注意的是，单个酶活性的荧光检测已被用于研究酶活性的异质性2,3 或发现所谓的记忆效应（酶活性高的时期之后跟随酶活性低的时期） 反之亦然4,5.
许多单酶研究要求将酶固定在表面或以其他方式实现空间固定，以便在视野中停留足够长时间，从而进行连续观察。将酶封装到脂质体中已被证明能够实现酶的固定，同时避免因酶与表面或蛋白质-蛋白质相互作用带来的不利影响6,7。此外，脂质体提供了一种独特的机会，可在其天然的脂双层环境中研究单个膜蛋白8,9,10。
一类膜蛋白——转运蛋白，可介导物质跨细胞膜的定向转运，这一行为只有在蛋白被重建至脂双层中后才能进行研究。例如，脂质体）11,12,13例如，原核和真核生物电子传递链中的多种酶均表现出质子跨膜转运现象，该过程通过产生用于ATP合成的质子驱动力，在细胞呼吸中发挥重要作用。在此情况下，质子泵送活性与电子传递相偶联，但该过程的具体机制往往仍不明确。
最近，我们证明了可将荧光检测与电化学相结合，用于研究末端泛醌氧化酶单个酶的质子泵活性 大肠杆菌 （细胞色素 bo3) 在脂质体中重建14通过将一种pH敏感的、膜不通透的荧光染料包封于由...制备的脂质体腔内而实现 E. coli 极性脂质（图1A）。蛋白质的用量经过优化，以确保大多数脂质体中不含或仅含一个重组酶分子（根据泊松分布）。细胞色素的两种底物 bo3 通过将泛醌添加至形成脂质体的脂质混合物中，并在溶液中提供（环境）氧气来实现。随后，将脂质体稀疏地吸附在涂有6-巯基己醇自组装单分子层的半透明超平整金电极上。最后，将该电极安装于简易光谱电化学池的底部图1B）。通过电化学手段调控醌池的氧化还原状态，可灵活地在任意时刻启动或终止酶促反应，同时利用pH敏感性染料监测酶介导质子跨膜转运所引起的脂质体腔内pH变化。通过检测第二种与脂质结合的荧光染料的荧光强度，可确定单个脂质体的大小和体积，从而实现对酶的质子泵活性进行定量分析。应用该技术，我们尤其发现细胞色素 bo3 分子能够进入一种自发泄漏状态，迅速消散质子驱动力。本文旨在详细介绍单个脂质体测量技术。

<table><tbody><tr><td>6-巯基-1-己醇（6MH）</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>97%</td></tr><tr><td>8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）</td><td>BioChemika</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>铝制支架（电化学池）</td><td>定制</td><td></td><td>30x30x7 毫米；内径：26 毫米；孔径：15 毫米</td></tr><tr><td>辅助电极</td><td></td><td></td><td>铂丝</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR Chemicals</td><td>83627</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌极性脂质</td><td>Avanti</td><td>100600C</td><td>25 mg/mL，溶于氯仿</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>EPO-TEK</td><td>301-2FL</td><td>低荧光环氧树脂</td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ 1.52d）</td><td></td><td></td><td>所需插件：StackReg 和 TurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）</td></tr><tr><td>滤光片组（&quot;ATTO633&quot;)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 620/60 nm；DM: 660 nm；Em: 700/75 nm</td></tr><tr><td>滤光片组（&quot;HPTS1&quot;)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>激发：470/20 纳米；二向色镜：500 纳米；发射：535/48 纳米</td></tr><tr><td>滤光片组（&quot;HPTS2&quot;)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>激发：410/300 纳米；二向色镜：500 纳米；发射：535/48 纳米</td></tr><tr><td>滤光片组（&quot;德克萨斯红&quot;)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>激发：560/55 nm；分光镜：595 nm；发射：645/75 nm</td></tr><tr><td>荧光染料标记的脂质（FDLL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T1395MP</td><td>本研究中使用了TexasRed-DHPC（&amp;lambda;激发波长 595 nm； &amp;lambda;em 615 nm</td></tr><tr><td>荧光染料标记的脂质（FDLL）（替代方法）</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 633-161</td><td>ATTO633-DOPE 可作为替代品使用（&amp;lambda;激发波长 630 nm； &amp;lambda;em 651 nm</td></tr><tr><td>凝胶过滤柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-33</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg，用于进一步蛋白质纯化</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR International</td><td>631-0172</td><td>1.5号</td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>1725 RNR</td><td>250 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>科学玻璃实验室有限公司</td><td>T101/V1</td><td>1.75 mL 容量</td></tr><tr><td>金</td><td>GoodFellow</td><td></td><td>99.99%</td></tr><tr><td>Gramacidin</td><td>Sigma</td><td>G5002</td><td></td></tr><tr><td>硫酸汞参比电极</td><td>辐射计（Hash）</td><td>E21M012</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin NL040</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>显微镜灯</td><td>尼康</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.0.2</td><td>尼康</td><td></td><td>显微镜图像采集软件</td></tr><tr><td>正辛基 &amp;beta;-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Melford Laboratories</td><td>B2007</td><td></td></tr><tr><td>Nova 1.10</td><td>Metrohm</td><td></td><td>恒电位仪控制软件</td></tr><tr><td>目标</td><td>尼康</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 60x/1.4 油镜</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td></td><td>绘图软件</td></tr><tr><td>O形环（电化学池）</td><td>奥里诺科</td><td></td><td>内径：16 mm；横截面：1.5 mm</td></tr><tr><td>塑料管</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微珠</td><td>伯乐（Bio-RAD）</td><td>152-3920</td><td>Biobeads，20-50目</td></tr><tr><td>恒电位仪</td><td>Metrohm Autolab</td><td>PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>恒电位仪</td><td>CH Instruments</td><td>CHI604C</td><td></td></tr><tr><td>脚本编写软件</td><td>Matlab</td><td>R2017a</td><td>所需工具箱：“图像处理工具箱”、“并行计算工具箱”、“曲线拟合工具箱”、“系统辨识工具箱”、“优化工具箱”</td></tr><tr><td>硅片</td><td>IDB Technologies LTD</td><td>Si-C2 (N&amp;lt;100&gt;P)</td><td>&amp;Oslash; 25 毫米，525 微米厚</td></tr><tr><td>特氟龙电化学池（电化学池）</td><td>定制</td><td></td><td>外径：26 mm；内径：13.5 mm</td></tr><tr><td>去膜超平整金表面</td><td>Platypus Technologies</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td>替代的即用型超平整金表面（可根据需求提供厚度低于100 nm的版本）</td></tr><tr><td>细口径微量移液器吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.1190.100</td><td>或类似的凝胶上样枪头 200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>辅酶Q10</td><td>Sigma</td><td>C-9538</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>L-80XP</td><td>使用 Ti 45 转子</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15063</td><td></td></tr></tbody></table>

单个脂质体测量用于研究质子泵膜酶的电化学与荧光显微技术

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

电子传递链中的质子泵酶将氧化还原反应与跨膜的质子转运相偶联，从而产生用于ATP合成的质子驱动力。由于膜蛋白具有两亲性，其操作需特别注意，而在研究质子转运等膜运输过程时，将膜蛋白重建到天然脂质环境中是不可或缺的。本文以大肠杆菌（Escherichia coli）的细胞色素 bo3 为例，详细介绍了一种用于研究膜结合氧化还原酶质子泵机制的方法。该方法结合电化学与荧光显微技术，用于调控醌池的氧化还原状态并监测腔内pH的变化。由于荧光显微镜具有空间分辨率，可同时测量数百个脂质体，且酶含量可低至每个脂质体仅含单个酶或转运蛋白。这种单酶分析能够揭示酶功能动态中的规律，而这些规律可能在群体行为中被掩盖。文中还包括用于自动化图像分析的脚本说明。

每次实验前，均需通过电化学阻抗谱检测经6MH自组装单分子膜（SAM）修饰的金膜盖玻片（电极）的质量。图2A展示了脂质体吸附前后测得的典型Cole-Cole图。若SAM质量良好，电化学阻抗谱应呈现近乎纯电容性的行为，表现为Cole-Cole图为半圆形。Cole-Cole图中半圆的直径对应电极表面双电层电容，其值应在2.5–3.0 µF/cm2范围内。需注意，脂质体吸附后电容不应发生显著变化，尽管在脂质体覆盖度较高时（图2A，底部）可能观察到电容轻微增加，或在低覆盖度时（图2A，顶部）在低频区域出现阻抗的轻微偏移。
电化学可用于检测细胞色素的催化活性 bo3 在蛋白脂质体中，通过循环伏安法测得的催化电流反映了泛醇-氧氧...

本文以细胞色素 bo3 为例，介绍一种研究质子跨单个脂质体脂质膜转运分子机制的实验方案。通过结合电化学与荧光显微镜技术，可对含有单个或多个酶的单个囊泡腔内的pH变化进行独立检测与分析。

电子传递链中的质子泵酶将氧化还原反应与跨膜质子转运相偶联，形成用于……的质子驱动力

该方法可用于在天然脂质双层环境中研究呼吸膜酶（如细胞色素bo3）的质子转运活性。这种单酶技术的主要优势在于可通过电化学手段在任意时刻启动或终止酶促反应。使用玻璃注射器将200微升大肠杆菌脂质极性提取物的氯仿储备液转移至玻璃小瓶中，制备成每份5毫克的样品。加入 50 微升浓度为 1 毫克/毫升的辅酶 Q10 至脂质中，使辅酶 Q10 与脂质的最终比例为 1:100。向该混合物中加入 20 微升浓度为 1 毫克/毫升的长波长荧光染料标记脂质（简称 FDLL）。短暂涡旋振荡以均质化氯仿溶液，并在温和的氮气或氩气流下蒸发大部分氯仿。在真空条件下进一步蒸发至少一小时，以彻底去除氯仿残留。向一份泛醌10 FDLL干燥脂质混合物中加入312.5 µL的40 mM MOPS缓冲液（pH 7.4）。涡旋混匀，直至脂质膜完全重新悬浮，随后在超声水浴中处理两分钟。接下来加入 125 微升 25 毫摩尔的 HPTS，这是一种 pH 敏感型荧光染料，将被包封在脂质体内部。现在加入 137.5 微升 250 毫摩尔的 OGP 表面活性剂。使用涡旋振荡混合后，将混合物置于超声水浴中处理 10 分钟，以确保所有脂质均溶解于表面活性剂胶束中。然后将分散液转移至一个1.5毫升的塑料离心管中。加入所需量的细胞色素BO3，并加入超纯水至总体积为50微升。将重建混合物在4摄氏度下于滚轴混合器上孵育10分钟。随后，将50毫克的聚苯乙烯微珠分别称量至两个1.5毫升离心管盖中。再将100毫克的聚苯乙烯微珠称量至另外两个1.5毫升离心管盖中。用石蜡膜封口，以防止干燥。将装有聚苯乙烯微珠的管帽置于已准备好的分散液所在的1.5毫升塑料管上，加入首批50毫克聚苯乙烯微珠。随后短暂离心数秒钟，使微珠沉降至管底。将悬浮液置于4°C的滚轴混合器上孵育30分钟，使聚苯乙烯微珠充分吸附表面活性剂。按照以下步骤重复添加聚苯乙烯微珠并进行孵育：加入50毫克微珠，孵育60分钟；随后加入100毫克微珠，继续孵育60分钟。最后，加入100毫克微珠，孵育120分钟。使用带细尖的微量移液器将蛋白脂质体溶液与聚苯乙烯微珠分离。将分散液加入90毫升MOPS缓冲液中，置于TI 45超速离心管中。使用45 TI型转子在超速离心机中以125,000 × g离心一小时，使蛋白脂质体沉淀。超速离心后，弃去上清液，并用MOPS缓冲液冲洗沉淀，注意不要重新悬浮沉淀物。弃去洗涤缓冲液后，用细尖移液器反复吹打，将蛋白脂质体重新悬浮于500 µL MOPS缓冲液中，然后将悬浮液转移至1.5 mL塑料离心管中。离心5分钟（12,000 × g）以去除碎片后，将上清液（即重建的蛋白脂质体）转移至新的小瓶中。使用双组分低荧光环氧树脂将最多九片玻璃盖玻片粘附到蒸发金表面。在80°C下固化胶水4小时。在使用自组装单分子层进行修饰之前，用刀片将玻璃盖玻片从硅胶基片上剥离。由于盖玻片较薄，剥离时需小心操作，避免玻璃片破裂或碎裂。将 freshly detached 的镀金盖玻片浸入 6-巯基己醇溶液中，在 20 至 25 摄氏度下静置过夜，以形成自组装单分子层。第二天，将镀金盖玻片从溶液中取出，先用清水或甲醇快速清洗，再用异丙醇清洗。在温和的气体气流下吹干镀金盖玻片。按照文本方案中的示意图，将镀金盖玻片组装到光谱电化学池中。使用平头导线在橡胶O形圈限定区域之外与金表面接触，并将电化学池紧密地固定在其上方。加入2 mL电解质缓冲溶液，将参比电极和辅助电极放入池中。随后按照文本方案中所述，检查自组装单分子层的质量并运行空白对照。将蛋白脂质体加入电化学池中，使终浓度为每毫升0.5毫克脂质，用移液器轻轻混匀。室温下静置30至60分钟，直至蛋白脂质体在电极表面吸附完成。通过至少更换10次缓冲液清洗电化学池，但避免电极表面完全干燥。现在，在开路电位下进行电化学阻抗谱测试，以确认金电极表面的自组装单分子层保持不变。以10和100毫伏每秒的扫描速率进行循环伏安扫描，观察在电化学醌还原起始电位下细胞色素BO3催化的过氧化氢型泛醇氧化和氧气还原反应。按照前述方法修饰金电极，但使用5微克每毫升的蛋白脂质体。对于单酶研究，将细胞色素BO3与脂质的比例降低至0.1%至0.2%之间。在倒置荧光显微镜的60倍油镜上滴加一滴浸油，然后放置电化学池。使用适用于FDLL荧光的适当滤光片，聚焦于电极表面。单个脂质体应呈现为显微镜物镜衍射极限下的明亮斑点。拍摄FDLL荧光的图像。在显微镜上切换至HPTS荧光滤光片组，以确认HPTS荧光清晰可见且可与背景区分。如果情况不是如此，则增加光照强度。通过交替使用两组 HTPS 滤光片，设置显微镜软件进行定时图像采集。具体操作为：先设置一秒钟曝光，然后进入菜单应用程序，选择“定义/运行 ND 采集”，并选取两个 HTPS 通道。将图像采集之间的延迟设置为最短。本实验中使用 0.3 秒延迟和 5 分钟总时长。根据文本方案中的说明，调整恒电位仪的设置，以在图像采集过程中改变电位。现在，通过手动同时启动显微镜的定时图像采集和电化学工作站的电位序列程序，实现两者的同步运行。图中显示了在电极上吸附的脂质体在三种不同覆盖率下的荧光图像。含有染料的脂质体在图像中表现为明亮的斑点。对图像中央部分进行光漂白，以显示背景荧光水平。两个HPTS通道的图像可完全重叠，其中两通道间的比值对应于本实验所用的pH值7.4。FDLL通道中可见更多的脂质体，表明存在未包封HPTS的脂质体。在较高覆盖率下，HPTS 与 FDLL 通道之间的差异更为显著。这可能是因为在脂质体覆盖率较高时，脂质体更易在表面破裂或融合。此处展示了实验进行 300 秒期间，相应区域两个 HTPS 通道上脂质体荧光变化的三维表面图。在60秒至180秒之间施加了还原电位。图中显示了两个HPTS通道的体积计量强度比随时间变化的相应曲线。此处展示的是当细胞色素BO3含量为1.3%时，单幅图像内所有囊泡pH变化的中位数。当施加0.1至0.3伏特之间的电位时，pH值的升高明显可见。当细胞色素BO3含量较低至0.1%时，其中位曲线几乎与空脂质体的曲线无法区分。必须确保从脂质体分散液中完全去除表面活性剂，因为残留的表面活性剂可能会增加脂质体对质子的通透性。这些方法使我们能够针对天然的亲脂性醌类底物提出特定的科学问题，而不同于常用水溶性醌类似物的研究策略。此外，单酶实验发现了一种先前未知的泄漏状态，在该状态下，蛋白质可作为质子通道，使质子自由地反向流动。

single-liposome-measurements-for-study-proton-pumping-membrane

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

电化学和荧光显微镜在质子泵膜酶研究中的单脂质体测定

本文介绍一种基于固态支撑膜的电生理学方法，并重点阐述其在电致性膜转运蛋白表征中的应用。...

固相支持膜电生理学简介

蛋白脂质体用于在明确的生化环境中研究纯化的通道蛋白和转运蛋白。本文图示了一种用于检测这些蛋白介导的外排作用的实验方法。详细描述了制备蛋白脂质体、进行记录以及分析数据以定量确定重组蛋白功能特性的各个步骤。...

基于蛋白脂质体的外排实验测定 Cl⁻ 通道单分子特性- 通道蛋白与转运蛋白

本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。...

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

本文介绍了用于电子顺磁共振研究的五聚体配体门控通道的定点自旋标记和重组方法。该方案可适用于任何膜蛋白。此处描述的重组方法也可用于在特定脂质体系中进行宏观和单通道电流的膜片钳测量。...

位点定向自旋标记与五聚体配体门控离子通道的电子顺磁共振光谱研究

本方案描述了脂质体的制备方法，以及如何将这些脂质体固定在表面，并通过荧光显微镜以大规模并行方式对单个脂质体进行成像。该方法可实现对群体中单个脂质体的尺寸和组成非均一性的定量分析。...

一种基于定量荧光显微镜的单个脂质体检测方法用于分析单个脂质体之间的组分不均一性

线粒体融合是线粒体动力学中重要的稳态反应。本文描述了一种 体外 用于研究线粒体内膜融合的重建系统，可解析膜拴系、对接、半融合及孔道...

重建线粒体膜动力学的模型膜平台

本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.

基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

本方案介绍了一种荧光成像方法，该方法利用一类对pH敏感的脂质荧光探针，用于监测细胞外排和内吞循环过程中的脂质膜运输。...

利用pH敏感型荧光脂质类似物ND6测量膜脂质周转

我们描述了在活细胞中对单个巨胞饮体内的pH值、氧化事件以及蛋白质消化进行测量的实验方案。重点介绍了双荧光探针比率显微成像技术，及其相较于基于群体细胞分析技术所具有的优势。...

利用双荧光探针比率显微镜测量巨胞饮体的pH值、氧化还原化学状态及降解能力

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。...

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。...

利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

学习利用电化学与荧光显微镜技术研究cytochrome bo 3质子泵膜酶的单脂质体测定方法。该技术可在天然脂质双层环境中实时分析质子转运活性，为研究呼吸链酶机制提供精确控制手段。

单个脂质体测量用于研究质子泵膜酶的电化学与荧光显微技术

探索更多视频