Name: 利用 h-oig境外矩阵子 filling (homing) 进行室内胰岛移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 了解hOMING技术用于胰岛移植的细胞治疗方法，该技术通过将水凝胶包裹的胰岛细胞植入大鼠网膜层来优化移植效果。此方法简单快速，可快速验证生物材料并改善细胞存活。

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本工作由阿尔萨斯大区、BioArtMAtrix-阿尔萨斯生物谷联盟-CQDM 资助；项目编号：53/14/C1。作者感谢斯特拉斯堡大学医院 Bruant-Rodier 教授团队在开发这一创新技术过程中提供的帮助。

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院指南进行，并取得授权编号：AL/60/67/02/13。
1. 受体准备
<ol>
	<li>在受体大鼠中化学诱导糖尿病。
	<ol>
		<li>向大鼠腹腔注射75 mg/kg链脲佐菌素（STZ，溶于无菌0.1 M柠檬酸缓冲液，pH 4）10. 
		注意： 移植研究中使用6周龄的Lewis品系大鼠，体重为150–190 g。</li>
		<li>在前四天内通过每日血糖检测监测糖尿病状态。当大鼠血糖超过2 g/L时，皮下注射长效胰岛素6 U/天，以预防糖尿病并发症和体重下降，直至植入胰岛素缓释丸。 </li>
		<li>当尾静脉血糖的两次测量值均满足条件时，将大鼠纳入队列 &gt;连续两天 4-5 g/L，且 C 肽水平为 &lt;200 pM。使用血糖仪测量血糖水平，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测C肽水平。</li>
		<li>皮下植入胰岛素颗粒（参见1.2）。 
		注意： 长期胰岛素治疗有助于更好地调节血糖，并可避免糖尿病并发症（这些并发症会加剧移植部位的氧化应激）11此外，该疗法可在维持糖尿病状态的同时保持正常生长曲线（避免糖尿病动物通常出现的体重下降），从而获得更大的网膜脂肪垫，有利于进行移植操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰岛素颗粒植入术
	<ol>
		<li>使用气体麻醉剂（3% 异氟烷，500 mL/min 氧气）对大鼠进行麻醉2）并将大鼠置于俯卧位。</li>
		<li>通过检查反射（足垫夹捏）消失来确认麻醉状态。使用聚维酮碘清洁颈部，并用刀片剃除该区域毛发。再次涂抹聚维酮碘，静置3分钟。</li>
		<li>将1.5个胰岛素颗粒（每200克大鼠3单位（U））置于1:5稀释的聚维酮碘溶液中以消毒颗粒。使用16 G套管针穿刺颈部皮肤，借助配套的导引针和推进器插入颗粒。取出导引针和推进器，缝合一针。用聚维酮碘清洁缝合处。 
		注意： 无需术后疼痛管理，因为该干预措施相当于一次皮下（SC）注射。</li>
		<li>让大鼠从麻醉中恢复，并确保大鼠能够进食，以避免低血糖。</li>
		<li>通过测量植入后血糖水平的下降来评估微囊化效率。</li>
		<li>通过每月每周监测血糖水平来检查移植效率。</li>
		<li>在胰岛素缓释丸植入后1个月，若尾静脉血C肽水平维持在200 pM以下，则将该大鼠纳入队列。 
		注意： 检测C肽水平是移植前评估动物基线状况并确认其糖尿病状态的必要步骤。随访期间C肽再生始终较低。C肽血症水平最低时提示再生程度最低。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. hOMING：网膜内基质胰岛填充
<ol>
	<li>胰岛-基质混合物的制备
	<ol>
		<li>在超净工作台中制备黏稠的胰岛载体。将海藻酸钠粉末溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为1.5%。通过0.22 µm滤器过滤除菌。每只受体准备400 µL。 
		注意：任何黏度适合通过21 G针头注射的水凝胶均可使用。</li>
		<li>按照先前描述的方法从健康的Lewis大鼠（200–250 g）中分离胰岛12。</li>
		<li>以胰岛当量（IEQ）计数胰岛数量（一个IEQ定义为直径150 µm的胰岛）13。</li>
		<li>在超净工作台中，将7660个胰岛当量（IEQ）分装至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>用500 µL不含胎牛血清的CMRL（Connaught医学研究实验室）培养基洗涤胰岛分装样品。</li>
		<li>离心沉淀胰岛（500 × g，4 °C，2分钟），弃去上清液。</li>
		<li>向胰岛沉淀中加入150 µL海藻酸钠水凝胶载体，轻轻吹打混匀，并将混合物置于冰上。</li>
		<li>准备一个无创伤的21 G针头和一个无死体积的1 mL注射器，先向注射器中装入150 µL空白海藻酸钠溶液。</li>
		<li>将胰岛与海藻酸钠的混合物（150 µL）吸入注射器中（总体积300 µL），并将注射器保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>使用冷灭菌法（2% Steranios浸泡20分钟）对手术器械进行灭菌。</li>
		<li>使用异氟烷麻醉大鼠，并将其置于俯卧位。</li>
		<li>使用刀片剃除颈部区域毛发，并用聚维酮碘消毒该区域，碘液作用3分钟。</li>
		<li>使用手术刀做切口，用镊子取出1.5单位的胰岛素缓释颗粒，用单个或两个间断缝合关闭皮肤。无需唤醒大鼠。 
		注意：一个月后，颗粒可能变得易碎，并被纤维组织包裹；可使用剪刀仔细分离。</li>
		<li>将大鼠转为仰卧位，剃除并用聚维酮碘消毒腹部区域，碘液作用3分钟。</li>
		<li>在胸骨下方使用手术刀做一个约1.5 cm的腹腔切口。将湿润的无菌纱布置于切口周围。</li>
		<li>识别位于胃附近的脂肪垫——大网膜。用镊子小心夹住大网膜，轻柔地将其拉出腹腔，并平铺在纱布上。 
		注意：大网膜组织从脾脏延伸至十二指肠，并在中点处附着于胃。接受胰岛素治疗的糖尿病大鼠的大网膜在平铺于纱布上时，正常面积约为2 cm²。</li>
		<li>使用2 mL预热至37 °C的无菌生理盐水充分润湿大网膜组织。使用小弯头镊子操作组织，将针头在大网膜层间穿刺进入大网膜边缘，并完全插入针头。</li>
		<li>缓慢开始注射胰岛悬液，同时小心地将针头向后移动，以在多个位置（呈线状）注射胰岛。在拔出针头前，确保水凝胶已停止流出，以避免分散的胰岛丢失。</li>
		<li>根据需要，使用不同的穿刺点重复上述操作，以将注射器中的全部内容物注入大网膜组织中。 
		注意：在大鼠中，通常需要进行4至5次注射。</li>
		<li>注射结束后，检查胰岛是否在注射器中聚集。 
		注意：若仍可见胰岛残留，可将针头从注射器上取下，直接向注射器中加入100 µL空白水凝胶，重新连接针头，并进行第二轮注射以冲洗残留胰岛。</li>
		<li>再次使用无菌生理盐水润湿大网膜组织及腹腔切口壁。用镊子小心地将大网膜复位至腹腔内。</li>
		<li>向腹腔内注射2 mL预热的无菌生理盐水，以补充大鼠体液。</li>
		<li>使用连续缝合法关闭腹肌层，然后使用间断缝合法（逐点缝合）缝合皮肤层。</li>
		<li>皮下注射美洛昔康（1.5 mg/kg）作为镇痛剂，每日一次，连续5天。</li>
		<li>将大鼠置于加热垫上的笼子中，直至从麻醉中恢复。对所有受体大鼠重复上述操作。</li>
		<li>移植后每日检测血糖。若血糖 >2 g/L，每日皮下注射6 U长效胰岛素。</li>
		<li>通过监测血糖和C肽水平评估移植物功能，观察期为1至2个月。 
		注意：若移植成功，血糖通常在移植后2–5天内趋于稳定，此后可停止胰岛素注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 大网膜移植物取出
注意：该步骤可用于确认移植物功能良好。在获取有功能的移植物后，大鼠应恢复至糖尿病状态。此步骤在代谢随访1或2个月后进行。
<ol>
	<li>使用气体麻醉剂麻醉大鼠，并将其置于仰卧位。</li>
	<li>剃除腹膜区域的毛发，并使用聚维酮碘消毒3分钟。</li>
	<li>使用手术刀在胸骨下方做一个1.5 cm的剖腹切口。在切口周围放置湿润的无菌纱布。</li>
	<li>辨认位于胃附近的网膜。用镊子小心地将其展开并铺在纱布上。</li>
	<li>使用剪刀切除网膜。从附着于胰腺尾部（靠近脾脏）的部分开始。如果出现出血，使用干燥的无菌纱布进行止血。</li>
	<li>继续沿附着于胃的部分进行切除，完整取出网膜。 
	注意： 在此位置，胃网膜动脉（图1）若被意外切断，可能导致大量出血。为获取移植物而造成的动脉切口难以完全避免，但可使用镊子和纱布控制出血。若发生意外切割，应使用干燥纱布牢固压迫，并持续压迫至少1分钟，出血应可停止。若仍未止血，可使用止血夹或电刀对血管进行烧灼止血。</li>
</ol>
<img alt="动脉结扎示意图；显示胃部动脉及手术干预的关键部位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：大网膜动脉分布。 大网膜移植物取材时，由胃网膜动脉组成的关键区域以蓝色表示。切除该部分大网膜组织时，需特别注意右侧胃网膜动脉段。可采用压迫、结扎或电凝方法控制出血。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="7">
	<li>检查是否有持续出血。若无出血，注射 2 mL 预热的生理盐水，关闭大鼠体腔，并按前述方法处理。 
	  移除移植物的动物将恢复至糖尿病状态。此后必须给予胰岛素注射（6 U/SC/天），以确保动物的健康状况。</li>
	<li>在移植物取出后 10 至 12 天，使用过量戊巴比妥钠（182.2 mg/kg）对大鼠实施安乐死。</li>
</ol>
4. 组织学分析：苏木精和伊红染色
<ol>
	<li>使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定获取的大网膜组织，并进行石蜡包埋。</li>
	<li>切取 4 µm 厚的切片，进行苏木精-伊红染色，以对移植物进行形态学评估。</li>
</ol>
5. 统计学分析
<ol>
	<li>使用统计分析软件，通过重复测量方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验（Tukey’s honest significance difference test）确定统计学显著性。以如下方式表示p值：*p &lt; 0.05；**p &lt; 0.01；***p &lt; 0.001。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案中可强调一些关键步骤。首先，进行手术并操作组织的人员必须轻柔对待脂肪组织，因其较为脆弱，应避免挤压或损伤大网膜。大网膜作为一种防御性组织，富含巨噬细胞及其他白细胞，这些免疫细胞可能因过度操作而被激活，从而对移植物产生不利影响。其次，移植物（胰岛-水凝胶混合物）的装载也至关重要。操作者必须避免死腔，并将全部水凝胶-胰岛混合物装入注射装置中。在此步骤完成后，紧接着另一个关键点是注射过程本身，注射必须缓慢、小心且轻柔地进行。注射器需用最初装入的空水凝胶冲洗，以回收任何残留的胰岛。第三，缝合必须谨慎进行，并分两步完成：应首先缝合肌层，注意避免将大网膜与肌肉一并缝合，皮肤则需单独缝合。关于大网膜移植物的取出手术，需特别注意切开胃部附近动脉（胃网膜动脉）的时刻，应密切观察是否发生出血，并在缝合动物前彻底止血，因为任何持续性出血均会导致动物在数日内死亡。
在胰岛运输培养基方面可能需要进行故障排查；水凝胶的选择由实验人员决定，只要该水凝胶可注射即可。使用不同的材料可能导致移植物功能存在差异（例如，是否添加补充成分）。本文所述方法已证明在胰岛比例为7660 IEQ/kg时，与惰性共移植材料联合使用具有良好的效率。
目前的方法可能受限于大网膜的大小和水凝胶的特性。使用糖尿病啮齿类动物模型时，必须在胰岛移植前进行胰岛素治疗，以提供足够的移植区域。由于链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病，糖尿病啮齿类动物会大量减轻体重并减少脂肪量。考虑到本研究中所用动物体重较小，无法在更小的区域进行移植。
维持适当的血糖管理（移植前使用胰岛素缓释丸，移植后使用长效胰岛素）是必需的。在此，我们选择在移植当天之前持续使用胰岛素缓释丸，原因如下：首先，维持良好的血糖控制可显著减少糖尿病在受体器官中引发的氧化应激，这种应激可能对胰岛移植物有害11，同时可延续临床上观察到的强化胰岛素治疗和受体准备过程12；其次，我们希望尽量减少大鼠接受麻醉操作的次数。关于在代谢随访期间使用长效胰岛素实施胰岛素治疗的方案，该方案可避免因葡萄糖毒性（可能破坏移植物）导致的严重并发症，并维持一个&#34;真实&#34;的血糖值。
为了监测移植效率，如果大鼠正在使用胰岛素缓释丸进行胰岛素治疗，则在术后最初几天内血糖水平不是一个相关参数。因此，在移植前多次检测C肽水平是必要的。这些检测时间点包括研究开始时，用于在链脲佐菌素（STZ）注射后筛选动物，以及移植前即刻，以确保大鼠仍处于糖尿病状态且胰岛功能再生极少。
水凝胶的性质也很重要。液态水凝胶会从大网膜组织中渗出，而高黏度水凝胶则无法注射。在使用前必须测试水凝胶的黏度和可注射性，但似乎还必须通过体外评估胰岛或其他细胞的存活情况来直接测试材料的生物相容性。这是因为胰岛对缺氧非常敏感，而使用高黏度载体可能会影响氧气的扩散。
就本方法相对于现有方法的重要性而言，这种组织内移植技术在可重复性方面具有优势。该技术对组织无创，且由于其位于血管外，可避免出血和血栓形成的风险。此外，在考虑胰岛移植时，可避免即刻血液介导的炎症反应14。更重要的是，hOMING技术允许将胰岛移植到非重要器官中，而不同于移植至肝脏，后者可能对肝功能带来风险15。
为了达到最佳性能，水凝胶必须根据其所承载的细胞进行优化。使用生长因子或特定蛋白质可对移植细胞产生积极影响16,17。
总之，该技术可用于在不同类型细胞上进行水凝胶的体内验证，尤其是在需要活跃代谢环境的情况下（例如胰岛）。此外，该手术技术适用于多种应用，未来可能快速转化至临床人体应用，因其可通过腹腔镜轻松实施。

细胞治疗是一个热门领域，其目标是基于再生医学来治愈疾病。近年来，生物材料辅助的细胞治疗受到越来越多的关注，尤其是因为细胞移植通常需要载体将细胞从培养皿转移至受体。生物材料支架作为潜在的有价值细胞载体，可发挥多种作用1。一种合格的载体应能保护细胞免受机械应力，并提供有利的生长条件，如必要的生长因子、代谢废物的排出、营养物质的交换以及氧气供应2。
在细胞治疗所使用的各类生物材料中，水凝胶具有多种优势。它们具备良好的生物相容性和生物可降解性，易于操作，并有利于氧气扩散3。此外，现有技术已可利用水凝胶通过添加生长因子或细胞外基质蛋白等方式，帮助细胞存活并成功植入4。
含有干细胞的水凝胶载体可被注射作为治疗手段， 例如，骨再生5 神经系统疾病6需要植入具有代谢活性的细胞。尽管该方法的体外验证是可行的，但用于体内验证的工具和技术仍有待进一步优化。
在进行生物相容性测试时，细胞和水凝胶的移植可通过皮下注射轻松完成。然而，当移植的细胞旨在通过其代谢作用调节全身性因子时，这种皮下定位并非最佳选择，尤其是在静脉引流方面存在局限7。因此，目前尚无能够快速、安全且高效地评估水凝胶有益作用的工具。基于胰岛移植的实例——该过程要求移植物根据血糖水平将激素释放入血液循环——我们开发了一种新的体内细胞/水凝胶植入方法。
第一步是确定一个可接受含细胞水凝胶的受体移植部位。大网膜具有较大的可植入空间，组织可塑性强，且其丰富的血管化特征结合腹腔内环境，对于研究具有高代谢活性的细胞具有重要意义8。接下来，我们需要建立一种手术技术，以实现将细胞和水凝胶转移至大网膜。受整形外科中脂肪填充术的启发9，我们开发了“人源大网膜基质胰岛填充技术”（h-Omental Matrix Islet filliNG，hOMING）。该技术将包埋于水凝胶中的胰岛直接注射至大网膜组织内。此外，该方法通过在大网膜组织中进行多次细胞-水凝胶混合物的沉积，旨在实现最大化的移植物植入效果，而该部位丰富的血管网络也有助于改善移植物的氧供。
在本研究中，我们描述了一种简单且创新的胰岛移植技术，即将胰岛植入大网膜层间的脂肪组织中，该位置靠近血管。该技术属于微创手术，可在腹腔镜下完成，将包裹于水凝胶中的胰岛注射至脂肪组织内。此方法可广泛适用于所有需要在具有代谢功能的环境中进行测试的水凝胶与细胞组合。

<table><tbody><tr><td>海藻酸钠（PRONOVA UP LMV）</td><td>Novamatrix</td><td>4200206</td><td>水凝胶载体</td></tr><tr><td>无创针（钝头）</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>不含FBS的CMRL</td><td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>C-肽ELISA试剂盒</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>徕卡显微系统</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>外科缝合线</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>徕卡显微系统</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素小丸</td><td>Linshin</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Centravet</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>来得时（胰岛素-甘精）</td><td>赛诺菲安万特</td><td>Lantus SoloStar</td><td>长效胰岛素</td></tr><tr><td>美达佳</td><td>勃林格殷格翰</td><td>MET019</td><td>抗炎药物</td></tr><tr><td>NaCl（用于0.9%生理盐水）</td><td>Sigma</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>26 G 针头</td><td>TERUMO</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>Linde</td><td>2010152</td><td>用于异氟烷使用</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal</td><td>用于安乐死</td></tr><tr><td>Steranios 2%</td><td>Anios</td><td>11764046</td><td></td></tr><tr><td>链脲佐菌素</td><td>Santa-Cruz</td><td>SC-200719A</td><td></td></tr><tr><td>注射器 &amp;ndash; Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>套管针 &amp;和样式（linshin）</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>用于沉淀物插入</td></tr></tbody></table>

利用人网膜基质胰岛填充技术（homing）进行网膜内胰岛移植

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

基于细胞治疗的再生医学为治愈疾病带来了新的希望。目前面临的障碍之一是缺乏对治疗效果进行恰当的体内验证。为了将细胞转移至受体体内，通常需要将其与生物材料（尤其是水凝胶）结合。然而，验证此类移植物的有效性需要合适的环境、合适的水凝胶以及合适的受体植入部位。大网膜可能正是这样一个理想的部位。以胰岛移植为例，我们开发了hOMING（h-Omental Matrix Islet filliNG，人源大网膜基质胰岛填充）技术，该技术通过将移植物注射到大网膜组织层之间，以提高胰岛的植入效率和存活率。为实现这一目标，需将胰岛包埋于具有一定黏度的水凝胶中，以便使用无创针头进行注射。将含有水凝胶和胰岛的混合物装入注射器中，通过多个不同的穿刺点，在大网膜组织内进行多次注射，并沿直线分布胰岛/水凝胶混合物。我们首先利用葡聚糖微珠验证了该创新方法的可行性。结果显示，微珠在大网膜组织中广泛分布，并紧邻血管。为进一步评估移植物的功效，我们将胰岛移植至糖尿病大鼠体内，并对其代谢状况进行为期两个月的随访观察。移植后的胰岛在内部及周围表现出高度的再血管化，并成功逆转了糖尿病状态。hOMING技术还可适用于其他类型水凝胶或细胞治疗，尤其适用于代谢活性较高的细胞类型。

hOMING 方法可避免血管内移植，并将胰岛限制在某一器官内。整个胰岛移植过程（包括麻醉）最多需要 8-10 分钟，其时间线与经典的肝脏移植相当。
为了研究胰岛在大网膜组织内的分布方式，采用hOMING方法移植了葡聚糖微珠（图2）。移植后一天，处死大鼠并取出大网膜组织进行组织学分析。苏木精-伊红染色显示微珠在组织中呈均匀分布（图2，右下）。微珠常靠近血管，并良好地植入脂肪组织中。移植后即刻，微珠周围出现炎症反应，导致组织重构，从而将胰岛嵌入组织内。
<img alt="水凝胶微珠注射实验；大网膜暴露；显微镜组织学分析；研究实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：hOMING 技术示意图及植入后一天大网膜组织内微珠分布情况。（A）hOMING 技术示意图。器官暴露后（A，左图），使用无创针头将胰岛-水凝胶混合物（此处以蓝色葡聚糖微珠替代，以便更清晰观察）小心注入组织中（A，中图）。植入组织内的微珠清晰可见（A，右图）。（B）微珠注射后一天取出的大网膜组织的苏木精-伊红染色结果。可见微珠在组织内呈均匀分布。比例尺 = 100 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为验证该技术，我们使用近交系大鼠（n=8）进行了同基因型研究。接受胰岛移植的糖尿病大鼠（每公斤大鼠体重移植7660个胰岛当量，IEQ），通过hOMING技术进行处理，并监测其血糖和C肽水平达两个月。通过植入胰岛素缓释丸来控制血糖（如图3A中观察到的血糖首次下降所示）。移植物功能的表现为血糖维持在约2 g/L，C肽水平 >500 pM。移植前，大鼠处于糖尿病状态（血糖 >5 g/L，C肽水平 <200 pM）。在移植并取出胰岛素缓释丸后，血糖的维持和正常化在hOMING移植后仅3天即出现，并持续至移植物取出时（与移植前水平相比，p &lt; 0.05）。在网膜移植物取出后，血糖再次回升至移植前水平，证明了通过hOMING技术移植的胰岛具有功能活性（图3A）。C肽水平的变化模式则完全相反：移植前水平极低或无法检测，移植后迅速升高并在此高水平维持整个研究期间（p &lt;0.05），而在网膜移植物取出后，C肽水平下降至移植前水平（图3B）。对取出的网膜组织进行组织学分析显示，胰岛再血管化程度很高，这很可能是由于其与血管的邻近关系所致（图3C）。
<img alt="移植对血糖和C肽水平的影响；细胞变化的显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：接受hOMING治疗的大鼠在两个月内的代谢随访及移植物评估。（A）使用海藻酸盐作为胰岛载体进行hOMING后的血糖测量，以及（B）C肽水平评估（Tx：移植及胰岛素药丸取出；Explantation：大网膜取出）。移植物具有功能活性，表现为取出胰岛素药丸后仍维持正常血糖水平，且胰岛植入后C肽血症升高。灰色阴影区域表示每个时间点记录的最小值和最大值。（C）采用hOMING方法进行胰岛移植后大网膜切片的苏木精-伊红染色。移植两个月后，胰岛良好地整合入组织中，周围无纤维化组织。血管已在胰岛周围及内部生长（如箭头所示），从而完全恢复胰岛功能。胰岛形态也似乎得到了良好保存。比例尺 = 50 µm。（n = 8）（*p &lt; 0.05；**p &lt; 0.01；***p &lt; 0.001，通过重复测量方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验的诚实显著性差异法确定）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于水凝胶的细胞治疗体内验证方案，以胰岛移植为例进行说明。人网膜基质胰岛原位植入（hOMING）技术可将细胞-水凝胶混合物植入网膜层之间，靠近血管分布区域，从而在适宜的代谢环境中最大限度地提高细胞植入效率。

利用人网膜基质胰岛填充技术（hOMING）进行网膜内胰岛移植

基于细胞治疗的再生医学为治愈疾病带来了新的希望。目前的障碍包括对细胞治疗在体内的有效性进行适当的验证……

该方法有助于解答细胞治疗领域中的关键问题，例如，是否可以通过hOMING外科技术优化胰岛移植？该技术的主要优势在于操作简单、快速、可调节，且生物材料的验证也非常迅速。针头定位的可视化演示至关重要，以确保胰岛正确注入大网膜内，因为针头位置错误可能导致胰岛泄漏。为诱导糖尿病，将链脲佐菌素以每公斤75毫克的剂量经腹腔注射至每只六周龄、体重150至190克的Lewis受体大鼠体内，并在注射后前四天每日检测血糖水平以确认糖尿病状态。当大鼠血糖水平超过每升2克时，每日皮下注射6单位长效胰岛素，以预防糖尿病并发症及体重下降。当大鼠连续两天的尾静脉血糖水平两次测量值均高于每升4至5克，且C肽水平低于200皮摩尔时，将其纳入实验队列。进行颗粒植入时，需确认麻醉后的糖尿病受体动物对脚趾夹捏无反应，并用聚维酮碘清洁颈部。剃除植入区域的毛发，并用额外的聚维酮碘清洁暴露的皮肤。三分钟后，将一颗1/2单位的胰岛素颗粒在1:5的聚维酮碘溶液中消毒，并使用16号套管针刺穿暴露的颈部皮肤。然后，使用导引针和导丝插入药丸，并用单点缝合法缝合切口。用更多的聚维酮碘清洁缝合处，将大鼠置于笼中恢复，并进行监测和喂食，以避免低血糖。为评估药丸的效果，在植入后一个月内每周测量一次血糖降低情况；当胰岛素药丸植入一个月后，实验组大鼠尾静脉血清C肽水平维持在200皮摩尔以下时，视为有效。对于网膜内基质胰岛填充，计数从健康供体大鼠分离得到的胰岛数量，以胰岛当量表示，并按每公斤受体准备7,660个胰岛当量，分装至各1.5毫升离心管中。每份样品用500微升不含胎牛血清的CMRL培养基洗涤，然后在每个离心管中加入150微升新配制的海藻酸盐水凝胶载体，轻柔混匀后置于冰上。接下来，取配备无创21号针头的1毫升注射器，先吸入150微升无气泡的空海藻酸盐溶液，随后吸入150微升含胰岛的海藻酸盐溶液。将注射器置于冰上，并按上述方法准备第一只受体动物的颈部。使用手术刀在旧伤口处做切口，并用镊子取出药丸。用一到两个单针缝合关闭切口，然后将大鼠置于仰卧位。对腹膜区域进行消毒并剃毛。使用手术刀在胸骨下方做一个长约1.5厘米的剖腹切口。将湿润的无菌纱布置于切口周围，辨认位于胃旁的大网膜脂肪垫。用镊子轻轻将脂肪垫从腹腔中拉出，并在纱布上铺开。用两毫升预热至37摄氏度的无菌生理盐水充分润湿大网膜组织。一手用小型弯头镊子夹住组织，另一手持装有胰岛的注射器，将针头刺入大网膜两层之间的边缘处。进针时，确保针头周围包裹有一层薄薄的大网膜组织，然后再开始注射。将针头完全插入，并在缓慢注射胰岛悬液的同时回撤针头，使注射的胰岛均匀分布于组织内。注射过程中，将针头回撤至组织边缘，当针头即将完全退出时停止注射。随后，等待五秒钟，再在下一个位置开始新的注射。然后按照演示方法再注入三到四份等分试样。当所有水凝胶都注射完毕后，小心地拔出针头，以避免注射的胰岛丢失，并检查注射结束时胰岛是否在注射器中发生聚集。当所有胰岛都输送完成后，在将大网膜组织小心地放回腹腔之前，需对大网膜及剖腹切口壁进行润湿处理。向腹腔内注射2毫升预热的无菌生理盐水以使大鼠恢复水分。然后用连续缝合线缝合肌层，并用单个缝合点缝合皮肤层。经过一至两个月的代谢随访后，按所示方法打开每个受体的手术切口，并用镊子将大网膜小心地展开在放置于切口旁的浸有生理盐水的纱布片上。从附着于胰腺尾部的区域开始，使用剪刀切除大网膜组织，并在关闭每只动物前注射2 mL预热的生理盐水，操作如图所示。将取出的大网膜组织置于4%多聚甲醛中固定，随后包埋于石蜡中。然后，使用切片机获取四微米厚的组织切片，并进行苏木精-伊红染色，以对移植物进行形态学评估。使用hOMING方法移植的葡聚糖珠经常被观察到靠近血管，并且在脂肪组织中植入良好。在此项代表性同基因研究中，受体动物的血糖首先通过植入一粒1/2剂量的胰岛素缓释丸进行控制，随后由移植的胰岛维持血糖稳定，表现为血糖水平约为2克/升，C肽浓度高于500皮摩尔。此外，对取出的大网膜进行组织学分析显示，胰岛具有高度再血管化特征，这很可能归因于其与血管的邻近位置。该技术问世后，为细胞治疗领域的研究人员探索临床前模型中的生物工程细胞微环境铺平了道路。

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