Name: 路西法黄 - 人类血脑屏障细胞模型中一个健壮的细胞渗透标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学习使用路西法黄荧光检测法评估人血脑屏障hCMEC/D3细胞模型中紧密连接完整性，该方法可快速计算表观渗透系数并监测屏障形成动力学，适用于DNA纳米颗粒转染后的功能完整性检测。

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作者感谢美国药学协会2017年新研究者奖、杜肯大学Hunkele罕见疾病奖以及Manickam实验室药学院启动资金提供的财务支持。我们感谢杜肯大学Leak实验室在Western印迹实验方面的协助，并允许我们使用其Odyssey 16位成像系统。我们还要特别感谢Manickam实验室的Kandarp Dave在Western印迹实验中提供的帮助。

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li>
<li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling%3A+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li>
<li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters%2C+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC%2FD3+as+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li>
<li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability%3F%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li>
<li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733(2014).</li>
<li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood%E2%80%93brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood%E2%80%93brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650(2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReichel%2C+A+%22The+Blood-Brain+Barrier%22">The Blood-Brain Barrier</a>. , Springer. 307-324 (2003).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+Models%3A+Physiology%2C+Pathology%2C+and+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li>
<li>Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li>
<li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouraud%2C+PO+%22The+hCMEC%2FD3+CELL+LINE%3A+IMMORTALIZED+HUMAN+CEREBRAL+MICROVASCULAR+ENDOTHELIAL+CELLS+As+a+model+of+human+Blood-Brain+Barrier%22">The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier</a>. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).</li>
<li>Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations%3A+often+forgotten+assumptions%5BTitle%5D)+AND+%22research+focus+reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li>
<li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluid+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
<li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Physiological+Society%22%5BJournal%5D)">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li>
<li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function%3A+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li>
<li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca2%2B+directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li>
<li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li>
<li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li>
<li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li>
<li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+assays+for+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645(2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+nanoscience+and+nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li>
<li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC%2FD3+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

血脑屏障（BBB）的关键作用是阻止非必需离子和有毒物质在体循环与大脑之间交换，以维持神经微环境的稳态。BBB的一个特征性特点是毛细血管内皮细胞能够形成紧密连接（TJs），从而有效封闭细胞旁路的物质转运途径。我们展示了荧光素标记的葡聚糖（LY）表观通透系数（Papp）测定法，作为一种定量方法，用于测定培养的hCMEC/D3单层细胞中紧密连接屏障形成的表观动力学。通过Western blot检测ZO-1表达水平，从正交角度验证了LY Papp实验所得数据，下文将对此进行详细讨论。作为该检测方法的进一步应用，我们还证明了DNA纳米颗粒（NP）转染未显著改变LY Papp值，表明该方法适用于在实验体系中检测紧密连接屏障特性的变化。
Western blot 数据显示，ZO-1 表达量在接种后第 3、5、7 天明显增加，在接种后第 10 天略有下降 (图4a)。从 图1可以看...

血脑屏障（BBB）是一种保护性屏障，可限制血浆成分进入脑组织，主要由脑血管内皮细胞及周细胞等支持细胞构成。BBB 的主要功能是作为屏障，封闭外周血液与中枢神经系统（CNS）之间的通路，以维持神经微环境的稳态1,2。脑毛细血管内皮细胞通过形成细胞间紧密连接（TJs）有效封闭了旁细胞通路1。该保护性屏障允许葡萄糖和部分营养物质进入脑组织，同时阻止大多数离子、有毒物质和药物穿过这一紧密屏障。除了保护作用外，BBB 的天然屏障功能也给靶向中枢神经系统的药物递送系统的开发带来了严峻挑战。
血脑屏障（BBB）的体外细胞培养模型是研究其生物学特性以及理解药物治疗对紧密连接屏障完整性影响的有力工具。我们采用人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）作为体外模型，因其是公认的人脑内皮细胞模型3，并能重现人血脑屏障的多种功能。hCMEC/D3是目前最常用的体外血脑屏障建模细胞系之一4,5,6,7,8,9。尽管其跨内皮电阻（TEER）值相对较低——这是衡量屏障紧密性的一个指标——但该细胞系仍保留了脑内皮细胞的大部分形态和功能特性，即使在无胶质细胞共培养的单层培养条件下亦如此6,7。hCMEC/D3细胞系可表达多种血脑屏障标志物，包括主动转运蛋白和受体，并在传代至约第35代前不会去分化为不稳定表型6,7,9,10,11。hCMEC/D3细胞系作为体外血脑屏障模型最显著的特征是其形成紧密连接的能力5,9,11,12。值得注意的是，尽管在许多研究中干细胞来源的血脑屏障模型相比hCMEC/D3细胞系表现出更高的通透性，并且确实表达某些血脑屏障标志物，但其尚未发展成为最常用的血脑屏障细胞模型13。更重要的是，干细胞来源的血脑屏障模型仍需明确其可维持稳定血脑屏障表型的最大传代次数14。
通常采用三种主要方法来评估紧密连接（TJ）屏障的完整性，包括跨上皮电阻（TEER）的测定、小分子亲水性示踪剂（如蔗糖、菊粉、Lucifer Yellow等）的表观渗透系数（Papp）测定，以及对已知TJ分子标志物（如claudin-5、ZO-1、occludin等）进行免疫荧光染色5。TEER是一种相对简单且定量的方法，用于测量培养在多孔膜基底上的细胞单层的电学电阻5。然而，TEER值可能受到多种实验变量的影响，例如培养基的组成和测量仪器的类型。这些因素的综合作用可能导致hCMEC/D3细胞系在培养2至21天后TEER值分布范围较广，从2到1150 Ω cm2不等13。免疫荧光染色是一种通过抗体标记目标蛋白来直观检测TJ蛋白存在的方法。然而，该方法涉及一系列实验步骤，包括细胞固定和通透处理，可能引入实验假象，且荧光信号可能随时间衰减。上述因素可能导致主观误差，影响数据质量。
本研究的主要目的是介绍一种基于荧光素异硫氰酸盐（LY）的表观通透性测定方法，用于确定培养的 hCMEC/D3 细胞形成融合单层的动态过程。尽管其他先进的体外血脑屏障（BBB）系统（如共培养系统、微流控系统）在生理相关性方面更接近真实情况，且屏障功能显著改善15,16,17，但 hCMEC/D3 细胞的 transwell 培养体系仍是一种简单可靠的模型，可用于评估紧密连接（TJ）形成的动力学，并快速筛选不同药物制剂对屏障功能的影响。通常情况下，hCMEC/D3 单层细胞对多种亲水性溶质的 Papp 值具有一致性。例如，在不同的体外&#160;BBB 模型中，报道的多种小分子质量溶质（如蔗糖、甘露醇、LY 等）的 Papp 值均在 10-4 cm/min 数量级5,18,19,20。在我们的实验设置中，脑微血管内皮细胞被接种于经胶原蛋白包被的微孔膜上，以促进细胞贴附和单层结构的形成，从而模拟体内屏障。将 LY 加入顶端侧后，预期其通过细胞间的紧密连接穿过屏障，并在基底外侧侧积累。基底外侧侧中较高的 LY 浓度表明屏障尚未成熟或功能未完全建立，而较低的浓度则反映由于功能性紧密连接的存在限制了物质转运，表明已形成成熟的屏障。
LY 是一种亲水性染料，具有明显的激发/发射峰，可避免使用放射性标记的示踪分子（如蔗糖、甘露醇或菊粉）。因此，可通过LY的荧光值直接计算其跨血脑屏障单层细胞的旁细胞通透性。此外，与生物医学领域中许多商用染料（如荧光素21）因斯托克斯位移较小而受限相比，LY的斯托克斯位移约为108 nm，具有足够的光谱分离度，从而使LY的荧光数据成为测定旁细胞通透性的可靠读数。我们采用蛋白质印迹法（Western blotting）作为正交技术，以展示培养过程中紧密连接标志蛋白ZO-1表达水平的变化。通过蛋白质印迹法检测到的ZO-1表达用于补充LY的Papp数据，结合两者结果表明，LY的Papp值的变化反映了单层细胞的形成过程，并伴随着紧密连接标志蛋白ZO-1表达水平的逐步升高。
如前所述，本研究的核心目标是展示一种荧光素黄（LY）检测方法，作为一种简单技术，用于监测具有功能性紧密连接的融合单层的形成。然而，为了进一步展示所建立检测方法的额外用途，我们测定了转染了DNA纳米颗粒的hCMEC/D3单层细胞中LY的表观渗透系数（Papp）。核酸可通过带正电荷的聚合物基团与带负电荷的核酸磷酸基团之间的静电相互作用，凝聚成直径为100–200 nm的聚电解质纳米颗粒22,23。在本研究中，我们将这些复合物称为DNA纳米颗粒（DNA NPs）。尽管我们的目的是转染细胞并表达目标蛋白，但我们必须确保hCMEC/D3单层细胞的屏障特性未受到破坏。我们的数据表明，标准的4小时荧光素酶基因转染程序并未显著改变LY的通透性，从而证明了LY Papp检测在评估紧密连接屏障完整性变化方面的实用性。

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 细胞系</td><td>Cedarlane Laboratories</td><td>102114.3C-P25</td><td>人脑微血管内皮细胞系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>gWizLuc</td><td>Aldevron&amp;nbsp;</td><td>5000-5001</td><td>编码荧光素酶基因的质粒 DNA</td></tr><tr><td>荧光黄 CH 二锂盐&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>155267</td><td></td></tr><tr><td>带聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）径迹蚀刻膜的 Transwell 小室</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>24 孔平底板&amp;nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>黑色 96 孔免疫板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>437111</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM 1X</td><td>Gibco</td><td>1951695</td><td>旋转式最低必需培养基（S-MEM）</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Clonetics</td><td>CC-3156</td><td>内皮细胞基础培养基-2（EBM-2）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>HyClone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白&amp;nbsp;</td><td>Discovery Labware, Inc.</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解液 5X 试剂&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>甲虫荧光素钾盐&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>荧光酶标仪</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 多克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>abcam</td><td>ab8245</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 标记的 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>128817</td><td></td></tr><tr><td>12 孔平底板</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液（5X）</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62524</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2503-10</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx 成像系统</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>用于扫描 Western 印迹膜</td></tr></tbody></table>

lucifer yellow——一种在人血脑屏障细胞模型中可靠的细胞旁通透性标记物

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

血脑屏障（BBB）由内皮细胞构成，形成系统循环与大脑之间的屏障，以阻止非必需离子和有毒物质的交换。紧密连接（TJ）有效封闭单层细胞间的旁细胞间隙，从而形成完整的屏障。本研究描述了一种基于荧光素（LY）的荧光检测方法，可用于测定其表观通透系数（Papp），进而用于评估hCMEC/D3单层细胞融合过程中紧密连接屏障完整性的形成动力学。我们进一步展示了该检测方法的另一用途，即评估转染细胞中紧密连接的功能完整性。LY的Papp检测结果显示，在Transwell体系中接种的hCMEC/D3细胞在培养7天后能有效限制LY的旁细胞转运。作为该检测方法的附加应用，我们还证明了DNA纳米颗粒转染不会改变hCMEC/D3单层细胞中LY的旁细胞转运。

首先，我们确定了培养时间对LY通透性的影响，以分析TJ形成的表观动力学。LY的平均P应用程序 第1至第10天接种后的数值如图所示 图2a. 第1天，平均P应用程序 4.25 × 10-4 cm/min，并略微下降至 3.32 x 10-4 cm/min，第2天。平均P应用程序 数值略微增加至 3.93 x 10-4 第3天为 cm/min，第6天前波动且无显著变化。P应用程序 数值显著降低至 2.36 x 10-4 cm/min，第7天与第1天相比，P &lt; 0.05），可能表明屏障变得更加紧密。P应用程序 数值稳定在 2.14 × 10 的范围内-4 和 2.36 x 10-4 从第7天到第10天，cm/min，表明屏障已完全形成并具备功能，导致LY的细胞旁转运减少。我...

我们介绍了一种荧光检测方法，用于证明 Lucifer Yellow（LY）是一种可靠的标志物，可用于测定人脑微血管内皮细胞 D3 系（hCMEC/D3）单层细胞的表观旁细胞通透性，该细胞模型是人血脑屏障的体外模型。我们利用该检测方法确定了培养的 hCMEC/D3 细胞形成融合单层的动态过程。

Lucifer Yellow——一种在人血脑屏障细胞模型中可靠的细胞旁通透性标记物

血脑屏障（BBB）由内皮细胞构成，这些细胞在体循环与脑组织之间形成屏障，以阻止……

本方案是一种用于评估人血脑屏障细胞模型中细胞间紧密连接功能完整性的可靠技术。该方法简单且成本相对较低，能够在较短时间内计算表观通透性，而无需进行耗时较长的动力学检测。该方法还可用于评估转染了聚合物DNA纳米颗粒的脑微血管内皮细胞中紧密连接的功能完整性。开始细胞铺板时，将带有微孔膜的组织培养小室放入24孔培养板中。在每个组织培养小室内加入400 µL浓度为0.15 mg/mL的I型胶原蛋白。然后在37°C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。轻轻摇动24孔板，使胶原溶液在组织培养插件的微孔膜上均匀铺展。一小时后，移除胶原溶液，并用0.4毫升1×PBS缓冲液轻轻洗涤微孔膜。随后，在细胞插件中以每平方厘米50,000个细胞的密度接种hCMEC/D3细胞。将含有组织培养装置的24孔板放入培养箱中，以促进细胞贴壁和增殖。培养7天，使细胞达到100%汇合度。每隔一天更换一次生长培养基，并向组织培养小室中加入0.5毫升预热的新鲜培养基。重复进行蛋白质印迹法的铺板操作，以检测DNA纳米颗粒转染后ZO-1表达的变化；同时进行ATP检测，以评估转染细胞的活力。为测定 Lucifer Yellow 的表观通透性，于接种后的每一天，移除培养基，并向孔板的基底侧加入1.5毫升预热的转运缓冲液。随后，向每个Transwell小室的顶端侧加入58.3微升20微摩尔的Lucifer Yellow溶液。保留 50 微升溶液用于荧光测定。从顶端完全去除残留的 PBS 缓冲液后，应尽快加入 Lucifer Yellow 溶液，以避免细胞干燥。确保顶端加入的 Lucifer Yellow 溶液体积准确。确保在所有插入物中加入相同且准确体积的 Lucifer Yellow 溶液。操作需迅速，以避免细胞干燥。将细胞置于旋转板摇床中，在 100 RPM 和 37 °C 条件下孵育 60 分钟。然后从每个顶侧室中移除 30 微升的荧光黄样品。将 20 微摩尔的荧光黄溶液和顶侧样品转移至预先标记的试管中。现在使用转运缓冲液将样品稀释十倍。从每个基底外侧室中移除 500 微升液体，并将样品转移至预先标记的试管中。配制一系列荧光黄标准品以绘制标准曲线。将每种标准品、顶端和基底外侧样品各 100 微升，分别加入黑色 96 孔板的每个孔中，每样设两个复孔。使用荧光酶标仪测量荧光黄的荧光强度，并根据文稿正文中的描述计算表观通透性。通过考察培养时间对荧光黄通透性的影响，确定紧密连接形成的表观动力学。与第1天相比，第7天的表观通透性值显著降低，表明屏障变得更加紧密。表观通透性数值随后稳定至第10天。这表明屏障形成已完全且具有功能，导致 Lucifer Yellow 的旁细胞转运减少。采用蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白 ZO-1 随时间变化的表达水平变化。两条条带代表ZO-1的两种异构体。密度分析显示，接种后第3天至第7天，ZO-1的像素值逐渐增加，表明紧密连接蛋白ZO-1在第3天至第7天期间持续形成。接种后第7天经钙离子耗竭处理后，ZO-1条带几乎无法检测到，说明在缺乏钙离子的情况下ZO-1无法形成。结果表明，可通过检测ZO-1蛋白的蛋白印迹实验来分析紧密连接蛋白表达水平的变化，从而补充基于 Lucifer Yellow 的功能活性数据。我们还发现，DNA 纳米颗粒转染对人脑微血管内皮细胞中紧密连接的功能活性无影响。

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