Lucifer Yellow——一种在人血脑屏障细胞模型中可靠的细胞旁通透性标记物

本方案是一种用于评估人血脑屏障细胞模型中细胞间紧密连接功能完整性的可靠技术。该方法简单且成本相对较低，能够在较短时间内计算表观通透性，而无需进行耗时较长的动力学检测。该方法还可用于评估转染了聚合物DNA纳米颗粒的脑微血管内皮细胞中紧密连接的功能完整性。

开始细胞铺板时，将带有微孔膜的组织培养小室放入24孔培养板中。在每个组织培养小室内加入400 µL浓度为0.15 mg/mL的I型胶原蛋白。然后在37°C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。

轻轻摇动24孔板，使胶原溶液在组织培养插件的微孔膜上均匀铺展。一小时后，移除胶原溶液，并用0.4毫升1×PBS缓冲液轻轻洗涤微孔膜。随后，在细胞插件中以每平方厘米50,000个细胞的密度接种hCMEC/D3细胞。

将含有组织培养装置的24孔板放入培养箱中，以促进细胞贴壁和增殖。培养7天，使细胞达到100%汇合度。每隔一天更换一次生长培养基，并向组织培养小室中加入0.5毫升预热的新鲜培养基。

重复进行蛋白质印迹法的铺板操作，以检测DNA纳米颗粒转染后ZO-1表达的变化；同时进行ATP检测，以评估转染细胞的活力。为测定 Lucifer Yellow 的表观通透性，于接种后的每一天，移除培养基，并向孔板的基底侧加入1.5毫升预热的转运缓冲液。随后，向每个Transwell小室的顶端侧加入58.3微升20微摩尔的Lucifer Yellow溶液。

保留 50 微升溶液用于荧光测定。从顶端完全去除残留的 PBS 缓冲液后，应尽快加入 Lucifer Yellow 溶液，以避免细胞干燥。确保顶端加入的 Lucifer Yellow 溶液体积准确。

确保在所有插入物中加入相同且准确体积的 Lucifer Yellow 溶液。操作需迅速，以避免细胞干燥。将细胞置于旋转板摇床中，在 100 RPM 和 37 °C 条件下孵育 60 分钟。

然后从每个顶侧室中移除 30 微升的荧光黄样品。将 20 微摩尔的荧光黄溶液和顶侧样品转移至预先标记的试管中。现在使用转运缓冲液将样品稀释十倍。

从每个基底外侧室中移除 500 微升液体，并将样品转移至预先标记的试管中。配制一系列荧光黄标准品以绘制标准曲线。将每种标准品、顶端和基底外侧样品各 100 微升，分别加入黑色 96 孔板的每个孔中，每样设两个复孔。

使用荧光酶标仪测量荧光黄的荧光强度，并根据文稿正文中的描述计算表观通透性。通过考察培养时间对荧光黄通透性的影响，确定紧密连接形成的表观动力学。与第1天相比，第7天的表观通透性值显著降低，表明屏障变得更加紧密。

表观通透性数值随后稳定至第10天。这表明屏障形成已完全且具有功能，导致 Lucifer Yellow 的旁细胞转运减少。采用蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白 ZO-1 随时间变化的表达水平变化。

两条条带代表ZO-1的两种异构体。密度分析显示，接种后第3天至第7天，ZO-1的像素值逐渐增加，表明紧密连接蛋白ZO-1在第3天至第7天期间持续形成。接种后第7天经钙离子耗竭处理后，ZO-1条带几乎无法检测到，说明在缺乏钙离子的情况下ZO-1无法形成。

结果表明，可通过检测ZO-1蛋白的蛋白印迹实验来分析紧密连接蛋白表达水平的变化，从而补充基于 Lucifer Yellow 的功能活性数据。我们还发现，DNA 纳米颗粒转染对人脑微血管内皮细胞中紧密连接的功能活性无影响。