Name: 原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习从小鼠骨骼肌中分离高纯度原代微血管内皮细胞的方法。该方案采用酶解消化和免疫磁珠分选技术，为研究肌肉血管单元和血肌屏障功能提供可靠的体外实验模型。

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本工作由 &#34;Else Kröner-Fresenius-Stiftung&#34;（项目编号 2018_A03，授予 TR）、&#34;Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster&#34;（项目编号 I-RU211811，授予 TR）以及德国研究基金会（DFG，项目编号 INST 2105/27-1、ME 3283/5-1 和 ME 3283/6-1，授予 SGM）资助。插图由 Heike Blum 提供。

所有动物实验均经当地主管部门批准，并依照德国动物福利法（84-02.05.20.13.097）进行。
1. 动物实验的一般说明
<ol>
	<li>所有小鼠实验均须依照各机构动物护理与使用委员会的指南进行。</li>
	<li>将小鼠饲养在标准化条件下，并遵循国际指南，例如实验动物科学协会联合会（FELASA）的规定。 
	注意：通常，该分离技术可用于不同年龄、性别或遗传背景的小鼠。为获得足够的细胞数量，优先选用 4–10 周龄的雄性小鼠，因为生物学特性可能随年龄和性别而变化。</li>
</ol>
2. 溶液、培养基和包被的制备
<ol>
	<li>通过将 2.2 mL 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）与 200 μL 胶原酶-分散酶（Collagenase-Dispase）和 45 μL 脱氧核糖核酸酶（DNase）混合，制备消化液（DS）。</li>
	<li>通过将 450 mL DMEM 与 50 mL 胎牛血清（FCS，约 10%）、0.25 mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 μg/mL，约 0.05%）以及 5 mL 青霉素-链霉素（约 1%）混合，制备 500 mL 内皮细胞培养基（ECM）。在玻璃容器中进行无菌过滤（滤膜孔径：0.2 μm），随后将溶液保存于 4 °C。</li>
	<li>按以下方法包被细胞培养板。
	<ol>
		<li>对于新鲜分离的原代小鼠 MEC 的培养，按照生产商说明，在室温（RT）下使用凝胶原为基础的快速包被溶液（见材料表），每孔加入 1 mL 覆盖 6 孔细胞培养板的整个表面，作用 3–5 分钟。</li>
		<li>吸除并弃去包被液。连续进行两次洗涤，每次用 2 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.1–7.5）冲洗每孔。</li>
		<li>吸除并弃去 PBS。每孔加入 1 mL ECM 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠原代肌肉微血管内皮细胞（MMEC）的分离
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法对一只4至12周龄的成年雄性小鼠实施安乐死，无需麻醉。目的是迅速分离脊髓与脑组织，以确保动物快速且无痛地死亡。</li>
	<li>切断末端。
	<ol>
		<li>使用外科用尖/钝剪（切割刃42 mm，直型）和尖/尖剪（切割刃23 mm，直型），直型（带齿，2 mm × 1.25 mm × 12 cm）和弯型（带齿，1.3 mm × 1 mm × 13 cm）镊子。</li>
		<li>使用70%乙醇对所有手术器械进行消毒。</li>
		<li>将动物仰卧位放置，用70%乙醇润湿其腿部。使用锋利/钝头手术剪在髋关节处切断整个腿部。将四肢置于封闭的细胞培养皿（35 mm × 10 mm）中。 
		注意： 从现在开始，所有步骤均须在无菌超净工作台内进行，并使用灭菌器械操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离肌肉组织（优先使用双侧腿的股四头肌或腓肠肌）。
	<ol>
		<li>使用锋利的剪刀和弯头镊子，从髋部向足尖方向切开皮肤。用直头镊子夹住脚趾或足垫，再用弯头镊子从足趾向髋部方向剥离皮肤。</li>
		<li>分离 股四头肌 从膝部切断肌腱，并沿股骨向髋部切断肌肉。分离 腓肠肌和比目鱼肌复合体 通过切断跟腱。随后沿胫骨切至腘窝，并移除肌肉。 
		注意： 如果存在大血管（A. femoralis, 胫骨前肌, 胫后动脉, A. fibularis在分离的肌肉中若可见血管，应去除血管以避免大血管内皮细胞的污染。</li>
		<li>为去除大血管，用弯头镊子夹住不含大血管的肌肉部分，并在血管附近将其剪除。本方案中，1 g 或更少的肌肉组织相当于两侧 股四头肌 和 腓肠肌和比目鱼肌 建议。</li>
		<li>将2,445 µL DS（来自步骤2.1）加入细胞培养皿（35 mm × 10 mm）中，并测定其重量。</li>
		<li>将所有肌肉组织块转移至含有2445 µL DS的细胞培养皿中，并称重。两次测量值之差即为肌肉组织的干重，不得超过1 g。</li>
		<li>使用锋利的剪刀将整块肌肉组织切成小块（≤2 mm 的立方体，约 100 块）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解离肌肉组织。 
	注意： 此步骤耗时约120分钟。
	<ol>
		<li>将肌肉/DS悬液在37 °C（含5% CO₂的培养箱）中保存2) 1.5 小时。使用 1 mL 胰岛素注射器每 20 分钟轻轻混匀一次，每次约 5 分钟。</li>
		<li>将悬液转移至置于50 mL离心管上的70 μm尼龙细胞筛网，收集滤过液。用8 mL DMEM洗涤细胞筛网，收集滤过液。</li>
		<li>弃去细胞滤筛，将悬液于300 x g离心10分钟 g 在 20 °C 下。小心移除上清液。 
		注意： 沉淀物容易丢失。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中（见附录 材料表) 裂解红细胞，室温孵育30秒。加入9 mL DMEM + 10% FCS以终止反应，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耗尽 CD45+ 细胞，按照CD45磁珠生产商的说明书进行操作。后续所有CD45步骤+ 使用MCS缓冲液进行耗竭（见所附材料表）。 
	注意： 此步骤耗时约60分钟。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板（Neubauer细胞计数室）确定细胞数量（预计约为5 × 10⁶个细胞/mL）6 每克肌肉组织中的细胞数</li>
		<li>300 x g 离心悬浮液 g 4 °C 下离心 10 分钟。完全去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 90 µL MCS 缓冲液中（每 107 细胞或更少）。加入10 μL CD45微珠（每107 细胞或更少。</li>
		<li>将细胞悬液混合，在4–8 °C冰箱中孵育15分钟。</li>
		<li>加入1 mL MCS缓冲液（每10）7 细胞或更少）。在300 x g 4°C下离心10分钟。完全去除上清液，并将细胞重悬于500 μL MCS缓冲液中。</li>
		<li>用于磁性细胞分离时，使用带有8 mL储液池、最大容量为2 × 10⁸细胞的大型磁性分离柱（LMC）9 总细胞数。将LMC置于分离器的磁场中。</li>
		<li>用 3 mL MCS 缓冲液冲洗 LMC 的储液器。冲洗后，在柱下方放置一个 15 mL 圆锥管以收集穿流液。将全部细胞悬液（500 µL）加样至柱上，并让其完全流穿。</li>
		<li>用 3 mL MCS 缓冲液冲洗柱子 3 次，每次加入缓冲液至储液室后，待储液室完全排空，再进行下一次冲洗步骤。</li>
		<li>收集流穿柱子的未标记细胞，用于后续分离步骤（代表 CD45- 分选部分）。标记的细胞（代表 CD45+ 收集在柱中的部分可弃去。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>累积 CD31+ 根据CD31磁珠生产商的说明书对细胞进行处理。后续所有CD31相关步骤+ 使用MCS缓冲液进行积累。 
	注意： 此步骤需要约60分钟。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板（Neubauer细胞计数室）确定细胞数量（预期约为4 × 10⁶个细胞/mL）6 每克肌肉组织中的细胞数）。</li>
		<li>将步骤3.5中获得的未标记细胞悬液在300 x g条件下离心10分钟 g 4°C下</li>
		<li>完全去除上清液。将沉淀重悬于90 μL MCS缓冲液中，并按每107 总细胞数或更少量）。混匀整个悬液，在冰箱中于 4–8 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入1 mL MCS缓冲液，300 × g离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。弃上清液，将细胞重悬于 500 µL MCS 缓冲液中。</li>
		<li>用于磁性细胞分离时，使用中等磁场柱（MMC），其储液体积为3.5 mL，最大容量可达2 × 108 总细胞数</li>
		<li>将MMC置于分离器的磁场中。用500 µL MCS缓冲液冲洗MMC。冲洗后，在柱下方放置一个15 mL圆锥形离心管以收集穿流液。</li>
		<li>将整个细胞悬液（500 µL）上样至柱中，并让其完全流穿。</li>
		<li>用 500 µL MCS 缓冲液洗涤柱子三次，每次加入缓冲液后等待柱子的储液室完全排空，再进行下一次洗涤步骤。未标记的细胞流过柱子，代表 CD45- CD31- 组分。将其保存以进行进一步的质量控制。</li>
		<li>将柱子从分离器上取下，置于合适的收集管（15 mL 管）上。用移液器将 2 mL MCS 缓冲液加到柱子上。立即用力将活塞推入柱中，以洗脱磁标记的细胞。该 CD45- CD31+ 组分代表富集的小鼠原代内皮细胞。</li>
		<li>离心细胞悬液，350 × g，5 分钟 g 在 20 °C 下。完全去除上清液，并重悬细胞（预计约 0.6 x 106 每克肌肉组织的细胞数）于1 mL ECM中（见步骤2.2）。转移细胞（0.5–0.7 x 106 细胞）加入至已包被的6孔培养板（来自步骤2.3）的一个孔中，每孔含1 mL细胞外基质（ECM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养时，将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育2 在无菌培养箱中培养。每两到三天更换一次细胞外基质（ECM）。</li>
</ol>
4. 小鼠原代MMEC纯化
<ol>
	<li>进行第二轮 CD31 分离+ 积累，按照制造商说明操作（CD31磁珠小鼠操作步骤；参见步骤3.6）。
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到80–90%时（通常在7天后），使用胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞。操作时，用2 mL无菌PBS连续洗涤每孔两次。每孔6孔板加入800 μL胰蛋白酶/EDTA溶液，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在无菌培养箱中孵育3–5分钟。加入1200 μL含至少10% FCS的DMEM终止酶活性。</li>
		<li>将细胞悬液在350 x g下离心5分钟 g 在 20 °C。</li>
		<li>进行第二次CD31-MCS步骤以提高纯度（按照CD31磁珠生产商的说明书操作；参见3.6节）。</li>
		<li>观察细胞汇合度 通过 明场或标准相差显微镜，使用 
		20倍放大倍数和0.35镜头数值孔径。参见 图1. 
		注意： 细胞可用于相应的实验，或通过传代维持培养。建议在较低代次时尽快使用细胞进行实验。不建议在传代次数过多后使用细胞 
		8–10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 质量控制
<ol>
	<li>在第二次 CD31-MCS 步骤后对原代小鼠 MMEC 进行流式细胞术分析。
	<ol>
		<li>准备一个流式细胞术（FACS）管，加入 1 mL 流式细胞术（FC）缓冲液（参见附带的材料表）。</li>
		<li>当细胞达到 100% 汇合度时（通常在 14 天后），使用胰蛋白酶/EDTA 溶液消化细胞。操作时，用 2 mL 无菌 PBS 连续冲洗每个孔两次。每 6 孔板孔加入 800 μL 胰蛋白酶/EDTA 溶液，在 37 °C、5% CO2 的无菌培养箱中孵育 3–5 分钟。加入含 10% FCS 的 1200 μL DMEM 以终止酶活性。</li>
		<li>使用 Neubauer 细胞计数板确定细胞数量，并将至少 1 × 105 个细胞加入已准备好的 FACS 管中。</li>
		<li>将细胞悬液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。通过弃去上清液、用 1 mL FC 缓冲液重悬细胞，并再次在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，重复洗涤两次。</li>
		<li>在 FC 缓冲液中配制染色混合液，加入抗小鼠 CD31-FITC 抗体（1:100）和抗小鼠 CD45-PE 抗体（1:100）。</li>
		<li>在 FACS 管中用 100 μL 染色混合液重悬细胞，在 4 °C 下孵育 30 分钟。加入 1 mL FC 缓冲液，在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。小心弃去上清液，将细胞重悬于 200 μL FC 缓冲液中。</li>
		<li>使用流式细胞仪进行检测，参照图 2A 所示的设门策略进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：在第二次 CD31-MCS 步骤后对原代小鼠 MMEC 进行免疫荧光染色。
	<ol>
		<li>包被盖玻片。
		<ol>
			<li>将一片无菌的直径为 13 mm 的圆形玻璃盖玻片转移至 24 孔板的一个孔中。每孔加入 300 µL 快速包被液进行包被，在室温（RT）下孵育 3–5 分钟。</li>
			<li>吸除并弃去包被液。每孔用 2 mL 无菌 PBS 连续冲洗两次。吸除并弃去 PBS。</li>
			<li>在包被后的盖玻片上接种 1 × 105 个细胞于 1 mL ECM 培养基中，在 37 °C、5% CO2 的无菌培养箱中培养至细胞汇合度达 99%。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行固定和免疫荧光染色。
		<ol>
			<li>移除 5.2.1.3 步骤中培养细胞的 ECM 培养基。</li>
			<li>每孔加入 300 µL pH 7.4 的 4% 多聚甲醛（PFA），在 4°C 下固定 10 分钟。 
			注意：PFA 具有毒性，操作时需谨慎。</li>
			<li>每孔加入 1 mL PBS，室温下静置 5 分钟后弃去上清液，重复此洗涤步骤共 3 次。</li>
			<li>在 PBS 中配制含 5% BSA、0.2% Triton-X 和 1% 山羊血清的封闭液。</li>
			<li>每孔加入 300 µL 封闭液，在室温下孵育 1 小时。</li>
			<li>弃去上清液，每孔加入 200 µL 抗 PECAM-1（CD31）抗体（1:200）溶液（溶于含 5% BSA 和 1% 山羊血清的 PBS 中），在 4 °C 下过夜孵育。</li>
			<li>每孔加入 1 mL PBS，室温下静置 5 分钟后弃去上清液，重复此洗涤步骤共 3 次。</li>
			<li>在含 1% BSA 的 PBS 中配制含 Cy3 标记的抗大鼠 IgG 抗体（1:500）的二抗溶液。每孔加入 300 µL 二抗溶液，在避光条件下室温孵育 1 小时。</li>
			<li>每孔加入 1 mL PBS，室温下静置 5 分钟后弃去上清液，重复此洗涤步骤共 3 次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用镊子小心取出圆形玻璃盖玻片，转移至显微镜载玻片上。在细胞层上滴加适量含 DAPI 的封片剂，再小心盖上盖玻片（参见附带的材料表）。</li>
		<li>使用配备荧光光源（120 W）和两组滤光片的荧光显微镜观察细胞：第一组激发/发射波长为 550/25 nm 和 605/70 nm，用于检测 Cy3（540/562 nm）。</li>
		<li>第二组滤光片的激发/发射波长为 365/50 nm 和 445/50 nm，用于检测 DAPI（350/440 nm）。DAPI 检测时使用 40 倍放大倍数，光强为 14.5 mW/cm2 的 80%，曝光时间为 30 ms；Cy3 检测时使用 67.5 mW/cm2 的 80%，曝光时间为 60 ms。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行定量 PCR 分析。
	<ol>
		<li>mRNA 的提取。
		<ol>
			<li>使用酸性硫氰酸胍-苯酚（AGTP）试剂，按照标准操作流程提取 mRNA。分别从 CD45- CD31-（见步骤 3.6.8）、CD45- CD31+（见步骤 3.6.9）组分以及培养的原代小鼠 MMEC（4.1.3）中提取，每组至少使用 0.5 × 106 个细胞。</li>
			<li>将细胞悬液在 20 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，完全弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 500 µL AGTP 试剂中，转移至 2 mL 反应管，室温孵育 5 分钟。</li>
			<li>加入 100 µL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温孵育 3 分钟。</li>
			<li>在 4°C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
			<li>小心吸取上层水相（含 RNA），转移至 1.5 mL 反应管中。加入 250 µL 异丙醇，室温孵育 10 分钟。</li>
			<li>在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，小心加入 1 mL 75% 乙醇。在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。 
			注意：沉淀容易丢失。</li>
			<li>完全弃去上清液，将沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。 
			注意：需去除乙醇，但不可过度干燥。</li>
			<li>将沉淀溶于 30 µL 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中，并在 55 °C 下加热 10 分钟。 
			注意：RNA 浓度和纯度可通过分光光度计测定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行 cDNA 合成（逆转录 PCR）。
		<ol>
			<li>配制主混合液：10 µL PCR 缓冲液（5×）、2.5 µL 脱氧核苷三磷酸（dNTP，10 mM）、0.5 µL 随机单链引物混合物（0.2 µg/µL）、1 µL RNase 抑制剂（40 U/µL）、0.4 µL 逆转录酶（200 U/µL）以及 5.6 µL 焦碳酸二乙酯处理的水（参见附带的材料表）。</li>
			<li>将 500 ng RNA 溶于 30 µL 焦碳酸二乙酯处理的水中，加入 0.2 mL PCR 管，再加入全部 20 µL 主混合液。</li>
			<li>使用 PCR 仪进行以下程序：25 °C 孵育 10 分钟，50 °C 孵育 30 分钟，85 °C 孵育 5 分钟，最后 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行定量 PCR（qPCR）。 
	注意：样本的 qPCR 应设置重复孔（双复孔或三复孔）。</li>
	<li>使用两种不同荧光染料标记的引物。目标基因引物的吸收波长为 495 nm，发射波长为 517 nm。</li>
	<li>检测卫星细胞标志物基因表达时，使用配对盒蛋白 7（Pax7）和 M-钙黏蛋白（Cdh15）的引物（参见附带的材料表）。</li>
	<li>检测内皮细胞标志物基因表达时，使用闭合蛋白-5（Cld5）、闭锁蛋白（Ocln）和紧密连接蛋白-1（Tjp1 或 ZO1）的引物（参见附带的材料表）。</li>
	<li>以 18S rRNA 作为参考基因，使用吸收波长为 538 nm、发射波长为 554 nm 的引物。</li>
	<li>针对每个目标基因，使用相应引物配制 qPCR 主混合液。主混合液包含：10 µL qPCR 缓冲液（2×）、1 µL 目标基因引物（10 µM）、1 µL 18S rRNA 引物以及 4 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>将 16 µL 主混合液加入 96 孔反应板的单个孔中。每孔加入 4 µL cDNA（来自步骤 5.3.2）。</li>
		<li>使用实时荧光定量 PCR 仪进行以下程序：预变性阶段：50 °C 2 分钟，95 °C 10 分钟；循环扩增阶段：95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，共 40 个循环。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

微血管内皮细胞在所有组织中均发挥屏障功能，其功能障碍会导致相关器官的疾病3。此外，对微血管内皮细胞的器官特异性研究可能为开发新的治疗策略铺平道路。因此，深入理解微血管内皮细胞在生理和病理生理条件下的功能具有重要的科学意义。通过调节白细胞与内皮的相互作用，已成功利用那他珠单抗（natalizumab）治疗多发性硬化症患者，该抗体可阻止淋巴细胞黏附，从而抑制其跨内皮迁移6。然而，包括炎症亚型在内的多种肌病至今仍难以有效治疗。因此，阐明骨骼肌内皮细胞中内皮细胞的特异性特性，可能有助于拓展现有肌病治疗方法或催生新的治疗策略。
永生化内皮细胞系（IECL）已建立并用于多种体外模型。由于具有永生化特性和快速增殖能力，这些细胞系相较于原代微血管内皮细胞具有一定优势。此外，原代培养细胞经过一定时间或传代后可能发生衰老，并丧失或改变其形态及生理功能。然而，IECL仅能保留部分内皮细胞特性，无法完全模拟来源于不同器官的原代微血管内皮细胞的多样性。值得注意的是，目前极少有IECL来源于骨骼肌。迄今为止，仅有一...

通过 血液、细胞和器官通过毛细血管获得氧气、底物及其他必需分子的供应。这种物质交换发生在最小的血管——毛细血管中。毛细血管由内皮细胞（EC）单层构成，其完整性是维持血管内空间与间质空间之间肌肉稳态有效调节的前提。为了确保可溶性因子和细胞的选择性转运，内皮细胞通过紧密连接和黏附连接相互连接，形成连续的单层结构。 1除了作为营养物质或代谢产物的屏障外，内皮细胞（EC）还调控炎症过程中白细胞的募集。炎症或组织损伤可导致内皮细胞表面黏附分子上调，并促进趋化因子的产生，从而介导白细胞的黏附及其向靶组织的跨内皮迁移。 2因此，内皮细胞在调控炎症过程（如抵御病原体或组织修复）中发挥关键作用。
内皮细胞（EC）功能障碍与血管疾病、慢性肾衰竭、静脉血栓以及严重病原体感染直接相关。此外，内皮细胞几乎始终参与器官特异性自身免疫性疾病，如糖尿病或多发性硬化症3。因此，血液与器官之间的屏障功能由多种细胞类型的协同相互作用所调控。在骨骼肌微血管中，内皮细胞（MMEC）与肌细胞、成纤维细胞和周细胞共同构成一个功能单位，即&#34;肌血管单位&#34;（MVU）。因此，MVU的功能障碍可能在肌病的病理生理过程中发挥关键作用。然而，目前对这些调控机制的深入理解仍然缺乏，从而阻碍了在肌病中发现新的、迫切需要的治疗靶点。
为了研究复杂的生理和病理生理机制，通常使用动物模型。然而 体外 模型的优势在于可通过排除多种混杂因素，专注于研究目标。为在体外研究相关过程，必须分离出纯净且具有活性的原代细胞。与细胞系相比，从转基因动物中分离的原代细胞可实现对基因修饰后果的体外研究。
本文介绍了一种通过机械和酶消化法分离原代小鼠心肌微血管内皮细胞（MMEC），并结合磁珠激活细胞分选技术（MCS）进行纯化的方法。该方法使用针对特定表面标志物的磁珠进行分选。血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM1，CD31）主要在内皮细胞（EC）上表达，可用于富集此类细胞。为确保细胞纯度，通过阴性筛选去除造血来源的细胞，即针对蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C（PTPRC，CD45）进行排除。此外，本文还介绍了质量控制方法、原代小鼠MMEC的培养条件、潜在应用与局限性以及相关注意事项。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200-056</td><td>即用型</td></tr><tr><td>ACK 缓冲液</td><td></td><td></td><td>150 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl，10 mM KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，0.1 mM EDTA 溶于水，pH 7.3</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31-FITC（克隆 MEC13.3）</td><td>Biolegend</td><td>102506</td><td>同型对照：FITC 大鼠 IgG2a，&amp;kappa; 同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45-PE（克隆 30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td>同型对照：PE 大鼠 IgG2b，&amp;kappa; 同型对照</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>碱性成纤维细胞生长因子</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD31 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD45 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶-分散酶</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>来自&lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt;的胶原酶，来自&lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt;的分散酶</td></tr><tr><td>Corning Costar 细胞培养处理多孔 6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 标记的抗大鼠 IgG 抗体</td><td>dianova</td><td>712-166-153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂）</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>牛胰腺来源的脱氧核糖核酸酶 I</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯处理水</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，含谷氨酰胺补充剂和丙酮酸</td><td>Thermo Fisher</td><td>31966-021</td><td>使用前预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dNTP 混合液（10 mM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Sarstedt</td><td>551,579</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FC 缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.1% BSA，0.2% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，2 mM EDTA</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>可固定活力染料 eFluor780</td><td>Thermo Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>镊子（带齿，直头，12 cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>镊子（带齿，直头，12 cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器 100 Solo 1 mL（Omnifix）</td><td>Braun</td><td>9161708V</td><td></td></tr><tr><td>大型磁性分离柱（LS 柱）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>用于 CD45-MACS 步骤</td></tr><tr><td>MCS 缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.5% BSA，2 mM EDTA 溶于 PBS，pH 7.2</td></tr><tr><td>中型磁性分离柱（MS 柱）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>用于 CD31-MACS 步骤</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>磷酸盐缓冲液，即用型</td></tr><tr><td>PCR 缓冲液（5x）</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td>与逆转录酶配套试剂盒提供</td></tr><tr><td>Pecam1 大鼠 &amp;alpha;-小鼠</td><td>SantaCruz</td><td>Sc-52713</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>原代小鼠肌细胞</td><td>celprogen</td><td>66066-01</td><td></td></tr><tr><td>Cdh15（M-钙黏蛋白）引物</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00483191_m1</td><td>FAM 标记</td></tr><tr><td>Cldn5（claudin-5）引物</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00727012_s1</td><td>FAM 标记</td></tr><tr><td>Ocln（occludin）引物</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00500912_m1</td><td>FAM 标记</td></tr><tr><td>Pax-7 引物</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm01354484_m1</td><td>FAM 标记</td></tr><tr><td>Tjp-1（Zonula occludens 1）引物</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00493699_m1</td><td>FAM 标记</td></tr><tr><td>18s rRNA 引物（真核内源性对照）</td><td>Thermo Fisher</td><td>4310893E</td><td>VIC 标记</td></tr><tr><td>qPCR 缓冲液（Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)）</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0231</td><td>2 × 1.25 mL；每份可进行 200 次反应</td></tr><tr><td>单链随机引物混合物</td><td>Thermo Fisher</td><td>SO142</td><td>随机六聚体引物</td></tr><tr><td>逆转录酶（200 U/&amp;mu;L）+ PCR 缓冲液（5x）</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂（40 U/&amp;mu;L）</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（刃长 23 mm，尖/尖）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（刃长 42 mm，尖/钝）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Speed Coating 溶液</td><td>PeloBiotech</td><td>PB-LU-000-0002-00</td><td></td></tr></tbody></table>

分离原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

骨骼肌毛细血管的内皮细胞（骨骼肌微血管内皮细胞，MMEC）构成血液与骨骼肌之间的屏障，调控液体和营养物质的交换，并通过控制免疫细胞迁移来调节针对病原体的免疫反应。为了实现这些功能，MMEC 与其他多种细胞类型（如成纤维细胞、周细胞和骨骼肌细胞）共同形成一个功能性的&#34;肌血管单元&#34;（MVU）。因此，MMEC 及其构成的 MVU 功能障碍可导致多种肌病的发生。然而，MMEC 在生理和病理状态下的调控机制仍未能被充分阐明，而对其机制的解析是开发更特异性肌病治疗策略的前提。对原代 MMEC 在 MVU 背景下的功能进行分离和深入研究，可能有助于更好地理解这些过程。
本文提供了一种通过机械和酶解离方法分离骨骼肌原代小鼠微血管内皮细胞（MMEC）的实验方案，包括纯化及培养维持步骤。

分离后一天，原代小鼠MMEC和残留的其他细胞形成团块并贴附于培养皿底部（图1A 第1天）。从第7天开始，可观察到扁平且伸长的细胞。然而，仍可见其他细胞（ mostly 为球形细胞）的污染（图1A 第7天）。因此，需进行另一轮CD31阳性筛选 通过 需要MCS。此后，原代小鼠MMEC增殖至约80–90%的密度。达到汇合时，它们通常形成一层不重叠、细胞呈纵向排列的单层细胞图1A 第14天）。由于接触抑制，细胞在汇合后停止增殖。14天后，细胞数量约为5–10 × 105 细胞可用于进一步的研究。
质量控制 通过 使用可固定活力染料 FVD780（用于标记死细胞）、PECAM1（CD31）和 PTPRC（CD45，作为造血来源...

骨骼肌微血管内皮细胞（MMEC）构成肌毛细血管的内壁，调控肌肉组织与血液之间液体/分子的交换以及（免疫）细胞的迁移。本文所述原代小鼠MMEC的分离方法，可实现对&#34;肌血管单元&#34;的全面体外研究。

骨骼肌毛细血管的内皮细胞（骨骼肌微血管内皮细胞，MMEC）构成血液与骨骼肌之间的屏障……

本方案描述了一种从骨骼肌中分离微血管内皮细胞的平台技术。这些细胞可用于进一步研究血液-肌肉屏障功能等。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够以高纯度分离出原代微血管内皮细胞。该技术有助于解答免疫介导性肌肉疾病领域中的关键问题，例如在健康与疾病状态下肌肉细胞与内皮细胞之间的相互作用。首先，按照方案所述准备所有所需溶液和六孔板。开始实际操作时，取一把外科用尖头/钝头剪刀、一把外科用尖头/尖头剪刀，以及直头和弯头镊子。使用70%乙醇对所有手术器械进行消毒。将已处死的成年雄性小鼠仰卧位放置，并用70%乙醇润湿其腿部。使用尖头/钝头手术剪，在髋关节处切断每条完整的腿。将四肢置于封闭的细胞培养皿中。将培养皿转移至无菌超净工作台。使用锋利的剪刀和弯头镊子从髋部至脚趾尖端将皮肤剪开。使用直镊夹住脚趾或足垫，同时用弯镊从脚趾向髋部剥离皮肤。为分离股四头肌，从膝部切断肌腱，并沿股骨向髋部切开肌肉。切断跟腱以分离小腿三头肌。接着，沿胫骨切至腘窝并去除肌肉。对于无法分离的肌腱，用弯头镊子夹住肌肉，逐一剪除相应的肌腱。将 2,445 微升（µL）预配的消化液加入一个新的、已标记的细胞培养皿中，并称重。将所有肌肉组织块转移至该培养皿中，然后测定其重量。两次测量值之差即为肌肉组织的干重，不得超过一克。使用手术剪将整块肌肉组织剪成小块。将组织悬液在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，每隔20分钟用1毫升胰岛素注射器轻轻混匀约5分钟。孵育结束后，将悬液转移至置于已标记的50毫升试管上的70微米尼龙筛网上，收集滤过液。用 8 毫升 DMEM 清洗细胞滤筛，并收集滤过液。如果组织块堵塞滤筛，则重悬解离后的溶液。弃去细胞滤筛，将悬液在 20 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。小心移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 氯化铵钾裂解缓冲液中，以裂解红细胞。室温孵育 30 秒。然后加入 9 mL 含 10% FCS 的 DMEM 以终止反应。将细胞悬液转移至15毫升离心管中。然后使用Neubauer细胞计数板确定细胞数量。为开始耗竭CD45阳性细胞，将悬液在4摄氏度下以300 × g离心10分钟。完全去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 90 微升 MCS 缓冲液中。加入 10 微升 CD45 磁珠，混匀悬浮液。在 4 至 8 摄氏度的冰箱中孵育 15 分钟。此后，加入 1 毫升 MCS 缓冲液。在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。完全移除上清液，并将细胞重悬于 500 微升 MCS 缓冲液中。将一个大型磁性柱置于分离器的磁场中。用三毫升MCS缓冲液冲洗柱的储液器。然后，在柱下方放置一个15毫升的锥形管，用于收集流穿液。将整个细胞悬液加入柱中，并让其完全流过。每次加入三毫升MCS缓冲液至储液槽中，洗涤柱三次，每次洗涤步骤需等待储液槽完全排空后再进行下一步洗涤。收集流穿柱子的未标记细胞，用于后续分离步骤。为开始富集CD31阳性细胞，使用血细胞计数板（Neubauer细胞计数室）确定细胞数量。随后，在4摄氏度条件下，以300 × g离心未标记的细胞10分钟。彻底去除上清液，并将沉淀重悬于90 µL的MCS缓冲液中。加入10微升CD31微珠，混匀整个悬液。在4至8摄氏度的冰箱中孵育15分钟。随后加入1毫升MCS缓冲液，在4摄氏度下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于500微升MCS缓冲液中。将中等强度磁力柱置于分离器的磁场中。用500微升MCS缓冲液冲洗磁力柱。接下来，将一个15毫升的锥形管置于柱下方以收集流穿液。将整个细胞悬液加到柱上，并让其完全流穿。每次加入500微升MCS缓冲液至储液槽中，用此方法洗涤柱三次，每次洗涤步骤前需等待储液槽完全排空后再进行下一步。流经色谱柱的未标记细胞代表 CD45 阴性、CD31 阴性组分。请保存这些细胞以用于后续质量控制。随后，将色谱柱从分离器上取下，并置于合适的收集管上。用移液器将两毫升 MCS 缓冲液加入柱中。立即推动柱塞，冲洗磁标记的细胞。该 CD45 阴性、CD31 阳性组分即为富集的原代小鼠 ECs。将细胞悬液在350 × g、20 °C条件下离心5分钟。完全去除上清液，并将细胞重悬于1 mL内皮细胞培养基中。将细胞转移至含1 mL内皮细胞培养基的包被六孔培养板的一个孔中。培养时，将细胞置于无菌培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，并确保每两到三天更换一次培养基。当细胞融合度达到80%至90%时，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）连续洗涤两次，每次洗涤每个含细胞的孔。随后，向每个孔中加入800微升胰蛋白酶EDTA溶液，在无菌培养箱中37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三至五分钟。此后，加入 1,200 微升含有至少 10% FCS 的 DMEM 以终止酶活性。在 20 摄氏度下以 350 × g 离心 5 分钟。然后，按照先前所述方法富集 CD31 细胞以提高纯度。使用配备 20% 放大倍数和 0.35 数值孔径物镜的明场或标准相差显微镜观察细胞融合度。本研究中分离了小鼠骨骼肌来源的微血管内皮细胞。分离后一天，原代小鼠 MMECs 与其他残留细胞形成聚集体，并贴附于培养皿底部。从第7天开始，可以观察到扁平且细长的细胞，但仍可见其他细胞（主要是球形细胞）的污染。因此，需要再进行一轮通过MCS对CD31阳性细胞的筛选。此后，原代小鼠MMEC增殖至约80%至90%的密度。当细胞汇合时，通常会形成一层纵向排列、互不重叠的单层细胞。由于接触抑制，细胞在汇合时停止增殖。分离后立即进行流式细胞术质量控制检测，显示细胞活力和纯度均约为70%。经磁珠分选（MCS）再次进行CD31阳性筛选后培养的细胞，其纯度和活力均达到满意水平，均可高达95%。随后通过定量PCR在mRNA水平上检测所获得细胞的肌肉卫星细胞标志物基因——成对盒蛋白7和M-钙黏蛋白的基因表达。结果表明，仅CD45阴性、CD31阴性细胞群体以及分化后的原代小鼠肌肉细胞表达成对盒蛋白7和M-钙黏蛋白，而CD45阴性、CD31阳性细胞以及原代小鼠脑微血管内皮细胞（MMECs）则不表达这些标志物。在第二次CD31磁珠分选（MCS）步骤后，采用qPCR检测融合状态的原代小鼠MMECs中紧密连接蛋白的表达情况。原代小鼠MMEC表现出高水平的claudin-5、occludin和zonula occludens-1，而pmMC仅显示zonula occludens-1的低水平表达。该技术可在五到六小时内完成。按照本方案操作后，可进一步开展其他方法，如迁移实验或低剪切应力实验，以回答更多科学问题。观看本视频后，您应能够通过机械法和酶解法解离以及磁珠分选技术，从骨骼肌中分离出原代微血管内皮细胞。

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原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞的分离

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我们介绍一种用于在原生、完整的微血管内皮中观察和操控钙信号的方法。从供应骨骼肌的小阻力动脉中 freshly...

从小鼠阻力动脉中分离微血管内皮管

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

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分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

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本实验方案旨在演示从小鼠冠状循环中分离和培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）的技术。一旦完成VSMCs的分离，即可将其用于多种标准的细胞培养技术。...

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从小鼠骨骼肌中分离I型和II型周细胞

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分离原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞

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