利用氨基酸水平的遗传变异信噪比分析确定变异致病可能性

氨基酸水平的信噪比分析可用来评估某个遗传变异与疾病状态相关联的可能性，或判断其是否属于人群中的自然遗传变异。该技术利用了两大类遗传资源：一是文献中或公共领域内已知与疾病相关的突变；二是基于人群的外显子组和基因组研究，用于识别稀有遗传变异。为确定特定的目标基因及剪接异构体，请打开 Ensembl 主页，然后从下拉菜单中选择物种。

输入目标基因的缩写，然后点击“go”。从转录本表格中选择与目标基因及目标转录本对应的链接，以及目标 ID。请记录转录本表格参考序列列中与该转录本特异的 RNA 转录本及其蛋白质产物的 RNA 转录本识别编号，以供后续参考。

选择与RNA转录本编号对应的蛋白质产物链接，以打开国家生物技术信息中心（NCBI蛋白质数据库）的新网页，向下滚动至“来源”（Origin）部分，获取目标基因转录本的初级蛋白质序列。然后向上滚动至“特征”（Features）部分，获取蛋白质特征列表。为了计算每个具有对照变异的氨基酸位点的次要等位基因频率，请打开一个具备绘图功能的电子表格，创建一列包含所有实验变异位点位置的数据。

移除变异文本，仅保留变异位点，并按升序排列变异位点，以识别哪些位点存在多个相关变异。通过合并与特定位置相关的每个变异的次要等位基因频率，计算该位置所有次要等位基因频率的总和，并为每个带有实验性变异的氨基酸位点计算次要等位基因频率。接下来，创建一列包含实验性变异的氨基酸位点，针对所有变异位点，计算与该位点相关联的所有变异的次要等位基因频率。

为了创建实验组和对照组变异位点的次要等位基因频率的滑动平均值，需建立一列包含目标基因中所有氨基酸位置的数据，并为对照组和实验组数据集中均无变异的各个位点添加一个次要等位基因频率值为零。为了分别为实验组和对照组的流行率列创建滑动平均值，需建立一列用于表示对照组和实验组数据集次要等位基因频率的滑动平均值，在该滑动平均值列中，填入每个位点上下游各五个变异位点（N端和C端）对应的次要等位基因频率的平均值。为计算队列最低频率，将所检测到的最低次要等位基因频率除以二，并将该数值填入所有对照组次要等位基因频率为零的单元格中。

这可以避免在计算信噪比时出现除以零的情况。要计算氨基酸水平的信噪比，需将每个氨基酸位置的实验滚动平均值除以相应的对照滚动平均值，并将该比值对氨基酸位置作图。为了确定功能结构域和特征的保守氨基酸位置，或目标蛋白的翻译后修饰区域，需先确定与蛋白结构域和特征相关的氨基酸位置，然后打开 NCBI 网页。

在搜索框中输入目标蛋白的RNA转录本所编码的蛋白质产物，并在“Features”（特征）部分识别已知的蛋白质结构域和特征。记录结构域的名称和类型以及对应的氨基酸位置，并点击相应特征的链接，以在目标蛋白的一级序列上可视化该区域。在信噪比列旁边创建一列，以便参考氨基酸位置列，并确定每个结构域及特征在N端或C端对应的细胞位置。

然后，在每个单元格中填入数字1，创建一个以y轴为这些边界、x轴为氨基酸位置的图表，并将该图表与信噪比图表叠加。为了叠加信噪比和蛋白质结构域拓扑图以定位各个变异位点，需在结构域特征列旁新增一列，使该列的每一行对应相应的氨基酸位置，并在新增列中对应每个特定变异位点的单元格内填入数字1。接着，以该列作为y轴、氨基酸位置作为x轴绘制图表，并将此图表与信噪比及蛋白质结构域拓扑图进行叠加。

此处展示了一个钾离子电压门控通道Q亚家族成员1基因的氨基酸水平信噪比分析的代表性结果。图中显示了在对照队列中发现的罕见变异、实验中偶然发现的全外显子组测序结果，以及被认为可能与疾病相关的长QT综合征病例相关变异。同时展示了将全外显子组测序和长QT综合征队列的变异频率相对于对照队列的变异频率进行标准化后的信噪比分析结果。

在本实验中，与长QT综合征相关的变异在对应通道孔区、选择性滤过区以及钾电压门控通道E亚家族成员1结合区的区域表现出较高的信噪比。相比之下，在全外显子组测序队列中偶然发现的变异并未明显表现出特定的高信噪比区域，提示这些变异反映了背景遗传变异。该方法可用于评估临床基因检测中发现的临床意义未明变异的诊断权重。