Name: 3D 扫描技术在 3D 新颖嵌入重叠协议中桥接微电路和宏观大脑图像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习利用三维扫描技术将微尺度神经分布嵌入宏观磁共振脑图像的新型神经解剖学方法。该方案通过免疫组织化学和多电极阵列实现高精度结构功能映射，为疾病相关对比模式识别提供可靠技术框架。

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M.S. 感谢京都大学研究生院医学研究科及医学部医疗信息工程课程全体教职人员的支持，并感谢高桑哲哉教授、泽本信克教授和多丽丝·扎基安（Doris Zakian）提出的有益意见。本研究得到了日本文部科学省（MEXT）“挑战性探索研究资助项目”以及“优秀青年研究人员领先计划”（LEADER）对 M.S. 的资助。本研究中的磁共振成像实验在日本京都大学研究生院医学研究科医学研究支援中心的小动物磁共振成像部门完成。

本文所描述的所有实验程序均已获得京都大学动物护理委员会的批准。
1. 动物（第1天）
<ol>
	<li>准备雌性 C57BL/6J 小鼠（n = 6，年龄为 3−5 周）。 
	注意：本方案适用于所有啮齿类动物物种。</li>
</ol>
2. MRI 设置（第1天）
<ol>
	<li>将小鼠放入置于加热垫上的丙烯酸麻醉箱中，使用加热垫控制器将温度调节至 37 °C。</li>
	<li>通过麻醉系统以 1.4 L/min 的气流速度向箱内输送含 2% 异氟烷的空气，对小鼠进行麻醉。该麻醉系统由异氟烷挥发罐、空气流量计和空气压缩机组成。</li>
	<li>麻醉诱导后，将小鼠以俯卧位放置于磁共振成像（MRI）兼容的托架中。使用镊子夹捏小鼠脚趾，观察其是否无痛觉反应，以判断麻醉深度是否足够。</li>
	<li>使用托架配备的门齿杆和面罩固定小鼠头部，并通过面罩以 1.4 L/min 的流速持续供给含 1%−1.5% 异氟烷的空气以维持麻醉状态。</li>
	<li>将热敏电阻温度探头插入小鼠直肠，并在其背部放置压力敏感式呼吸传感器。</li>
	<li>将托架移入磁共振成像（MRI）磁体孔内。调整异氟烷浓度至约 1%−1.5%，以确保麻醉深度稳定且可重复。在整个 MRI 实验过程中，使用专有软件的生理参数监测系统（材料表）监测小鼠体温是否维持在 33−35 °C 之间，呼吸频率是否保持在 0.5−1.3 Hz 范围内（材料表）。</li>
	<li>根据测得的直肠温度，通过控制监测系统所配备加热装置向磁体孔内输送的暖空气温度，调节小鼠体温。</li>
</ol>
3. MRI 数据采集（第1天）
<ol>
	<li>高分辨率3D T2加权MRI扫描的准备工作
	<ol>
		<li>获取三个正交平面（轴向、冠状和矢状）的磁共振（MR）图像，以检查小鼠的位置。</li>
		<li>参考这些图像，通过移动托架调整小鼠的位置，使小鼠脑的中心位于共振器的中心，同时在轴向上也位于梯度线圈的中心。</li>
		<li>调节MRI系统，包括调谐共振器、调整静态磁场均匀性（匀场）和基本频率，并校准射频（RF）功率。</li>
		<li>获取冠状位和矢状位的低分辨率2D多层T2加权（T2W）图像。根据这些图像确定高分辨率3D T2W MRI扫描的视野范围（FOV）。</li>
		<li>使用FASTMAP自动匀场算法进行局部匀场。在FASTMAP协议中，选择一个覆盖整个脑部的矩形区域。完成局部匀场后，通过点分辨波谱法（PRESS）获取局部1H波谱，确认脑区内的B0场不均匀性。</li>
		<li>获取低分辨率3D T2W图像，以确认高分辨率3D T2W MRI的扫描设置是否合适，检查FOV位置是否恰当、是否存在卷褶（混叠）伪影以及脂肪信号是否得到有效抑制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像脉冲序列
	<ol>
		<li>完成上述准备工作后，采用快速采集弛豫增强（RARE）序列获取小鼠全脑的高分辨率3D T2加权图像。 
		注意： 本文中的MRI实验是在一台7 T、210 mm水平孔径的临床前成像系统上进行的，该系统配备梯度强度为440 mT/m、上升时间为100 μs的梯度系统。射频激发和信号接收采用内径为35 mm的四通道容积共振器。MRI数据通过专用操作软件采集。本研究中所用3D RARE脉冲序列的采集参数总结于表1中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 实验溶液的制备（第2天）
<ol>
	<li>配制500 mL冰冻切割溶液（含2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、7 mM MgCl2、15 mM葡萄糖、25 mM NaHCO3、0.5 mM CaCl2、11.6 mM抗坏血酸钠、3.1 mM丙酮酸钠和100 mM氯化胆碱），用95% O2和5% CO2混合气体饱和。调节pH至7.3–7.4。</li>
	<li>配制1 L人工脑脊液（ACSF；含127 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgCl2、15 mM葡萄糖、25 mM NaHCO3和2 mM CaCl2），用95% O2和5% CO2混合气体饱和。调节pH至7.3–7.4。</li>
</ol>
5. 仪器设备的准备（第2天）
<ol>
	<li>准备一个6.6 cm2 方形，0.5 cm厚的磁铁“环”，先在环上贴黑色胶带，再贴外科胶带（图1c-2）。请注意，该材料称为脑组织块基质（BBB），需置于冰块上保持低温。 
	注意： 随后，胶带将连同脑组织块一起固定在振动切片机的切片站上。方形环作为BBB的底部基座，具有两个作用：一是便于脑组织块从3D扫描站平稳转移至振动切片机，二是在扫描步骤中准确定量脑组织块的高度。</li>
	<li>使用自动转台设置 BBB。打开扫描仪和转台。启动图像处理软件。</li>
	<li>在进行所有实验之前，需对结构光投影式台式三维扫描仪所连接的相机和转台进行校准。
	<ol>
		<li>打开中央投影仪、两个摄像头和转盘，然后启动软件。在软件中点击 光学装置 选择图像区域为 100 x 80，网格数量为 100 x 100。随后，相机标定将按照以下四个步骤开始。
		<ol>
			<li>投影仪设置时，将校准表平放在桌面上，并将校准板放置在校准表上，使测量区域的固定点对准表的中心位置，方向朝前。调整投影仪与校准板之间的距离至约200 mm。松开固定两个旋钮的螺丝，旋转旋钮以调节两台相机的光敏度和焦距。然后，点击 箭头 进入下一步。</li>
			<li>为调整相机方向，先松开固定两台相机的螺丝，移动相机的位置和旋转角度，使其与校准板上的中心线、垂直线以及投影仪投射出的黄色十字线重合。固定相机后，单击 箭头 再次重复。然后，屏幕将变暗。</li>
			<li>松开旋钮的固定螺丝后，通过提高相机的感光度并重新调节焦距来对焦。然后，单击 箭头 进入下一步。</li>
			<li>对于F值和（相机的）曝光程度，再次调整光敏感度，使其略低于红色区域消失时的水平。然后，单击 箭头 再次点击 校准开始，并选择 是 如果被问及 你完成光学设置了吗？</li>
		</ol>
		</li>
		<li>点击 初始化校准，并检查像素值是否已归一化至0–255之间。然后，单击 继续.</li>
		<li>按照建议的位置，记录扫描仪与标定板之间九个不同相对角度的图像，在确认标定过程完成后，最后点击 校准更新.</li>
		<li>将校准板更换为转台，然后单击 转盘校准. 
		注意： 现在，所有校准均已完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 脑表面扫描、切片与多电极阵列记录（第2天）
<ol>
	<li>用1%−1.5%异氟烷麻醉小鼠，随后将小鼠断头。使用手术刀切开皮肤，暴露颅骨。</li>
	<li>用手术刀沿矢状缝切开麻醉后小鼠的头皮，再用手术剪从人字缝点向冠状缝前方一点呈对角方向剪开颅骨。然后用弯头镊子轻轻将颅骨从脑组织上剥离。</li>
	<li>用刮铲抬起脑组织并转移至盛有冰冻切割液（按步骤4.1配制）的培养皿（100 mm × 20 mm）中。通过外部气瓶通入含95% O2 和5% CO2 的气体，调节泵的转速至约4.0 rpm，使冰冻切割液中产生细小气泡（图1a）。</li>
	<li>1–2分钟后，将脑组织置于表面覆盖有筛面粉筛的超细纤维布上，轻轻用超细纤维布擦拭脑表面的液体（图1b）。</li>
	<li>将脑组织背侧朝上放置在BBB的样品台上，并将BBB置于自动转台中央。</li>
	<li>在3D扫描过程中关闭室内光源，于转台上进行3D扫描。为测试3D扫描是否正常工作，选择拍摄角度间隔为22.5°，起始角度为0°，终止角度为360°，点击3D扫描（图1c-1）。</li>
	<li>将脑组织移至培养皿中，在切割液中鼓泡约10秒。</li>
	<li>用手术刀在冠状面中线处将脑组织切成两部分，并用手术刮铲轻柔地将两块脑组织移至平整表面。</li>
	<li>使用瞬干胶将脑组织块固定在BBB上，并在1–2分钟内再次用超细纤维布轻轻仔细擦拭脑表面液体。随后再次进行3D扫描（Figure 1c-2）。</li>
	<li>将覆盖BBB中心的黑色胶带粘附至振动切片机切片台的中心位置（图1d）。</li>
	<li>向切片台中加入切割液，并将切片台安装至振动切片机上。调节切片速度和振幅。从两块脑组织上各切出2–5片冠状切片（厚度为300 µm）。尽可能保持切片台内溶液持续鼓泡（图1e）。</li>
	<li>将刀片安装至振动切片机的刀片夹持器上，并将系统参数优化为：切片速度12.7 mm/min，频率87–88 Hz，摆动幅度0.8–1.0 mm。当需要精细切片时，将速度降低至2–3级。</li>
	<li>在切片过程中，以包含前后坐标、半球及其他条件的格式记录每一片脑切片的切片坐标（图2c）。</li>
	<li>用粗塑料移液管将脑切片轻柔转移至盛有预热（约34 °C）人工脑脊液（ACSF）的烧杯中，并在约34 °C条件下孵育约1小时。在此期间，对切片台上剩余的脑组织块进行3D扫描（图1c-2）。</li>
	<li>将MEA芯片安装至记录装置上。用两根导管将芯片连接至蠕动泵。其中一根导管用于将相同的ACSF导入MEA芯片，另一根导管用于将ACSF从MEA芯片导出。</li>
	<li>将连接在两根导管末端的两根针头（0.60 mm × 19 mm）固定在MEA芯片壁的顶部，调整其位置，使针头末端沿MEA芯片内壁放置。将ACSF流速设定为4.1 rpm。</li>
	<li>1小时后，用粗塑料移液管将一片脑切片移至芯片上，并用软毛刷调整其位置。随后开始记录神经元活动（图2-d）。</li>
</ol>
7. 免疫组织化学染色（第3天和第4天）
<ol>
	<li>MEA 记录完成后，将脑片转移至装有含磷酸盐缓冲液（PBS）的 4% 多聚甲醛（PFA）的 1.5 mL 离心管中。于 4 °C 下孵育过夜。随后弃去 4% PFA 溶液，用 PBS 洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟，共 15 分钟。 
	注意：如有需要，可将脑片包埋于 20% 明胶/PBS 中，并使用振动切片机重新切片，使其厚度小于 50 µm。</li>
	<li>配制抗原修复液（10 mM 柠檬酸钠，pH 6.0）。弃去最后一次 PBS 洗涤液，加入抗原修复液。</li>
	<li>在电热保温壶中将水煮沸，将装有脑片的离心管置于其中，在约 95–98 °C 下孵育 20 分钟，随后自然冷却。</li>
	<li>配制 50 mM Tris 缓冲盐水，并加入 1% 亚硫酸钠（1% Na bisulfite-Tris 溶液），调节 pH 至 7.5。然后在室温（约 20–25 °C）下用 1% Na bisulfite-Tris 溶液洗涤脑片 5 分钟。</li>
	<li>在 1% Na bisulfite-Tris 溶液中加入 4% 正常山羊血清和 0.5% 辛基酚聚氧乙烯醚，配制封闭液。</li>
	<li>弃去含脑片的离心管中的 1% Na bisulfite-Tris 溶液，加入封闭液，在室温下孵育 2 小时。</li>
	<li>在 1% Na bisulfite-Tris 溶液中加入 1% 正常山羊血清和 0.5% Triton X-100，并稀释一抗，配制一抗溶液。使用以下一抗稀释比例：小鼠抗 GAD67 抗体 1:800，兔抗 NeuN 抗体 1:500。</li>
	<li>弃去含脑片的离心管中的 1% Na bisulfite-Tris 溶液，加入一抗溶液，于 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>配制 50 mM Tris 缓冲盐水，并加入 8.5 g/L NaCl（Tris-NaCl 溶液），调节 pH 至 7.5。然后用 Tris-NaCl 溶液在室温（约 20–25 °C）下洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟，共 15 分钟。</li>
	<li>在 Tris-NaCl 溶液中加入 3% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100，并稀释二抗，配制二抗溶液。使用以下二抗稀释比例：山羊抗小鼠抗体 1:500，山羊抗兔抗体 1:500。</li>
	<li>弃去含脑片的离心管中的 Tris-NaCl 溶液，加入二抗溶液，在室温下孵育 2 小时。随后用 Tris-NaCl 溶液洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟，共 15 分钟。</li>
	<li>用小刷子将脑片置于载玻片上，滴加封片剂并加盖盖玻片。使用共聚焦显微镜观察切片，并采集脑片表面的图像（图 2e）。</li>
</ol>
8. 提取皮层体积的 MRI 数据处理
<ol>
	<li>安装免费软件 FSL（https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation）。准备第 3 节中获取的 MRI 图像。</li>
	<li>使用 fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ 命令更改图像格式。使用 fslcreatehd 命令将脑图像扩展至人类大脑大小，并在必要时使用 fslorient 命令并配合选项 -setqformcode 1 调整方向。之后，使用 fslchfiletype NIFTI_GZ 恢复原始文件格式。具体命令如下： 
	fslchfiletype NFTI_PAIR [输入图像].nii.gz 
	fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [输入图像].hdr.gz 
	fslorient –setqformmcode 1 [输入图像].hdr.gz 
	fslchfiletype NIFTI_GZ [输入图像]</li>
	<li>输入 fsl 以启动 FSL 软件。通过图形用户界面（GUI）使用 bet 命令提取大脑图像，但切勿过度剥离。然后仔细调节 Fractional intensity thresholds, ... 和 Coordinates of centre of initial brain surface sphere 参数。最佳值因数据而异。</li>
	<li>使用与步骤 8.2 相同的流程，将脑图像重新缩放至原始小鼠脑大小。具体命令如下： 
	fslchfiletype NFTI_PAIR [输入图像].nii.gz 
	fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [输入图像].hdr.gz 
	fslorient –setqformmcode 1 [输入图像].hdr.gz 
	fslchfiletype NIFTI_GZ [输入图像]</li>
	<li>使用 flirt 命令对所有脑图像进行配准，并利用 fslmaths 命令的 -add 选项和 -div 选项生成平均脑图像。 
	fslmaths [脑图像 1] –add … –add [脑图像 N] –div N [平均图像名称] –odt float</li>
	<li>使用 fslmaths 命令的 -thr 选项使平均脑图像更清晰。然后根据具体情况选择合适的阈值。 
	fslmaths [平均图像名称] –thr [阈值，例如 5000] [经阈值处理的平均图像]</li>
	<li>最后，再次使用 flirt 命令将平均脑图像重映射至个体坐标系中。然后，准备出较为干净的皮层提取结果（图 2a）。 
	注意：由于 FSL 软件在剥离包括嗅球和小脑在内的所有脑区方面存在固有限制，因此从 MRI 体数据重建的脑表面中，嗅球和小脑部分将无法达到理想效果。</li>
</ol>
9. MRI 图像处理以提取皮层表面
<ol>
	<li>下载另一款免费软件 3D Slicer（https://download.slicer.org/）。</li>
	<li>使用 3D Slicer 中的 Volume Rendering 和 Editor 模块，打开根据第 8 节生成的提取脑组织的 MR 图像（点击 File，然后选择 Add data）。</li>
	<li>将模式从 Editor 切换至 Volume rendering，然后点击目标按钮，使脑图像居中显示在屏幕中央。</li>
	<li>选择 MR-T2-brain 模式，并通过移动 Shift 滑块调整阈值。随后，从 Volume rendering 返回至 Editor，并点击 Threshold effect 按钮。</li>
	<li>应用标签 41. Cerebral cortex，并将脑表面数据保存为 .stl 文件。然后，将文件格式从 .vtk 转换为 .stl，并勾选表单后保存文件。</li>
</ol>
10. 三维扫描数据的预处理
<ol>
	<li>通过点击“对齐”选项中的“全局配准”，对一次扫描序列中从8个或16个不同角度获取的8幅或16幅图像进行自动共配准，以校正图像间的微小错位，并将其整合。从不同角度重复扫描，以获得全脑表面图像图2b).
	<ol>
		<li>如果从不同角度扫描的图像未能成功整合，请点击 手动校准 并选择一对 固定图像 和一个 移动图像.</li>
		<li>点击 开始 通过在不同图像中选择三个或四个共同点，开始手动对齐图像。然后，单击 好的优化算法为迭代最近点（ICP）算法10不包含非线性形变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过选择所有图像并点击，将所有已配准的图像（即点数据集）制作成一个网格 网格生成 按钮，然后选择该选项 小型艺术物件 以获得最高分辨率的网格。然后，将图像保存为二进制格式的 .stl 文件，或 ASCII 格式。</li>
</ol>
11. MRI 表面与 3D 扫描表面的共同配准
<ol>
	<li>使用表面处理软件打开 MRI 表面，并将其与 3D 扫描表面进行合并。然后，采用与步骤 10.1.1 和 10.1.2 中所述相同的方法进行手动配准。随后，再次保存这些共配准的表面图像（图 2a,b）。
	<ol>
		<li>如有必要，对各个表面数据进行清理，例如，去除脑区周围的小噪声，特别是在处理 MRI 数据时；并填补存在的孔洞，尤其是在处理 3D 扫描数据时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，使用数据分析软件（例如 MATLAB）打开表面数据，并计算和评估两个表面之间最小距离的直方图。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种名为3D-NEO的新方案，通过更精确地叠加两个脑表面，实现宏观与微观空间尺度之间的衔接。最初，在创建该方案时存在两个挑战，这些挑战曾阻碍对两个脑表面图像进行精确叠加以及从活体生物中记录健康的神经元活动。首先，在从颅骨中取出脑组织后，必须在不损伤脑组织的前提下，有效清除其周围残留的切片液（方案第6.2步）。其次，由于干燥和时间延迟这两个条件可能对活体组织产生不利影响，因此必须在10至15分钟内完成从脑组织提取到切片制备的全部扫描步骤，以维持神经元的活性。
利用本方案成功记录脑活动的能力，现已实现了不仅对结构组织，而且对全脑图谱上功能活动的协调。该方案的另一个优点是，由于已制备了血脑屏障（BBB），扫描仪与振动切片机基座之间的校准变得更加顺畅。
如代表性结果所述，两个表面之间距离的直方图显示峰值出现在约 50 μm 处。尽管我们进行了重叠处理，这看似是从宏观视角进行的；但如果从微观视角来解释该结果，50 μm 是神经元分布中具有可比性的空间尺度，因为皮层神经元对之间的连接概率在约 100 μm 范围内即显著衰减<su...

在各种物理和生物组织中，普遍存在非均匀的多尺度结构1,2。大脑也是一种高度非均匀且具有多尺度特征的网络结构3,4。多种认知功能编码于此类网络结构之中，并以亚毫秒级的时间分辨率记录神经元群体电脉冲模式的动态变化。历史上， Santiago Ramón y Cajal 超过150年前使用的染色技术首次对神经元之间的复杂网络进行了详细的结构观察5。为了观测活跃神经元的群体行为，研究人员已开发出多种记录技术6,7,8，近年来这些技术的重大进展使我们能够同时记录大量神经元的电活动。此外，基于这些功能活动，科学家已成功重建了大量神经元之间因果相互作用的网络，并将这些复杂相互作用的拓扑结构称为“微连接组（microconnectome）”9。从宏观层面观察大脑时，由于许多脑区通过多束纤维相互连接，整个大脑也可被视为一种网络结构。然而，在当前技术水平下，将微连接组嵌入到全脑图谱中仍存在明显局限，因此这种嵌入方案显得尤为重要。但该嵌入协议的建立仍面临诸多挑战。例如，若要观察完全隔离脑区中活体局部神经环路的活动，则需要制备脑切片以进行体外记录。此外，脑切片记录仍是体外研究的重要选择，至少出于两个原因：第一，目前仍难以以高时间分辨率（&#60;1 ms）同时观测深度超过约1.5 mm脑区中大量活体单个神经元的活动；第二，当我们希望了解局部神经环路的内部结构时，必须阻断来自外部脑区的所有输入，以消除混杂因素。为了确定所制备脑切片的方向与位置，还需利用坐标系统整合这些脑切片的空间位置信息。然而，目前系统且可靠地有序制备脑切片的方法仍较为有限10,11。本文介绍了一种新的共配准协议，该协议采用3D扫描技术服务于神经科学研究，旨在提供一种整合性方案。该协议可协调微观与宏观尺度，将多电极阵列（MEA）的微观数据12,13以及染色数据，通过提取脑组织及无创记录脑组织的3D扫描表面，嵌入到宏观MRI空间中。令人惊讶的是，该方法在直方图中的模式值仅表现出约50 μm的距离误差。结果表明，在六只小鼠中，MRI表面与扫描所得3D表面之间最小距离的模式值均接近50 µm，这一数值在评估个体间共性时是合适的。典型的切片厚度约为300 µm，并记录到神经元的脉冲活动。

<table><tbody><tr><td>空气压缩机</td><td>Kimura Medical</td><td>KA-100</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>一体式荧光显微镜</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>麻醉箱</td><td>Bio Research Center</td><td>RIC-01</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>ACOMA Medical Industry</td><td>NS-5000A</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>抗GAD67，克隆1G10.2</td><td>Merk Millipore</td><td>MAB5406</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>nacalai tesque</td><td>06729-55</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>氯化胆碱</td><td>nacalai tesque</td><td>08809-45</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>弯头钝头镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Kai</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的D-PBS(-)液体（10倍浓缩）</td><td>nacalai tesque</td><td></td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>明胶</td><td>nacalai tesque</td><td>16605-42</td><td>重切片</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555</td><td>Invitrogen</td><td>A32732</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Bio Research Center</td><td>HM-10</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>加热垫控制器</td><td>Bio Research Center</td><td>BWT-100A</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>加热系统</td><td>SA Instruments</td><td>MR-compatible Small Animal Heating System</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>AbbVie</td><td></td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>ACOMA Medical Industry</td><td>MKIIIai</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>线性切片机</td><td>DOSAKA</td><td>Neo Linear Slicer MT</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-抗坏血酸钠盐</td><td>Wako</td><td>196-01252</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>MaxOne 单孔微电极阵列</td><td>MaxWell Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属刮刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>监测系统</td><td>SA Instruments</td><td>Model 1025</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>监测软件</td><td>SA Instruments</td><td>PC-SAM V.5.12</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>磁共振兼容托架</td><td>Bruker BioSpin</td><td>T12812</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>磁共振线圈</td><td>Bruker BioSpin</td><td>T9988</td><td>用于磁共振成像</td></tr><tr><td>磁共振操作软件</td><td>Bruker BioSpin</td><td>ParaVision 5.1</td><td>用于磁共振成像</td></tr><tr><td>Neo LinearSlicer MT</td><td>D.S.K.</td><td>NLS-MT</td><td></td></tr><tr><td>NeuN (D4G40) XP 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>24307</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Wako</td><td>143-06561</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>聚乙二醇单对异辛基苯基醚</td><td>nacalai tesque</td><td>12967-45</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>压力敏感式呼吸传感器</td><td>SA Instruments</td><td>RS-301</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>临床前磁共振扫描仪</td><td>Bruker BioSpin</td><td>BioSpec 70/20 USR</td><td>用于磁共振成像</td></tr><tr><td>丙酮酸钠盐</td><td>nacalai tesque</td><td>29806-54</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>SCAN in a BOX</td><td>Open Technologies srl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>筛瓶</td><td>TIGERCROWN</td><td>81</td><td>用于3D扫描</td></tr><tr><td>SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Wako</td><td>197-09705</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>亚硫酸氢钠</td><td>nacalai tesque</td><td>31220-15</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>热敏电阻温度探头</td><td>SA Instruments</td><td>RTP-101-B, PLTPC-300</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>门齿固定杆</td><td>Bruker BioSpin</td><td>T10146</td><td>磁共振成像动物准备</td></tr><tr><td>带翼静脉穿刺针</td><td>TERUMO</td><td>SV-23CLK</td><td>用于灌注</td></tr><tr><td>1 mol/l Tris-HCl 缓冲液</td><td>nacalai tesque</td><td>35436-01</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>1 mol/l 盐酸</td><td>nacalai tesque</td><td>37314-15</td><td>用于溶液pH调节</td></tr><tr><td>16%甲醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用于免疫染色</td></tr></tbody></table>

三维扫描技术通过新型三维嵌入重叠协议连接微电路与宏观脑成像

3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

人脑作为一个多尺度系统，既具有沿粗大的白质纤维束全局传播的宏观电信号，也具有沿轴突和树突传导的微观神经元放电活动。这两个尺度共同补充了人类认知与行为功能的不同方面。在宏观层面，磁共振成像（MRI）是目前标准的成像技术，其最小空间分辨率（即体素大小）为 0.1–1 mm3。而在微观层面，以往的生理学研究已注意到此类体素内部神经元结构的非均匀性。本研究开发了一种强有力的方法，通过将生物科学研究与三维扫描技术的最新进展相结合，精确地将微观数据嵌入到宏观图谱中。由于三维扫描技术迄今为止主要应用于工程与工业设计领域，本研究首次将其重新用于在保持活体脑细胞自然放电特性的同时，将微连接组嵌入全脑结构中。为实现这一目标，首先，我们建立了一套扫描方案，以从活体生物体中获取精确的三维图像——这类生物体因其湿润且反光的表面而固有地难以成像。其次，我们优化了扫描速度，以防止活体脑组织退化，这是维持组织良好状态并从脑组织中活跃神经元记录更自然神经放电的关键因素。分别来自两种不同成像模块（即 MRI 与三维扫描仪表面图像）独立提取的两个皮层表面图像，其距离误差的直方图众数仅为 50 μm。该精度在尺度上可与细胞间距离的微观分辨率相媲美，并且在不同个体小鼠之间具有良好的稳定性。这一新方案——三维新型嵌入重叠（3D-NEO）协议——通过该整合性流程弥合了宏观与微观尺度之间的鸿沟，加速了对全面连接结构（即微连接组）的科学研究进展。

我们评估了通过剥离MRI体数据生成的皮层表面与从离体大脑3D扫描获得的表面之间的距离。距离直方图的众数值仅为55 μm（图3a）。此外，当从距离为零的点开始对直方图进行累积时，累积值在约300 μm处达到总样本数的90%（图3b）。两个表面间距离的最终直方图显示出一个典型的峰值，位于约50 μm附近。若从宏观角度解释该数值，有趣的是，该精度（众数值约50 μm）与MRI体素尺寸（即100 µm）所预期的几何极限相吻合（图3a）。这一点间接表明，MRI与3D扫描之间的重叠算法（ICP）工作效果极佳，且MRI与3D扫描的噪声水平均被有效抑制至较低水平（图2a,b）14。
<p class="jove_content" fo:keep-together....

本文介绍了一种利用3D扫描技术连接两个空间尺度的实验方案：通过MRI成像获取的全脑解剖结构的宏观空间尺度（&#62;100 μm），以及利用免疫组织化学染色、多电极阵列系统及其他方法获得的神经元分布的微观空间尺度（约10 μm）。

人脑作为一个多尺度系统，既具有沿粗大的白质纤维束全局传播的宏观电活动信号，也具有……

本方案首次将3D扫描技术引入解剖学，特别是神经解剖学研究领域，并实现了高精度的重叠效果。三维神经嵌入重叠法（即3D神经方案）可将微米级无菌套管嵌入宏观脑图像中，从而无缝连接这些不同的空间尺度。我们还需将3D神经方案应用于人类磁共振成像（MRI）及死后脑组织。重叠成像使我们能够识别与疾病相关的已知 MRI 对比模式。三维扫描系统对提取的生物体周围的水分非常敏感，因此必须非常仔细地擦除水分。此外，该操作必须尽快完成。从文本方案中所述的小鼠准备、MRI采集及设备准备开始此操作。在第二天，使用手术剪刀沿已处死小鼠的矢状缝切开头皮。然后从人字缝点开始，使用手术剪刀向位于前囟前方不远处的点沿对角方向剪开颅骨。然后，使用弯头镊子轻轻将颅骨从脑组织上剥离。用解剖铲托起脑组织，转移至含有冰冻切割液的培养皿中。使用外置气体喷射装置，通过调节旋转泵速度，向冰冻切割液中通入含95%氧气和5%二氧化碳的气体，以产生细小气泡。一到两分钟后，将脑组织置于表面经面粉筛轻微覆盖的超细纤维布上。使用超细纤维布轻轻擦拭脑组织表面的液体。将脑组织背侧朝上放置于样品台。然后，将样品台放置在自动转台的中心。在进行三维扫描时，将房间调暗，并对转台上的样品进行三维扫描。为测试三维扫描是否正常工作，点击“三维扫描”，设置相邻两次拍摄之间的角度为22.5度，起始角度为0度，终止角度为360度。将脑组织转移至培养皿中，并在切割液中通气约10秒。使用解剖刀沿冠状面中线将脑组织切成两块，然后用手术铲轻轻将两块脑组织转移至平坦表面。使用瞬干胶将脑组织块固定在脑块底座上。在一到两分钟内，用超细纤维布轻轻而小心地擦拭脑表面的液体。然后再次进行三维扫描。将刀片安装到振动切片机的刀片夹上。将覆盖脑组织块底座中心的黑色胶带贴至振动切片机切削台的中心位置。向切削台中倒入切削液，并将切削台放置到振动切片机上。调整切片速度和振幅。从两个脑组织块上各切出2到5片厚度为300微米的冠状切片。若条件允许，保持切片槽内溶液持续通气。 通过将切割速度设为12.7毫米/分钟，频率设为87至88赫兹，振动幅度设为0.8至1.0毫米，来优化系统的切割速度、频率和振动幅度。在切割脑片时，以包含前后坐标、半球及其他条件的格式记录所切脑片的坐标。使用粗塑料移液管将脑片轻柔转移至装有预热人工脑脊液（ACSF）的烧杯中。将脑片置于烧杯中，在约 34 摄氏度条件下孵育一小时。在此期间，对切片台上剩余的脑组织块进行三维扫描。随后，将多电极阵列（MEA 芯片）放置在记录装置上。使用两根管路将芯片连接至蠕动泵。其中一根管路用于将相同的ACSF导入MEA芯片，另一根管路用于将ACSF从MEA芯片导出。将连接在两根管路末端的两根针头固定在MEA芯片壁的顶部。用尖端沿MEA芯片内壁固定其位置。将ACSF的流速设置为4.1 RPM。按照文本方案中所述进行MRI数据处理，以提取皮层体积。为了进行 MRI 图像处理，请下载免费的 3D Slicer 软件。打开使用 3D Slicer 中的体渲染和编辑器模块生成的提取脑组织的 MR 图像。将模式从编辑器切换为体渲染，然后单击目标按钮，使脑图像居中显示在屏幕中央。选择 MRT-2 脑部模式，并通过移动偏移滑块调节阈值。然后，从体渲染模式返回编辑器，点击阈值效果按钮。应用标签 41，即大脑皮层。然后，在表单清单中将文件格式从 VTK 更改为 STL，将脑表面数据保存为 STL 文件。对一次扫描序列中从八个或十六个不同角度获取的八幅或十六幅图像进行自动配准，以校正微小的错配。操作时，点击对齐选项中包含的全局配准功能，并整合图像。从不同角度重复扫描以获取完整的脑表面。如果来自不同角度的图像未能成功整合，请点击“手动对齐”，并选择一对固定图像和移动图像。通过在不同图像中选取三个或四个共同点，开始进行图像的手动对齐。然后，点击“确定”。优化算法采用迭代最近点算法，不包含非线性形变。通过选中所有图像并点击网格生成按钮，对所有配准后的图像生成网格。接着，选择“小型艺术物体”选项，以获得最高分辨率的网格。将图像保存为STL二进制格式或ASCII格式。然后，打开MRI表面，并使用表面处理软件将其与3D扫描表面合并。执行与之前相同的手动配准过程。然后，再次保存这些配准后的表面图像。如有必要，通过擦除脑区周围的小噪声（特别是在 MRI 数据的情况下）以及填充任何孔洞（特别是在 3D 扫描数据的情况下）来清理各个表面数据。最后，使用 MATLAB 等数据分析软件打开表面数据。生成并评估两个表面之间最小距离的直方图。距离的评估基于通过剥离MRI体积获得的皮层表面与从提取的大脑3D扫描获得的表面之间进行。距离直方图的众数值仅为55微米。此外，在从距离为零的点开始累积直方图时，累积值在约 300 微米处达到总样本数量的 90%。两个表面之间距离的最终直方图显示，在约 50 微米处出现一个典型的峰值。从宏观角度来看，该众数值对应于几何限制，即来自 MRI 体素尺寸的 100 微米。这一点间接表明，MRI 与 3D 扫描之间的重叠算法运行得极为出色，且 MRI 和 3D 扫描的噪声水平均被有效抑制至较低水平。本方案首次将扫描技术提升应用于生物有机体，而该技术最初仅用于纯粹的工程需求。将该技术应用于医学领域可以解答新的科学问题。在完成3D扫描后，我们可以结合钙成像、膜片钳记录技术，从时间分辨率、空间分辨率以及可记录细胞数量等方面获得互补性信息。本方案所提供的高精度重叠性能，将使解剖学空间尺度与零空间尺度之间的无缝关联比以往更加真实可靠。

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3D 扫描技术在 3D 新颖嵌入重叠协议中桥接微电路和宏观大脑图像

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聚焦离子束刻蚀与脑组织扫描电子显微镜观察

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。...

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

取一段显示神经元轴突和树突的小鼠大脑皮层组织切片。树突具有突起，称为树突棘，可与轴突形成突触。将组织与四氧化锇-铁氰化钾溶液孵育，该溶液可结合脂质，随后再次应用四氧化锇，以增强成像的结构对比度。使用可结合大分子并增强对比度的重金属化合物进行染色。采用浓度递增的酒精进行脱水，以便进行树脂包埋。将组织包埋于树脂中，固定在样品 holder...

聚焦离子束扫描电子显微镜用于突触连接神经元的三维重建

本文介绍了一种组织学方法，用于捕获、标记、光学透明化并成像啮齿类动物脑组织中长期植入微装置周围的完整脑组织界面。该方法所包含的技术可帮助理解各种穿透性脑植入物对其周围组织的影响。...

脑植入微装置及其周围组织的完整组织学表征

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利用3D打印技术融合MRI与组织学：一种脑切片方案

我们开发了相关方案并设计了一种定制装置，以实现毫米级样本的包埋。本文介绍了样本制备流程，重点阐述了使用丙烯酸树脂和聚酰亚胺管进行包埋的方法，以实现样本的刚性固定和长期保存，从而便于通过显微CT对组织结构和细胞形态进行研究。...

通过显微计算机断层扫描实现固定与染色后毫米级完整样本的刚性包埋，用于无切片三维组织学研究

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一种基于显微CT的小动物脑部病变表征与电极定位方法

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一种用于胶质细胞与神经元细胞三维重建及虚拟现实分析的方法

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利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

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学习利用三维扫描技术将微尺度神经分布嵌入宏观磁共振脑图像的新型神经解剖学方法。该方案通过免疫组织化学和多电极阵列实现高精度结构功能映射，为疾病相关对比模式识别提供可靠技术框架。

三维扫描技术通过新型三维嵌入重叠协议连接微电路与宏观脑成像

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