Name: 一种用于气溶胶取样的新型便携式体外曝光盒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 了解便携式体外气溶胶暴露盒（PIVEC）技术，用于在气液界面培养肺细胞并直接暴露于真实环境气溶胶。该方法可测量氧化应激和细胞毒性反应，为现场空气质量监测及环境健康评估提供创新工具。

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作者感谢 Boris Solomonov 和弗吉尼亚联邦大学创新机械车间在设备快速原型制作方面的帮助。作者还感谢 Lewinski 课题组的 Cristian Romero-Fuentes、Vitaliy Avrutin 博士、Dmitry Pestov 博士以及弗吉尼亚联邦大学纳米材料核心表征设施在颗粒表征方面的支持。本研究得到了弗吉尼亚联邦大学工程学院为 Lewinski 博士提供的启动资金资助。

操作人员在执行步骤1、2、3、5和6时必须佩戴个人防护装备（如实验服、手套、护目镜）。
1. 材料准备
<ol>
	<li>准备系统组装和暴露所需的材料，以确保实验的可重复性。
	<ol>
		<li>确保使用新的或经70%乙醇清洗过的内径为¼”导电管以及外径为¼”接头进行系统组装。</li>
		<li>在实验开始前至少24小时，将包括滤膜、PIVEC组件、镊子和颗粒粉末在内的测试材料存放于温湿度受控的环境中。 
		注意：环境温度应接近室温，约为20 °C，相对湿度低于35%。这对实现实验间的可重复性至关重要。</li>
		<li>使用异丙醇清洁颗粒计数器的部件，并根据制造商建议进行系统预热，包括用于测量的扫描迁移率粒径谱仪（SMPS）和光学粒径谱仪（OPS）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 干气溶胶的制备
注意：操作人员应在通风橱内进行气溶胶生成。
<ol>
	<li>组装干气溶胶生成系统 
	注意：颗粒在气体或液体中的悬浮状态应适合所模拟的应用及细胞培养条件。以下方法可使用基于液体的气溶胶进行。干气溶胶系统的设计源自 Tiwari 等.37 干式分散系统的示意图如图所示 图1.
	<ol>
		<li>将球阀连接到4英寸1/8英寸螺纹管的两端，用作颗粒料斗。将一段2英寸1/8英寸管连接至其中一个阀门。</li>
		<li>称取铜纳米颗粒，在本研究中，测定沉积效率时每种粒径颗粒的质量浓度保持恒定。每次暴露分别使用约 7.5 mg 的 40 nm 铜纳米颗粒、7 mg 的 100 nm 铜纳米颗粒和 13 mg 的 800 nm 铜纳米颗粒。将铜纳米颗粒通过开口端放入颗粒料斗中。 
		注意：称取的铜纳米颗粒质量将作为基于质量的给药浓度。</li>
		<li>放置一段3英寸长的 &#189;在2英寸管道周围安装外径（OD）管，并将高效微粒空气（HEPA）过滤器置于该短管内，使气流方向经过球阀。</li>
		<li>使用螺纹将真空发生器连接到另一个球阀上。将外径为5/16英寸的管路插入快接接头，将真空发生器与储气罐连接。使用 &#188;使用OD管将真空发生器的出口与实验装置连接，方法是将管子套在真空发生器的出口上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用干气溶胶系统产生干气溶胶
	<ol>
		<li>打开空气罐的主阀门，使气流进入系统。打开空气罐上流量调节器的阀门，并调节至系统内的气流与真空泵的设定值相匹配。</li>
		<li>打开靠近HEPA过滤器的球阀，然后打开靠近真空发生器的球阀。保持这两个阀门开启约3秒，以使颗粒被吸入气流中。</li>
		<li>关闭靠近真空发生器的球阀，然后关闭靠近HEPA过滤器的球阀。根据实验需要，使储气罐中的空气在实验过程中持续流动。</li>
		<li>关闭气罐的主阀和调节阀以停止气流。使用70%乙醇清洁球阀和真空发生器。将金属管道进行高压灭菌以实现灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用PIVEC测量沉积效率
注意：操作人员应在通风橱内进行气溶胶暴露操作。
<ol>
	<li>通过在步骤 2.2 中生成的铜纳米颗粒气溶胶收集到预先称重的滤膜上，测量沉积量。使用滤膜上收集的质量测得的沉积剂量和通过称量铜颗粒确定的给药剂量，计算沉积效率。
	<ol>
		<li>在暴露前至少 24 小时，将孔径为 1.00 µm 的玻璃纤维滤膜置于 1.1.2 所述的低湿度条件下。对未使用的滤膜称重三次，并记录滤膜重量。将未使用的滤膜放入细胞培养插件中。</li>
		<li>为 PIVEC 选择合适的细胞培养插件适配器（6 孔或 24 孔），以支撑带有滤膜的细胞培养插件。将适配器部件放置在 PIVEC 底座顶部，确保其底部比顶部更宽，以固定到位。</li>
		<li>使用镊子将装有滤膜的细胞培养插件放入适配器部件中。将顶部部件盖在适配器部件上，确保其底部比顶部更宽，以固定到位。用一层胶带包裹 PIVEC。</li>
		<li>将 37 mm 样品盒的上下部分推入 PIVEC 的顶部和底部并固定。将 ¼” 带凸缘接头插入样品盒的入口和出口。</li>
		<li>将电阻加热器缠绕在 PIVEC 周围，使导线位于底部。用胶带固定。</li>
		<li>用约 8 圈铝箔包裹 PIVEC 以进行隔热。用胶带固定。</li>
		<li>将一段长 2”、外径为 1/2” 的柔性管连接到 PIVEC 顶部的接头上。从无菌水中取出多孔管，并插入 PIVEC 顶部的管路中。</li>
		<li>将 PIVEC 固定在铁架台的夹具上并固定。完成与真空泵、颗粒计数器和气溶胶装置的连接。 
		注：仅当在不同运行中将颗粒计数器分别放置在 PIVEC 前和 PIVEC 后时，才能确定基于数量的沉积剂量。</li>
		<li>按照本方案的步骤 2.2，在所需的暴露时间与流速下进行滤膜暴露；本研究中采用的条件为 10 分钟、0.5 LPM。从装置中取出 PIVEC。取出细胞培养插件，并将暴露后的滤膜置于滤膜盒中，在低湿度条件下至少放置 24 小时后再进行测量。</li>
		<li>用 70% 乙醇清洁 PIVEC。在下一次实验前，使用紫外光灭菌至少 30 分钟。</li>
		<li>对暴露后的滤膜称重三次，并记录滤膜重量。将暴露后的滤膜放入标记好的滤膜盒中储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 沉积剂量与沉积效率的计算
注意：了解沉积情况对于气溶胶给药及细胞反应的解读至关重要。
<ol>
	<li>根据基于质量的测量结果计算沉积量
	<ol>
		<li>将滤膜上的沉积质量计算为暴露前平均重量与暴露后平均重量之间的差值。该值即为实验中基于质量的沉积剂量。</li>
		<li>利用给药质量 madmin 和步骤 4.1.1 中确定的基于质量的沉积剂量 mdep，计算实验中基于质量的沉积效率 ηm。 
		<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq1.jpg" /></li>
		<li>对至少 3 次实验的步骤 4.1.1 和 4.1.2 中的数值取平均，以确定 PIVEC 在不同粒径下的沉积量和沉积效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据基于粒子数量的测量结果计算沉积量
	<ol>
		<li>确保已使用粒子计数器在 PIVEC 后进行测量，并确定 PIVEC 前的粒子浓度。对粒子计数器测得的粒子浓度随时间积分，再对粒子直径积分，以确定测得的总粒子数。</li>
		<li>将沉积的粒子数量计算为给药粒子数与 PIVEC 后测得粒子数之间的差值。该值即为实验中基于数量的沉积剂量。</li>
		<li>利用给药粒子数 nadmin、基于数量的沉积剂量 ndep、体积流量 V 和时间 t，计算实验中基于数量的沉积效率 ηn。 
		<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq2.jpg" /></li>
		<li>对至少 3 次实验的步骤 4.2.2 和 4.2.3 中的数值取平均，以确定 PIVEC 在不同粒径下的沉积量和沉积效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞气溶胶暴露
注意：有关气液界面细胞培养的内容，请参阅 Blank et al.38。操作人员应在生物安全柜内进行细胞培养小室的装载（步骤 5.1.2–5.1.4）。气溶胶暴露操作应在通风橱中进行。
<ol>
	<li>在气液界面培养细胞
	<ol>
		<li>通过加入胰蛋白酶-EDTA 溶液从培养瓶中消化 A549 细胞，T75 培养瓶加入 3 mL，T25 培养瓶加入 1 mL，在 37 °C 下孵育 5 分钟。向 T75 培养瓶中加入 7 mL 完全培养基，或向 T25 培养瓶中加入 4 mL 完全培养基，冲洗瓶壁以充分收集细胞悬液。将细胞悬液转移至无菌的 15 mL 圆锥形离心管中，以 800 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>弃去含有胰蛋白酶-EDTA 的上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中。取 10 µL 细胞悬液加入血细胞计数板，使用血细胞计数板计数以确定细胞浓度和总细胞数。</li>
		<li>向 24 孔板的每孔中加入 0.5 mL 完全培养基。将未使用的细胞培养小室放入孔中。在顶侧接种细胞，接种密度约为 1 × 105 个细胞/cm2，适用于每日接近倍增的细胞类型。对于 24 孔培养小室中的 A549 细胞，以 1 × 105 个细胞/cm2 的密度接种，即向每个细胞培养小室中加入 35,000 个细胞。 
		注意：生长速率较慢的细胞可适当提高接种密度。</li>
		<li>向细胞培养小室的顶侧加入完全培养基，使最终体积达到指定值（24 孔板的最终体积为 0.25 mL）。</li>
		<li>在浸没条件下培养 7 天，每 1–2 天更换一次培养基。7 天后，移除顶侧培养基，在气液界面（ALI）条件下继续培养至少 1 天，仅更换基底侧培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装 PIVEC 装置
	<ol>
		<li>在暴露前，让细胞在气液界面条件下平衡至少 24 小时。</li>
		<li>选择适合 PIVEC 的细胞培养小室适配器，用于支撑带滤膜的细胞培养小室。将适配器部件放置在 PIVEC 底座上方，并确保其底部宽于顶部以固定到位。向 PIVEC 底座的孔中加入 4 mL 细胞培养基。</li>
		<li>使用镊子将细胞培养小室放入第 5.2.3 步中已放置的适配器内。将顶部部件盖在适配器上，确保其底部宽于顶部并固定到位。小心地用一层胶带将整个 PIVEC 包裹固定。</li>
		<li>将 37 mm 的夹片分别安装在 PIVEC 的顶部和底部，并推入固定。将 ¼” 卡套接头插入夹片的进样口和出样口。</li>
		<li>将电阻加热器缠绕在 PIVEC 外部，确保导线位于底部。用胶带固定。</li>
		<li>用约 8 圈铝箔包裹 PIVEC 以进行隔热，用胶带固定。</li>
		<li>将一段短的外径为 1/2” 的柔性管连接至 PIVEC 顶部的接头。从无菌水中取出多孔管，并插入 PIVEC 顶部的管路中。</li>
		<li>将 PIVEC 固定在铁架台的夹具上。完成与真空泵和气溶胶系统的连接。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 PIVEC 在气液界面暴露细胞
	<ol>
		<li>根据第 2 步确定的沉积效率，计算需气溶胶化的颗粒质量。称取相应质量的颗粒，并在通风橱内按照第 2 步的操作将其加入气溶胶系统。</li>
		<li>按照第 2.2 步进行细胞暴露。在本研究中，细胞暴露于约 3.5 mg 的铜纳米颗粒，气流速率为 0.5 LPM，暴露时间为 10 分钟。对照组实验使用加湿空气，以评估空气本身的影响。暴露结束后，将 PIVEC 从装置中取出，取出细胞培养小室，放入无菌孔板中，并放回 CO2 培养箱（37°C，5% CO2，90% 相对湿度）。</li>
		<li>吸除 PIVEC 中的培养基。若需进行额外实验，用磷酸盐缓冲液冲洗 PIVEC 底部，然后重复第 5.1 和 5.2 步。</li>
		<li>实验结束后，用 70% 乙醇清洗 PIVEC，并在下次实验前用紫外灯灭菌至少 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物学检测流程 
	注意：本研究中进行的检测包括通过 DCFH-DA 法检测氧化应激水平，以及通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性。
	<ol>
		<li>将 24.4 mg DCFH-DA 溶解于 50 mL 甲醇中，配制成 1 mM DCFH-DA 溶液。该溶液可在 -20°C 下保存最多 4 个月。将 1 mM DCFH-DA 溶液稀释：取 0.1 mL 1 mM DCFH-DA 溶液与 9.9 mL HBSS 混合，配制成 10 mL 的 10 µM DCFH-DA 溶液。</li>
		<li>移除细胞培养基，用约 1 mL PBS 清洗细胞培养小室。向每孔中加入 0.5 mL 10 µM DCFH-DA 溶液，加样完成后放回小室。用铝箔覆盖孔板以防止染料光活化，并放回 37°C 培养箱孵育 1 小时。</li>
		<li>将细胞从培养箱中取出，吸除 DCFH-DA 工作液。向每孔中加入 0.5 mL HBSS，并放回细胞培养小室。</li>
		<li>将孔板放入酶标仪中，使用 485/530 nm 的激发/发射波长测量基础荧光值。取出孔板后，将小室装入 PIVEC 进行暴露。</li>
		<li>按预定时间暴露细胞。暴露后取出小室并放回孔板。从孔板中吸取 50 µL 基底侧液体，转移至白色 96 孔板中。暴露后每 30 分钟测量一次 DCF 荧光值，共测量 2 小时，激发/发射波长为 485/530 nm。</li>
		<li>让基底侧液体在室温下平衡 20–30 分钟。按照试剂盒说明书配制 LDH 检测试剂，取 50 µL 加入基底侧液体中，反应 10 分钟。向孔中加入 25 µL 终止液。使用 560/590 nm 的激发/发射波长读取 resorufin 产物的荧光值。</li>
		<li>收集额外的基底侧液体，并在暴露后 4 小时和 24 小时重复第 5.4.6 步。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6 统计学方法
<ol>
	<li>生物测定数据分析
	<ol>
		<li>以处理细胞相对于基线测量值的荧光强度增加来报告活性氧（ROS）的产生。以处理细胞相对于未处理细胞的荧光 intensity 增加来报告乳酸脱氢酶（LDH）活性。</li>
		<li>采用单因素方差分析（ANOVA）确定数据集之间的统计学差异。在适用情况下，以0.05的显著性水平进行学生t检验。数据以至少三次暴露测量的均值±标准差表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者的所属单位如封面页所示。本研究在弗吉尼亚州里士满的弗吉尼亚联邦大学完成，作者获得该大学的经费支持。作者对本文的撰写和内容负有唯一责任。作者声明不存在任何利益冲突。

滤膜盒提供了一种简单且低成本的方法，用于采集呼吸区的气溶胶；然而，从滤膜上提取的气溶胶样品并不能代表完整的气溶胶成分（即气体、挥发性物质和颗粒物），从而限制了对相关生物学效应的评估。基于37 mm滤膜盒的初始设计，PIVEC旨在保持便携性，并模拟颗粒物吸入后的in vivo沉积过程。PIVEC显著小于当前的ALI暴露系统，体积约相当于一个纸巾盒，并内置温度和湿度控制功能。其尺寸与个人级联冲击器相似，但除此之外还可提供气溶胶暴露后细胞反应的数据。尽管PIVEC一次仅能容纳一个样品，与其他现有暴露系统相比容量较小，但其小巧的尺寸允许多个系统同时使用，从而增加样本量，并可实现空间分布的监测。
该实验方案中有多个关键步骤。为了确定沉积效率，必须按照步骤1所述正确地对滤膜进行预处理，这一点至关重要。此外，在暴露前准确称量铜纳米颗粒、在暴露后准确称量滤膜，对于确定基于质量的沉积效率也非常重要。数量沉积效率必须通过粒子计数器测得的气溶胶初始浓度与最终浓度之间的差值来确定。如果未能准确测定沉积效率，则很难判断不同类型气溶胶之间的生物学反应差异。可通过改变沉积条件对沉积过程进行调整...

使用in vitro技术进行个体采样，可全面了解工作场所气溶胶的生物学效应。1 空气中污染物的暴露包括对化学物质本身的暴露，以及对采集的空气样本的暴露，暴露方式可为将气体引入细胞悬液中的淹没条件、使用摇床等装置进行间歇性暴露，或在气液界面（ALI）进行直接暴露。2 许多此类技术是在细胞悬浮培养或暴露前采集样本的条件下进行的，而这些步骤可能因气溶胶的潜在变化而影响毒理学研究结果。3 为避免这些变化，可将实验室搬至现场，采用文献中已报道的多种in vitro ALI培养暴露系统进行检测，4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 然而，目前 commercially available 的系统较少。8,9,12 这些系统通常体积庞大，尤其当需配备用于调节细胞环境温湿度及样品气溶胶流速的仪器时更是如此。通过使用PIVEC系统，可在传统实验室环境之外或呼吸区直接进行气溶胶暴露，同时模拟吸入条件。
气溶胶沉积的测定 体外 对于研究吸入对健康影响具有重要意义。呼吸区是指距口鼻30 cm以内的区域，14 对于理解纳米颗粒的暴露及其与肺部生物学效应的关联至关重要。2 通常，细胞上的沉积被定义为沉积效率，即沉积并被细胞摄取的颗粒数与施加到系统中的颗粒总数之比。6,15 或按相同质量计算。4,16 目前测量呼吸区气溶胶的方法基于滤膜，通过在特定采样时间内捕获颗粒物，并利用滤膜进行后续检测。17 个人监测需要小型化系统，但其代价是采集的样本量较少。
评估气溶胶暴露对健康影响的方法有多种。ALI 模型可将气溶胶像真实暴露场景中一样通过空气直接递送至细胞，同时相比其他方法更具成本效益且耗时更少 体内 在模拟眼睛、皮肤和肺部等气液界面屏障的研究中，于气液界面（ALI）培养的肺细胞能够形成具有极性的屏障层。18,19 其产生的生理特征类似于 体内 肺上皮，包括特定支气管或肺泡细胞系中的黏液和表面活性物质产生、纤毛摆动19 紧密连接，19,20 和细胞极化。18 此类变化可能影响在毒性研究中测得的细胞反应。21 此外，ALI 体外 模型结果通常比通过悬浮模型暴露的细胞更敏感22 并能够模拟急性 体内 吸入毒性23,24 因此，能够于呼吸区进行测量的气液界面暴露系统是顺理成章的下一步。
通过将细胞直接暴露于气溶胶的排放源处，可对混合物中包含的所有气体、半挥发性化合物和颗粒物的效应进行研究。当混合物被收集在滤膜上时，气体和挥发性化合物无法被捕获，因而无法对整个混合物进行全面研究。此外，将颗粒物重新分散为粉末或液体悬浮液可能导致颗粒聚集或发生颗粒与液体之间的相互作用，例如在液体悬浮液中的溶解现象25,26。当气溶胶颗粒被加入液体中时，更易发生团聚25,27、形成蛋白冠28，或与液体中的化合物发生相互作用，这些因素均可能影响颗粒的沉降行为并改变其生物学效应29,30
气液界面暴露基于三种主要气溶胶暴露模式：云沉降、平行流和垂直流。云沉降由气液界面细胞暴露系统（ALICE）所采用，4 是一种批量系统，其中颗粒通过重力沉降和扩散沉降在气溶胶被整体处理时发生沉积。平行流动由静电气溶胶 体外 暴露系统（EAVES）5 以及多培养暴露室（MEC）II，6 通过在流动轮廓中加入布朗运动，可实现沉积。微喷雾器采用的垂直流动，7 体外毒性纳米气溶胶暴露系统（NACIVT），11 以及商用的ALI系统8,9,10,12，增加了颗粒在沉积区域内的撞击作用。许多此类暴露系统体积庞大，需要额外的气溶胶预处理装置、用于气流控制的泵，甚至用于细胞培养的加热腔室。这种较大的体积降低了系统的便携性。这些系统通常无法在排放源处直接采样，而是将样品运送至实验室，或在实验室内生成模拟气溶胶进行分析。在此从现场到实验室的转移过程中，排放气溶胶的复杂性可能丢失。PIVEC 系统比现有系统更小巧，外部表面积约为 460 cm²2 仅重60克，系统内置温湿度控制，具有高度便携性。体积和重量的减小使该设备可穿戴或携带至暴露源处，实现直接采样。
当前暴露系统的体积较大，也降低了对浓度空间梯度进行采样的能力。这种分辨率在确定许多潜在环境和职业危害（如机动车尾气颗粒物或产生气溶胶的工作场所活动）的毒理学效应时至关重要。排放后立即会出现颗粒物浓度的空间差异。随着时间推移，颗粒物在大气中扩散，这种差异会进一步增大，且这些效应可能随环境条件（如温度、压力、风速和日照）的变化而改变。颗粒物一旦排放，还可能开始老化和氧化31,32，而扩散速率则受地形影响；在峡谷和隧道等扩散效应较慢的区域，颗粒物浓度较高，而在具有较大扩散空间的区域，浓度则较低33。这些扩散速率的变化可能对人类健康产生显著影响，在比较居住于城市与农村环境中的哮喘成人数量时即可观察到此类影响34。尽管许多暴露系统可同时提供多个样本，但要实现空间分辨率，仍需使用多个系统以及大量大型设备。
通过将实验室带到现场，利用完整细胞作为传感器可缩短分析时间。依据已知的生物学机制和终点指标，有助于确定气溶胶的成分和粒径。由于黏液纤毛清除、吞噬作用和转位等清除过程较为缓慢，这些颗粒通常与细胞相互作用达数天至数周之久。3 产生氧化应激、炎症反应，甚至细胞死亡。这些生物学终点可成为心血管疾病或慢性阻塞性肺疾病不良结局通路的起始环节。此外，Wiemenn 等 执行了一系列 体外 用于与文献中的短期数值进行比较的检测方法 体内 吸入毒性35&#160;体内 通过乳酸脱氢酶释放检测细胞毒性、谷胱甘肽减少及过氧化氢生成与释放检测氧化应激、肿瘤坏死因子α基因检测炎症潜能，四项指标中有两项呈阳性即可预测产生生物学响应。在测试的十种纳米级金属氧化物中，六种在暴露条件下显示具有活性（二氧化钛、氧化锌和四种不同的二氧化铈）。 体外 经确认 体内.
为了研究职业环境中气溶胶的影响，本实验室开发了PIVEC，用于现场暴露实验。此外，PIVEC还可佩戴用于个体采样，以监测和研究吸入暴露，类似于37 mm滤膜盒36；也可使用多个系统以获得特定区域内的空间分辨率。本实验方案中讨论了PIVEC的表征与使用方法。暴露后，通过细胞毒性实验观察其生物学效应。

<table><tbody><tr><td>扫描迁移率粒径谱仪（SMPS）</td><td>TSI, Inc.</td><td>3910</td><td>NanoSMPS</td></tr><tr><td>光学粒径谱仪（OPS）</td><td>TSI, Inc.</td><td>3330</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢管，4&quot; 长</td><td>McMaster-Carr</td><td>4830K116</td><td>标准壁厚 304/304L，两端带螺纹，1/8 管径</td></tr><tr><td>带杠杆手柄黄铜球阀</td><td>McMaster-Carr</td><td>4112T12</td><td>紧凑型高压等级，1/8 NPT 内螺纹</td></tr><tr><td>钢管，2&quot; 长</td><td>McMaster-Carr</td><td>7753K121</td><td>标准壁厚，一端带螺纹，1/8 管径</td></tr><tr><td>HEPA 滤膜</td><td>GE Healthcare</td><td>09-744-12</td><td>HEPA-Cap 一次性空气过滤胶囊</td></tr><tr><td>真空发生器</td><td>PISCO USA</td><td>VCH10-018C</td><td></td></tr><tr><td>PIVEC</td><td>VCU</td><td></td><td>如需设计请联系作者</td></tr><tr><td>电阻加热器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; 卡套式接头</td><td>Zefon International, Inc.</td><td>459743</td><td></td></tr><tr><td>多孔管</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>BB2062-1814A</td><td>亲水性，孔径 10 µm</td></tr><tr><td>移动电源</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养小室</td><td>Fisherbrand</td><td>353095</td><td>24 孔板用插入式培养小室</td></tr><tr><td>滤膜镊子</td><td>Fisherbrand</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>ThermoScientific</td><td>13-711-27</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纤维滤膜</td><td>SKC</td><td>225-7</td><td>无粘合剂型 AE 滤膜，37 mm，孔径 1.00 µm</td></tr><tr><td>超微量天平</td><td>A&amp;D</td><td>BM-22</td><td>置于环境控制舱内</td></tr><tr><td>37 mm 滤膜夹具</td><td>SKC</td><td>225-3250</td><td>空白滤膜夹具，37 mm，透明苯乙烯材质</td></tr><tr><td>可变流量真空泵</td><td>SKC</td><td>220-5000TC</td><td>AirChek TOUCH，5 至 5000 mL/min</td></tr><tr><td>铜颗粒</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1090</td><td>40 nm</td></tr><tr><td>铜颗粒</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1088</td><td>100 nm</td></tr><tr><td>铜颗粒</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1117M</td><td>800 nm</td></tr></tbody></table>

一种新型便携式 体外 气溶胶采样暴露盒

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

本方案介绍了一种新型可穿戴的体外暴露系统，包括其表征与性能评估。气液界面（ALI）体外暴露系统通常体积较大、笨重，难以运输至现场，也难以在排放源或呼吸带内进行操作。通过该系统的微型化，可将实验室功能带至现场，缩短样品处理时间，并提供一种更为合适的暴露方法，避免气溶胶在接触细胞前发生改变。便携式体外暴露盒（PIVEC）改造自37 mm滤膜盒，使其可在传统实验室环境之外进行体外毒性测试。本研究采用三种不同粒径的铜纳米颗粒对PIVEC进行表征，通过重量法和颗粒数浓度分析测定其沉积效率。初步细胞毒性实验通过暴露肺细胞，评估该系统在维持细胞活性的同时沉积颗粒物的能力。与现有的垂直气流体外暴露装置相比，PIVEC具有相似或更高的沉积效率。尽管样品通量较低，但其小巧的尺寸为当前的体外ALI暴露系统带来若干优势，包括可用于个人监测的可穿戴性、从实验室到排放源的移动能力，以及可同时部署多个系统以实现空间分辨，同时保持较低的用户成本。PIVEC是一种能够在现场及呼吸带内将气溶胶收集至气液界面体外模型上的系统。

职业的 体外 毒理学研究涉及在进行气溶胶暴露的同时维持细胞活性。PIVEC 系统如图所示。 图2，包括温度和湿度控制以及可穿戴的PIVEC装置。温度通过电池供电的电阻加热器维持，气溶胶则通过多孔湿润管增强自然加湿方式进行加湿。在实验室内的受控气溶胶环境中，PIVEC可按所示方式设置暴露实验 图1系统表征可用于确定沉积到细胞上的剂量，并进一步关联细胞反应。
沉积效率取决于添加到系统中颗粒物的尺寸，因为沉积力包括撞击、沉降和扩散。此外，沉积还受流速、暴露时间以及暴露系统特性的影响。基于这些信息，可以预测沉积情况。PIVEC的沉积效率已通过两种方法测定：重量分析法和颗粒计数法。使用基于滤膜的扫描迁移率粒径谱仪（SMPS）和光学粒径谱仪（OPS）测量数据，结合公式1和公式2，计算得到了表1中...

在此，我们介绍一种用于进行便携式细胞气溶胶暴露并检测细胞反应的实验方案。该方法采用在气液界面培养的细胞，以模拟 体内 生理学。通过活性氧的产生和乳酸脱氢酶的释放，观察到细胞对铜纳米颗粒气溶胶的反应表现为氧化应激和细胞毒性。

本方案介绍了一种新型可穿戴体外暴露系统，包括其表征与性能评估。气液界面（ALI）...

该方案具有重要意义，因为PIVEC可使细胞培养物直接暴露于真实环境气溶胶中。该系统可用于采集人体所呼吸的相同空气，从而实现一种新型空气质量监测。该技术的主要优势在于，能够在台式系统无法到达的位置（例如入气口或呼吸区）轻松地将气溶胶捕获到培养的肺细胞上。本次实验操作将由我实验室的近期毕业生Lynn Secondo博士和本科生Nathaniel Wygal演示。在实验前，需将测试材料储存并在受控环境中放置24小时。组装干式分散系统时，将球阀连接至一段长四英寸、1/8英寸螺纹管的一端。这用作颗粒漏斗。通过颗粒漏斗的开口端，加入所需量的铜纳米颗粒，然后用另一个球阀关闭颗粒漏斗。将一段长两英寸、1/8 英寸规格的管道连接到阀门上。将一段长三英寸、外径为 1/2 英寸的管路套在两英寸长的管道上。将高效过滤器（HEPA 过滤器）插入短管中，并确保气流方向穿过球阀。使用螺纹连接，将真空发生器连接到另一个球阀上。然后，将真空发生器连接到储气罐。在真空发生器的出口处套上外径1/4英寸的管路，以连接至实验装置。打开气罐的主阀门和调压阀，以设定所需的流量。先打开靠近HEPA过滤器的球阀，然后打开靠近真空发生器的球阀。在表征或暴露过程中保持这两个阀门开启，使用完毕后再关闭。首先关闭靠近真空泵的球阀，然后关闭靠近HEPA过滤器的球阀。关闭空气罐的主阀和调节阀以停止气流。清洁时，使用70%乙醇清洗球阀和真空泵。将金属管放入高压灭菌器中进行灭菌。在气液界面培养细胞后，让细胞平衡24小时。组装时，取PIVEC底座，使孔朝上，并将细胞培养插件适配器连接在顶部。使用移液器向 PIVEC 底座的孔中加入 4 毫升细胞培养基。用镊子将细胞培养小室放入适配器中。将 PIVEC 顶部组件的窄端朝上，与适配器连接。小心地用一层胶带包裹 PIVEC。将 37 毫米胶片盒的上下两部分推入并连接到 PIVEC 上。将 1/4 英寸带倒刺接头插入胶片盒的入口和出口。将电阻加热器缠绕在PIVEC上，使导线位于底部，用胶带固定。用八层铝箔包裹PIVEC以进行隔热，并用胶带固定。将外径为1/2英寸的管路连接到PIVEC顶部的接头上。将多孔管路从无菌水中取出，并放置在PIVEC顶部的管路内。将整个系统转移至通风橱中，用铁架台夹紧PIVEC并固定稳妥。通过将气溶胶发生器出口处的直径为1/4英寸的管路连接至多孔管路，将PIVEC连接到气溶胶系统。将PIVEC的出口通过Y型接头连接至直径为1/4英寸的管路，该管路再连接至HEPA过滤器和真空泵。打开阀门，并将泵的流速设置为0.5升每分钟。将细胞暴露于铜纳米颗粒中10分钟后，关闭阀门并停止泵的运行。从气溶胶系统中移除PIVEC。使用镊子取出细胞培养插件，并将其放入无菌培养板中，以开始所需的生物学检测。建议的暴露时间点，将插入物放回二氧化碳培养箱。使用滴管从PIVEC中吸除培养基。使用70%乙醇清洗PIVEC，并在下次实验前用紫外灯灭菌至少30分钟。使用三种不同尺寸的铜纳米颗粒对PIVEC进行了表征，以确定其沉积效率。总体而言，24孔设计的沉积量最高，其次是6孔设计。与40纳米和800纳米的铜颗粒相比，100纳米颗粒的沉积量略有下降。采用基于滤膜的扫描电迁移粒径谱仪以及光学粒子粒径谱仪测量，确定了铜纳米颗粒气溶胶的粒子数浓度。通过确定37毫米滤膜与细胞培养插入物之间的剂量关系，可加快暴露后的分析进程。比较结果显示，800纳米铜颗粒的相关性显著，p值小于0.05。与文献中报道的垂直气流体外暴露系统的沉积效率相比，PIVEC在所测试的颗粒尺寸范围内表现出相当或更高的沉积效率。需要牢记最重要的一点是，尽管本方案展示了PIVEC在实验室环境中的使用，但其设计初衷是在暴露部位测量细胞对气溶胶的反应。在进行现场测试时，表征测试气溶胶的沉积效率至关重要。沉积效率决定了细胞暴露的颗粒沉积剂量。还可进行其他生物学检测，以研究暴露引起的更多细胞反应终点。PIVEC 已被用于评估由 3D 打印过程（如金属粘结剂喷射和熔融丝材制造）产生的气溶胶所引起的细胞反应。使用纳米颗粒（尤其是气溶胶形式）可能存在危险，任何暴露操作均应在通风橱中进行。细胞实验应在生物安全柜中操作。

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一种用于气溶胶取样的新型便携式体外曝光盒

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体外大麻对气液界面肺上皮细胞的暴露

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一种新型便携式体外气溶胶采样暴露盒

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