Name: 小鼠肺损伤的诱导,通过博霉素内切注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解通过博来霉素气管内注射诱导小鼠肺纤维化模型的方法，并评估人脐带间充质干细胞的抗纤维化效果。该方案为临床前抗纤维化治疗研究提供可靠平台。

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本工作由意大利卫生部资助（资助号：RF-2011-02352331，授予 Armando Gabrielli）。

所有动物护理和实验程序均经意大利卫生部批准（授权编号：456/2016-PR），并依照《赫尔辛基宣言》的规定进行。
1. 小鼠
<ol>
	<li>购买小鼠后，需让其适应环境至少 7 天后再进行注射。 
	注：小鼠饲养于无病原体动物房中，在恒定的温度和湿度条件下维持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环，可自由获取水和标准颗粒饲料。</li>
	<li>使用雌性 C57BL/6 小鼠，并在其 12 至 16 周龄时进行注射。</li>
</ol>
2. 博来霉素气管内注射
<ol>
	<li>博来霉素的配制 
	注意：根据《全球化学品统一分类和标签制度》（GHS），博来霉素被归类为GHS08健康危害物质。
	<ol>
		<li>在化学通风橱内配制博来霉素。</li>
		<li>为获得所需工作浓度（0.05 U/100 µL），将15 U冻干硫酸博来霉素溶于30 mL无菌生理盐水中。</li>
		<li>通过反复倒置试管的方式轻柔混匀样品，避免形成凝块。</li>
		<li>在试管上正确标注重悬日期，4 °C保存，并在24小时内使用完毕。</li>
		<li>给药前将博来霉素溶液平衡至室温。 
		注：本实验中，采用单次剂量1.5 U/kg体重的博来霉素诱导C57BL/6小鼠肺损伤。然而，不同小鼠品系对博来霉素的敏感性存在差异6,7。应进行剂量滴定实验，以确定所用小鼠品系的最佳剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>通过将0.2 g 2,2,2-三溴乙醇溶解于9 mL无菌生理盐水和1 mL无水乙醇中配制麻醉剂（工作浓度为20 mg/mL）。</li>
		<li>通过反复倒置试管充分混匀，避免形成凝块。</li>
		<li>在试管上正确标注配制日期，避光条件下4 °C保存，3天内使用完毕。</li>
		<li>使用1 mL注射器和26 G针头，每只小鼠腹腔注射250 µL三溴乙醇溶液（最终剂量为200 mg/kg体重）进行麻醉。 
		注：在此剂量下，小鼠至少保持无意识状态20分钟。必要时，应根据小鼠&#160;反应，在兽医指导下调整剂量。</li>
		<li>监测小鼠&#160;呼吸。呼吸频率将轻微减慢。数分钟后，轻捏小鼠&#160;足部以检查是否存在足底反射消失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气管内注射
	<ol>
		<li>整个操作过程中保持无菌条件。使用无菌外科器械和材料，佩戴无菌手套，避免接触任何非无菌表面。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠仰卧于手术平台，用手术胶带轻柔固定其四肢。 
		注：建议轻柔粘贴小鼠四肢，以防止在平台旋转过程中（步骤2.3.10）小鼠滑落。</li>
		<li>将小鼠置于加热垫上，通过直肠探头监测体温，确保在整个操作过程中直肠温度稳定维持在37 °C。</li>
		<li>在小鼠&#160;颈部下方放置一个“垫枕”（例如牙科棉卷），轻柔地使其颈部过度伸展。</li>
		<li>使用刀片轻柔剃除喉部毛发。</li>
		<li>用酒精去除手术区域毛发，并用1%聚维酮碘溶液多次消毒小鼠皮肤。</li>
		<li>使用解剖镊夹起皮肤，用环柄弯头钝头剪刀在小鼠胸骨舌骨肌对应位置做一小切口&#160;。 
		注：皮肤切口长度约为0.5 cm。所切除的皮肤组织极小，不会对小鼠颈部造成张力。</li>
		<li>使用棉签止血。</li>
		<li>通过钝性分离暴露气管，轻柔清除脂肪及其他组织。</li>
		<li>旋转手术平台，使小鼠头部朝向操作者。 
		注：此体位可使操作者在注射时调整注射器角度，使其沿气管自然走向直通肺部。</li>
		<li>将小鼠置于手术显微镜下以清晰观察气管。调节照明，设置放大倍数（1至1.2倍），并对焦以获得清晰图像。气管呈白色半透明管状结构，气管环清晰可见。</li>
		<li>轻柔吹打混匀博来霉素溶液，用25 G针头的0.5 mL注射器吸取100 µL，避免产生气泡。</li>
		<li>当气管清晰可见后，以30°角用针尖小心穿刺气管（图1A）。</li>
		<li>缓慢将100 µL博来霉素或无菌生理盐水（溶剂对照）直接注入气管腔内。等待数秒，待全部液体通过针头进入体内后，再将针头从气管中拔出。</li>
		<li>观察短暂的呼吸暂停现象，此现象发生在针头正确插入气管时，小鼠会立即吸入全部液体。</li>
		<li>若小鼠未吸入液体，应密切观察其呼吸并调整针头位置。若小鼠呼吸停止，应立即拔出针头，待其恢复正常呼吸后再重新插入。</li>
		<li>注射完成后安全丢弃注射器和针头。</li>
		<li>使用5-0可吸收缝线缝合皮下筋膜和皮肤切口。 
		注：若缝线未完全吸收，应在术后7–10天拆除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物恢复
	<ol>
		<li>将注射后的小鼠侧卧于加热垫上以促进恢复。</li>
		<li>监测小鼠&#160;呼吸，并持续观察直至其开始活动，恢复胸卧位及完全清醒。</li>
		<li>确认小鼠状态良好后，将其放回原笼。在完全恢复前，不得将其与其他动物合笼。</li>
		<li>为确保持续镇痛并避免术后残留疼痛，应在气管内注射后每12小时&#160;皮下注射一次布托啡诺（最终剂量为0.05 mg/kg体重）。</li>
		<li>在博来霉素气管内注射后24小时内对小鼠进行观察，并每日检查两次。监测内容包括呼吸困难、体重减轻、行为异常及任何发病迹象。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人脐带间充质基质细胞尾静脉输注
<ol>
	<li>细胞准备 
	注意：人脐带间充质基质细胞的分离、鉴定和培养方法已有文献报道8,9,10。hUC-MSC 应在无菌条件下操作和输注；因此，所有步骤均需在无菌操作台中进行。
	<ol>
		<li>将 hUC-MSC 在 75 cm2 培养瓶中扩增至早期传代（最多第 1–3 代）。 
		注意：在向小鼠输注当天，hUC-MSC 的融合度应达到约 70%。</li>
		<li>用 10 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下洗涤细胞。</li>
		<li>加入 2 mL 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育约 1 分钟，直至细胞开始脱落。</li>
		<li>加入 8 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 hUC-MSC 完全培养基以中和胰蛋白酶。</li>
		<li>以 350 x g 离心 10 分钟收集细胞。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于无菌生理盐水中，使用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞稀释至每只小鼠 200 µL 无菌生理盐水中含 2.5 x 105 个细胞，制备成输注用细胞悬液。需额外准备过量细胞悬液，以确保所有小鼠均能完成输注。</li>
		<li>输注前将细胞置于冰上保存，并在数小时内完成输注，具体操作见第 3.3 节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉 
	注意：为最大限度降低注射过程中损伤小鼠尾静脉的风险，必须防止小鼠移动。因此，相比单纯固定，更推荐使用麻醉。
	<ol>
		<li>将小鼠置于诱导室中，通过吸入 4% 异氟烷进行麻醉。</li>
		<li>监测小鼠&#160;呼吸，其呼吸频率会略有减慢。数分钟后，轻捏小鼠&#160;足部以确认麻醉效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尾静脉输注
	<ol>
		<li>确认小鼠意识丧失后，将其置于无菌操作台内，进行无菌的 hUC-MSC 静脉输注。</li>
		<li>通过面罩持续供给 1.5% 异氟烷，维持实验全程的全身麻醉状态。</li>
		<li>为促进血管扩张并便于注射，将小鼠&#160;尾部浸入温水中 2 分钟。</li>
		<li>轻轻吹打混匀细胞悬液，确保细胞无聚集。用 1 mL 注射器吸取 200 µL 细胞悬液（配备 26 G 针头），注意避免产生气泡。</li>
		<li>捏住小鼠&#160;尾尖，轻轻拉直尾部。</li>
		<li>定位小鼠&#160;尾部侧静脉，用手术刀片轻轻刮除局部毛发，并用 70% 乙醇擦拭消毒。 
		注意：轻刮尾部是为了去除毛发，使注射部位更平滑、清洁。</li>
		<li>从尾部远端开始，以 15° 角将针头插入静脉，缓慢注入 200 µL hUC-MSC 悬液或无菌生理盐水（载体对照）（图 1B）。</li>
		<li>观察液体是否顺利进入静脉且无外渗，以判断静脉输注是否成功。等待数秒，待全部液体完全注入后，再将针头退出静脉。</li>
		<li>为防止出血，用无菌纱布对穿刺部位短暂按压。</li>
		<li>输注完成后，安全丢弃注射器和针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物恢复
	<ol>
		<li>将完成输注的小鼠侧卧于加热垫上，促进恢复。</li>
		<li>持续监测小鼠&#160;呼吸，并观察其状态，直至小鼠开始活动并恢复胸卧位及完全清醒。</li>
		<li>确认小鼠状态良好后，将其放回原饲养笼。在完全恢复前，不得将其与其他动物合笼。</li>
		<li>尾静脉输注后 24 小时内持续观察小鼠，并此后每隔一天进行一次检查，以监测其健康状况，及早发现任何痛苦或病理表现。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 器官外植与组织处理
<ol>
	<li>在博来霉素给药后的第8、14或21天，通过注射过量麻醉剂处死小鼠（图1C）。</li>
	<li>切除气管和肺组织，并立即用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。</li>
	<li>将右肺组织在液氮中速冻，随后于-80 °C保存，用于后续分子分析10。</li>
	<li>用4%多聚甲醛灌注左肺并使其膨胀，然后在10%中性缓冲甲醛溶液中固定24小时；接着依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明处理，最后包埋于石蜡中10。</li>
</ol>

<ol><li>Iudici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+are+we+going+in+the+management+of+interstitial+lung+disease+in+patients+with+systemic+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis?</a> Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).</li>
<li>Moore, B. B., Hogaboam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Murine models of pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).</li>
<li>Mouratis, M. A., Aidinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+pulmonary+fibrosis+with+bleomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).</li>
<li>Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bleomycin+animal+model%3A+a+useful+tool+to+investigate+treatment+options+for+idiopathic+pulmonary+fibrosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).</li>
<li>Moore, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models of fibrotic lung disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).</li>
<li>Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+strain+variation+in+murine+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).</li>
<li>Phan, S. H., Kunkel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cytokine+production+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).</li>
<li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li>
<li>Beeravolu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+from+Human+Umbilical+Cord+and+Fetal+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55224(2017).</li>
<li>Moroncini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+from+human+umbilical+cord+prevent+the+development+of+lung+fibrosis+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice.</a> PLoS One. 13 (6), e0196048(2018).</li>
<li>Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+type+I+procollagen+mRNA+transcripts+in+the+lungs+of+mice+during+the+development+of+bleomycin-induced+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+improve+myocardial+infarction+in+mice+because+cells+embolized+in+lung+are+activated+to+secrete+the+anti-inflammatory+protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Scotton, C. J., Chambers, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin+revisited%3A+towards+a+more+representative+model+of+IPF%3F%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).</li>
<li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601(2013).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotracheal+intubation+in+mice+via+direct+laryngoscopy+using+an+otoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50269(2014).</li>
<li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771(2016).</li>
<li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Men+and+mice%3A+Relating+their+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sciences. 152, 244-248 (2016).</li>
<li>Sueblinvong, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predisposition+for+disrepair+in+the+aged+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Predisposition for disrepair in the aged lung.</a> American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).</li>
<li>Moodley, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+reduce+fibrosis+of+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).</li>
<li>How, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+mediate+the+release+of+interferon+gamma-induced+protein+10+and+alleviate+bleomycin-induced+lung+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis.</a> Shock. 39 (3), 261-270 (2013).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSG-6+as+a+biomarker+to+predict+efficacy+of+human+mesenchymal+stem%2Fprogenitor+cells+%28hMSCs%29+in+modulating+sterile+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

经气管给药是将外源性物质递送至肺部的首选途径。多年来，直接将博来霉素注入气管已广泛用于诱导肺纤维化13，近年来，已有更多先进的无创技术被开发用于实现这一目的14,15,16。
本文所述方法相较于某些潜在局限性具有多项重要意义。气管注射需要外科手术干预，可能因操作本身引发并发症，同时需要对动物进行深度镇静。因此，充分的准备和熟练掌握操作技术十分必要。此外，为尽量减少小鼠的痛苦，必须根据小鼠品系及个体反应设定合适的麻醉剂量，并严格监测动物&#160;的镇静状态。尽管如此，我们观察到死亡率极低，且动物从麻醉中恢复良好。可用于麻醉的药物包括氯胺酮和赛拉嗪，也可使用三溴乙醇。然而，在小鼠中，氯胺酮与赛拉嗪的有效剂量接近致死剂量，因此容易诱发呼吸骤停。相反，三溴乙醇的剂量更易于调整，因而是一种更理想的麻醉剂。在经气管注入博来霉素后，我们未观察到任何不良反应。小鼠...

肺纤维化是一种进行性病理过程，其特征是肺间质中细胞外基质成分（主要为I型胶原）过度沉积，导致肺功能受损。它是多种不同病因肺部疾病的标志性特征，并且是临床预后不良的重要因素。由于目前的治疗方法较为有限1，小鼠模型仍然是深入研究影响疾病发生和发展致病机制以及开发新型抗纤维化策略的重要工具2,3。
迄今为止，博来霉素给药是实验性诱导肺纤维化最常用的方法4。除了多种给药途径（包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射和吸入给药）外，气管内或经气管注射博来霉素已成为最常用的给药方式4,5。本文所述方法旨在避免博来霉素对气管黏膜造成的刺激性损伤。事实上，通过暴露气管并在手术显微镜下直视，可将全部体积的博来霉素溶液直接灌注至下呼吸道，而不会溢入上呼吸道。当具备必要的外科技术与设备时，该方法可安全、稳定且可重复地诱导肺部炎症与纤维化，如下文所述。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Charles River</td><td>Jax Mice Stock n. 000664</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇（Avertin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Barraquer 微型持针器</td><td>Lawton</td><td>62-3755</td><td></td></tr><tr><td>博来霉素硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1141000</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 计数板</td><td>Brand&amp;nbsp;</td><td>718905</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>一次性剃刀</td><td>Unigloves</td><td>4080</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Aesculap 外科器械</td><td>BD311R</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>2Biological Instruments</td><td>557023</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 Vet</td><td>Merial Italia</td><td>N01AB06</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Model OPM 16</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 微型剪刀</td><td>Aesculap 外科器械</td><td>OC498R</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl Plus 4/0 可吸收缝线，FS-2 针，19 mm</td><td>Ethicon</td><td>VCP392ZH</td><td></td></tr></tbody></table>

经气管注射博来霉素诱导小鼠肺损伤

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

肺纤维化是多种不同病因人类肺部疾病的显著特征。由于目前的治疗方法较为有限，小鼠模型仍是开发新型抗纤维化策略的重要工具。本文提供了一种有效的研究方法以探讨 体内 人脐带来源的间充质基质细胞（hUC-MSC）在缓解博来霉素诱导的肺损伤中的抗纤维化活性。C57BL/6小鼠接受单次气管内注射博来霉素（1.5 U/kg体重），随后进行两次hUC-MSC输注（2.5 × 10⁶细胞/次）5) 注射至尾静脉，分别在博来霉素给药后24小时和7天进行。在第8、14或21天处死动物后，分析离体肺组织中的炎症与纤维化改变、胶原含量以及人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的存在情况。将博来霉素注射至小鼠&#160;气管给药可直接靶向肺部，导致广泛的肺部炎症和纤维化。系统性给予双剂量人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）可早期缓解博来霉素诱导的肺损伤。静脉输注的hUC-MSC会短暂定植于小鼠肺组织，并在其中发挥抗炎和抗纤维化作用。综上所述，本方案已成功应用于人肺纤维化实验小鼠模型中hUC-MSC的临床前测试。然而，该技术也可轻松拓展用于研究不同经气管给药物质对肺部病理生理的影响，以及验证新的抗炎和抗纤维化全身治疗方法。

通过气管内单次注射1.5 U/kg体重的博来霉素硫酸盐溶于100 µL无菌生理盐水诱导肺损伤。对照组动物接受等体积无菌生理盐水的气管内注射。在给予博来霉素后24小时和7天，分别将两剂hUC-MSC（2.5 × 105细胞溶于200 µL无菌生理盐水）经尾静脉注入小鼠体内。对照组动物接受等体积无菌生理盐水的静脉输注。在博来霉素给药后的第8、14和21天处死小鼠，获取肺组织进行组织处理（图1）。
我们证明，将博来霉素直接注入小鼠气管可使其迅速扩散至肺部，导致广泛的炎症、进行性纤维化以及正常肺组织结构的破坏，这与既往研究结果一致11。通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色和天狼星红染色评估肺组织的组织病理学变化10，并通过羟脯氨酸含量增加和胶原沉积证实纤维化的发生（<strong c...

本文介绍了一种有效的方法，用于研究经尾静脉输注来源于C57BL/6小鼠脐带全长的人类间充质基质细胞在博来霉素经气管注射诱导肺损伤后所表现出的抗纤维化活性。该方案可轻松扩展应用于其他治疗药物的临床前测试。

肺纤维化是多种不同病因的人类肺部疾病的显著特征。由于目前的治疗方法较为有限，小鼠模型……

本方案可成功用于通过气管内注射博来霉素在小鼠双肺诱导显著的炎症和纤维化反应，同时可通过尾静脉输注验证新的全身性抗炎和抗纤维化疗法。该技术的主要优势在于，将博来霉素直接注入小鼠气管可快速靶向肺部，且不会溢出至 upper airway，从而安全、稳定且可重复地诱导肺部炎症和纤维化。本次实验操作将由我们合作实验室的兽医 Fiorenza Orlando 博士进行演示。首先，将麻醉后的小鼠仰卧位放置在手术平台上。用手术胶带条轻轻固定其四肢以保持位置。为使小鼠颈部过度伸展，可在其颈椎部位下方放置支撑物（如牙科棉卷）。然后使用剃须刀片轻轻剃除喉部毛发。用一把解剖镊夹住皮肤。用一对环柄弯头钝头剪刀，在对应小鼠胸骨舌骨肌的位置做一长约0.5厘米的短切口。使用棉签止血。然后通过钝性分离将气管游离，并轻轻清除其周围的脂肪和其他组织。旋转手术平台，使小鼠头部朝向操作者，以便在注射时操作者能够正确调整注射器的角度。为了观察气管，将小鼠置于手术显微镜下。调节光源并将放大倍数设置在1至1.2之间，然后调节焦距和清晰度。气管可被清晰识别为一条白色半透明的管状结构，具有明显可见的气管环。轻轻吹打混匀博来霉素溶液，并吸取100微升至带有25号针头的0.5毫升注射器中，注意避免产生气泡。待气管清晰可见后，以30度角小心用针尖穿刺气管。缓慢将100微升博来霉素直接注入气管腔内。等待数秒，待全部液体流经针管后，将其从气管中取出。当针头正确插入气管时，可观察到数秒的呼吸暂停，表明液体已全部吸入。将注射器和针头安全弃置。使用5-0可吸收缝线闭合皮下筋膜和皮肤切口，并让动物恢复。再次麻醉小鼠并确认失去意识后，将小鼠置于无菌操作台中。通过面罩持续给予1.5%异氟烷以维持实验过程中的轻度麻醉状态。为促进血管扩张并便于注射，将尾巴浸入温水中两分钟。通过轻柔吹打混匀人脐带间充质基质细胞悬液，以避免细胞团块形成。用带有26号针头的1毫升注射器吸取200微升液体，注意避免产生气泡。用指尖捏住尾尖并轻轻拉直，然后找到尾部的侧静脉。用手术刀轻轻刮擦尾部，并用70%乙醇擦拭。从尾部远端开始，以15度角将针头插入静脉。缓慢注入200微升人脐带间充质基质细胞。为监测静脉注射是否成功，应观察液体无阻力地进入静脉，且无外渗现象。等待数秒，直至全部液体流至针管末端后，将针头从静脉中拔出。然后用无菌纱布短暂按压穿刺伤口，以防止出血，并让动物恢复。输注完成后，安全丢弃注射器和针头。经博来霉素注射后，通过苏木精-伊红及天狼星红染色评估肺部组织病理学改变，结果显示与生理盐水注射组相比，出现显著的炎性细胞浸润和纤维化。人脐带间充质基质细胞输注可显著减轻博来霉素诱导的肺部炎症和纤维化，而生理盐水则无此效果。通过羟脯氨酸检测法测定胶原沉积量。博来霉素注射后，羟脯氨酸水平从第8天到第14天和第21天逐渐升高。而人脐带间充质基质细胞的加入显著减轻

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠肺损伤的诱导,通过博霉素内切注射

使用模拟人类肺部疾病状况的模型对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。本文介绍了一种可将外源性物质直接递送至小鼠肺部的无创经气管插管方法。...

无创气管插管法研究小鼠肺部病理与生理

本文介绍了一种通过插管将博来霉素直接注入小鼠气管的快速简便方法。该方法的主要优点在于具有高度可重复性、易于掌握，且无需特殊设备或漫长的恢复时间。...

一种改进的小鼠气管快速插管方法

我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。...

一种基于显微CT与荧光分子断层成像的多模态成像方法用于小鼠博来霉素诱导肺纤维化的纵向评估

我们描述了一种通过预先对气道造成损伤以显著增强肺癌细胞在小鼠肺部原位移植效率的方法。该方法还可用于研究肺部微环境中的基质相互作用、肿瘤转移扩散、肺癌共病情况，以及更高效地建立患者来源的异种移植模型。...

用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

在小鼠中进行实验物质的气管内（IT）给药时，常导致药物在远端肺部的分布不对称。  本报告中，我们描述了一种直接支气管内（IB）给药方法，可在不进行手术的情况下对活体小鼠的每侧肺进行插管。...

直接支气管内给药以提高小鼠肺部靶向药物的沉积选择性

本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。...

通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤

已采用博来霉素建立多种肺纤维化动物模型，以阐明肺纤维化的发病机制并寻找新的药物靶点。然而，大多数针对肺组织的肺纤维化模型存在药物分布不均的问题。本文提出一种通过鼻腔雾化博来霉素诱导的均匀性肺纤维化模型。...

通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

本方案演示了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中应用的经口咽部吸入技术。...

小鼠肺纤维化模型中博来霉素的口咽部给药

细胞治疗通过使用祖细胞修复受损组织并改善肺功能，为肺纤维化提供了一种有前景的干预手段。由于影像学在追踪细胞整合过程中发挥关键作用，本文描述了一种磁性粒子成像引导的 体内...

影像引导 体内 利用磁性粒子成像技术追踪移植的远端肺上皮前体细胞治疗肺纤维化

本方案阐述了一种通过反复经口咽给予博来霉素在小鼠中诱导肺纤维化的方法，所产生的病理特征与特发性肺纤维化高度相似。...

改良的小鼠特发性肺纤维化模型

在此，我们介绍一种通过气溶胶化博来霉素递送在小鼠中建立肺纤维化模型的实验方案 通过 气管。该优化方法能够在无需手术切口的情况下实现均匀、定量且精确的递送，从而提高博来霉素诱导纤维化的可重复性和可靠性。...

一种改进的基于气溶胶的经气管博来霉素递送方法，用于建立可重复且微创的小鼠肺纤维化模型

了解通过博来霉素气管内注射诱导小鼠肺纤维化模型的方法，并评估人脐带间充质干细胞的抗纤维化效果。该方案为临床前抗纤维化治疗研究提供可靠平台。

经气管注射博来霉素诱导小鼠肺损伤

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