Name: 土壤联合粒径与密度的分离研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习联合粒径与密度分离法（CSDF）用于土壤科学研究，该方法通过物理分级分离土壤有机质与矿物复合物，揭示有机-矿物相互作用机制，为理解碳封存动态提供关键技术支持。

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本方法的开发得到了洛桑大学地球科学学院投资基金（FINV）的支持。我们感谢乌干达国家科学技术委员会和乌干达野生动物管理局批准我们采集研究样品。作者进一步感谢Thierry Adatte教授在CHN和XRD分析方面提供的帮助。我们感谢Erika Marin-Spiotta教授在经典密度分级分离技术方面提供的初始培训。我们还感谢实验室管理员Laetitia Monbaron在获取实验耗材和设备方面的协助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>将20克或更多的原状土壤风干并过2毫米筛。</li>
	<li>测定原状土壤的残余含水量（风干土壤中仍存在的水的质量），用于校正初始分组质量44。</li>
</ol>
2. 浓溶液的配制
<ol>
	<li>将多钨酸钠（SPT）分批加入已置于加热搅拌板上预热的去离子水（DI水，约60 °C）中，以获得所需密度的高密度溶液（即.，1.62 和 2.78 g·cm-3）。使用 表3 以估算水和SPT的使用比例。设置剧烈搅拌以促进SPT溶解。 
	警告：SPT 具有腐蚀性，吞食有害，可造成严重眼损伤。佩戴防护手套/护目镜。对水生生物有害并具有长期持续影响。避免向环境中释放。</li>
	<li>待溶液恢复至室温（20–25 °C）后，使用密度计检测最终密度。通过添加 SPT 或水调节密度。 
	注意：制备SPT时，略微提高其浓度（+0.02–0.05 g·cm⁻³）最为方便-3所需密度更高时，则稀释至所需密度。</li>
	<li>将SPT在室温下储存于塑料容器中。SPT已知会从玻璃器皿中析出钙，并形成不溶性偏钨酸钙沉淀。SPT还可能与低质量的不锈钢和陶瓷发生反应。避免将SPT储存数月，否则晶体将在局部过饱和点开始成核析出。</li>
</ol>
3. 轻组分（LF）分离
注意：在超声分散前（fLF），通过密度为 1.62 g·cm-3 的溶液浮选分离 LF；超声分散后（oLF）也进行浮选分离，超声能量为 280 J·mL-1。
<ol>
	<li>fLF 分离
	<ol>
		<li>称取5-8 g风干并过筛的土壤，置于50 mL锥形离心管中。记录土壤质量，精确至四位有效数字。 
		注意：每支试管中可加入的土壤量取决于土壤质地。通常，黏土应使用较少的量，而砂质土壤可使用较多的量。为了在每个组分中获得足够的物质，可对同一种土壤使用多个试管（通常使用两个）或使用较大的（250 mL）锥形瓶。通过一次预实验分步分离，可初步了解土壤在各组分中的分布情况，并据此调整初始土壤质量。</li>
		<li>使用量筒加入 35–40 mL SPT（1.62 g·cm⁻³）至 50 mL 离心管中-3）。土壤与溶液的比例应控制在1:5或更低。 
		注意：为防止团聚体崩解，可在加入溶液前通过毛细管上升法使土壤预先饱和42,45.</li>
		<li>平衡带盖离心管的总质量以进行离心。使用 SPT 溶液调整各管质量至相等。将离心管置于摇床上，200 rpm 振荡 10 分钟。 
		注意：对于团聚体稳定性较差的土壤，此步骤可用手动轻柔翻转代替6 或完全跳过42.</li>
		<li>将试管直立放置，静置至少30分钟，使内容物充分沉降。在2,500 x g条件下离心90分钟。 g 在摆动桶式离心机中离心，以实现游离乳铁蛋白（fLF）与沉淀物（“沉降”物质）之间的清晰分离。 
		注意：对于沙质或絮凝良好的样品，可缩短离心时间。不建议以接近离心机最大转速的条件进行离心，否则可能损坏转子轴。需注意大多数离心机并非设计用于处理密度远高于水的溶液。</li>
		<li>从离心机中非常小心地取出试管，避免任何震动。直立放置。 
		注意：此时可通过移液器吸取漂浮物与沉淀之间的5 mL澄清上清液并称重，以检测SPT的密度。如果土壤并非干燥状态，此步骤尤为重要。</li>
		<li>将所有漂浮和悬浮的物质（fLF）倒入一个250 mL的聚碳酸酯离心管中，确保沉淀物牢固地留在管底。</li>
		<li>将附着在管壁上的材料冲洗到同一个聚碳酸酯瓶中。使用装有去离子水的冲洗瓶，将离心管几乎倒置在聚碳酸酯瓶上方进行冲洗。注意不要扰动沉淀物。 
		注意：对于某些样品，沉淀物可能无法牢固地附着在管底，导致难以完全回收fLF。在此类情况下，可使用泵抽吸或大容量移液器辅助。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过超滤洗涤荧光素 
	注意：由于某些有机物的密度低于水，无法通过离心洗涤去除，因此采用超滤法对液态肥料（LFs）进行冲洗。超滤的一个局限性在于，亚微米级的分散胶体可能无法被截留。常用的滤膜孔径范围为0.2至1.2 μm。孔径较大的滤膜对胶体的截留效果可能较差，但更不易堵塞。本研究中采用0.45 μm的滤膜。
	<ol>
		<li>设置真空超滤装置，使用 0.45 μm 滤膜。先将滤膜略微润湿，并在拧紧漏斗前施加真空，以避免滤膜破损。</li>
		<li>将聚碳酸酯瓶中的内容物缓慢倒入真空过滤装置的漏斗中。确保溶液在滤膜上的液层深度不超过约1 cm。用少量液体冲洗聚碳酸酯瓶内残留物，并将冲洗液全部转移至过滤装置中。</li>
		<li>待所有溶液通过滤膜后，将其收集至标有“使用过的SPT”的塑料瓶中以回收利用。后续的冲洗液可直接倒入水槽中弃去。</li>
		<li>至少3次向过滤装置中加入10 mL以上的去离子水，以确保彻底去除SPT残留。冲洗时需注意清洗过滤漏斗的内壁。每次加水时在漏斗上做标记，以记录冲洗次数。 
		注意：可通过测量最后一次冲洗液的电导率来确认SPT是否完全去除。电导率应≤ 5 μS·cm-1 46.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收与保存fLF
	<ol>
		<li>解除过滤管路中的真空。</li>
		<li>从过滤装置上取下漏斗，使用装有去离子水的冲洗瓶，将粘附在漏斗内壁的物质转移至已标记的铝舟中。用镊子小心取出滤膜，使用装有去离子水的冲洗瓶将滤膜上的残留物冲洗至同一铝舟中。</li>
		<li>在不超过 65 °C 的条件下将舟样内容物干燥至恒重（完全蒸发后至少 48 h）。在装有新鲜干燥剂的干燥器中冷却至少 30 min。 
		注意：也可使用冷冻干燥机。</li>
		<li>用塑料刮刀轻轻刮下铝舟上的样品。如果样品与铝舟粘附较紧，可使用金属刮刀，注意避免刮伤铝舟。</li>
		<li>记录fLF的质量，保留四位有效数字，然后将样品放入储存瓶中。避免使用塑料瓶，因为静电会导致微小有机颗粒附着在瓶壁上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声处理释放oLF 
	注意：目标是通过超声处理破坏稳定的宏观聚集体和较大的微观聚集体，以释放被包埋的颗粒态有机质，同时尽量减少矿物吸附的聚合物的溶出或再分布。超声能量为 280 J·mL-1 此处选择了该参数。请参阅讨论部分中的“聚集体破坏策略”一节，以帮助确定超声能量的选择。
	<ol>
		<li>计算达到 280 J·mL 超声能量目标所需的时长-1 使用低振幅（例如.，30%）和20 kHz频率。 
		注意：每台超声仪应定期校准，以关联超声时间与能量输出；参见 North（1976）47 用于校准。</li>
		<li>加入 35–40 mL SPT（1.62 g·cm⁻³）溶液至离心管中-3) 加入离心管中，该离心管含有fLF提取所得的沉淀物。通过轻敲倒置的离心管并涡旋振荡重新悬浮沉淀。</li>
		<li>将超声探头插入溶液表面以下2 cm处，并将试管置于冰水中，以防止溶液整体温度升高。</li>
		<li>使用必要的超声时间使样品达到 280 J·mL 的目标能量-1始终优先选择低振幅和较长的超声时间。高振幅会导致轻质材料（如有机颗粒）沿探头向上滑动并溅出管外，造成样品损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>oLF 分离 
	<ol>
		<li>平衡带盖离心管的总质量以进行离心。使用1.62 g·cm-3 SPT 溶液。</li>
		<li>将试管直立放置，静置至少30分钟。以2,500 x g离心90分钟。 g 在摆桶式离心机中。</li>
		<li>将所有漂浮和悬浮的物质（oLF）倒入一个250 mL的聚碳酸酯离心管中。确保沉淀物牢固地停留在管底。</li>
		<li>将附着在管壁上的堵塞性轻质有机物冲洗到同一聚碳酸酯瓶中。使用装有去离子水的冲洗瓶，将试管几乎倒置在聚碳酸酯瓶上方进行冲洗。注意不要扰动附着在管底的沉淀物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过超滤洗涤嗅觉脂质体
	<ol>
		<li>设置真空超滤装置，使用 0.45 μm 滤膜。先将滤膜略微润湿，并在拧紧漏斗前施加真空，以避免滤膜破损。</li>
		<li>从聚碳酸酯瓶中倒入少量悬浮液至真空过滤装置的漏斗中。如果溶液不易通过，可加入去离子水稀释聚碳酸酯瓶中的内容物。 
		注意：有机物含量高（有颜色）的样品难以过滤。如果滤膜出现堵塞迹象，应设置第二个过滤装置或尝试使用加压过滤系统。另一种方法是将聚碳酸酯瓶中稀释后的样品进行离心；上清液因所含胶体和悬浮颗粒少于原始悬浮液，可更顺利地通过滤膜。沉淀物可重新悬浮于水中，并通过离心洗涤。最终，所有材料均需至少洗涤3次，并全部回收。</li>
		<li>将首次SPT滤液收集至标有“使用过的SPT”的塑料瓶中，以回收利用。后续冲洗液可排入水槽。</li>
		<li>用过滤装置将材料冲洗三次 &#62;10 mL 去离子水</li>
		<li>将 oLF 收集至铝舟中，在不超过 65 °C 的条件下干燥至恒重。储存方式与 fLF 相同（见步骤 3.3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 根据颗粒大小分离 hFs
注意：下一步是根据颗粒大小对步骤3得到的残余物（hF）进行分级。此处的粒径分界点设定为8 µm，得到黏粒+细粉粒组分（&#60; 8 µm）和粗粉粒+砂粒组分（&#62; 8 µm）。将黏粒和细粉粒归入较细组分，反映了这两种颗粒在土壤有机质吸附方面具有已知的亲和性33,48。此处的粒径分离采用沉降法（基于斯托克斯定律49）进行。对于50 µm或更大粒径的分界，可通过湿筛法实现分离，且不会造成过多的磨损或破坏有机-矿物复合体。
<ol>
	<li>去除 hF 中残留的 SPT
	<ol>
		<li>向含有第 4 步残留物的离心管中加入 35–40 mL 去离子水。通过倒置轻敲管壁并涡旋振荡重新悬浮残留物。在 2,500 × g 条件下离心 20 分钟。</li>
		<li>倾去上清液。若上清液呈现浑浊或乳白色，应收集并再次离心以沉淀胶体。将新形成的沉淀与第一次离心所得沉淀合并。 
		注意：如果第 3 步残留物中仍含有较大量的 SPT（例如上清液倾倒不完全），则可能需要多次清洗。在沉降前，悬浮液的密度应 &#60;1.1 g·cm-3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hF 的分散与沉降 
	注意：沉降前必须确保 hF 充分分散。我们采用超声处理而非化学分散剂，因为后者难以彻底清洗。斯托克斯定律要求恒定温度（例如 20 °C）。在超声前使用冷藏的悬浮液可有效防止过热。
	<ol>
		<li>向含有沉淀的离心管中加入冷藏的去离子水至 40 mL 刻度线。将离心管放入冰箱静置 30 分钟。</li>
		<li>以 75 J·mL-1 的能量进行超声处理。所需超声时间的计算方法同 3.4.1 步骤。</li>
		<li>用去离子水冲洗超声探头以回收全部样品。使用去离子水将离心管内液体体积调整至 50 mL 刻度线。检测悬浮液温度（应与计算沉降时间时所用的室温一致）。</li>
		<li>通过手动倒置混匀管内物质。静置沉降，时间应足以使 &#60; 8 µm 的颗粒完全沉降。根据斯托克斯定律，在 20 °C 条件下颗粒平均沉降距离为 7 cm 时，沉降时间为 20 分钟。</li>
		<li>用移液器将上清液（至 10 mL 刻度线）转移至另一 50 mL 离心管中。</li>
		<li>重复沉降步骤 3 次（步骤 4.2.1 – 4.2.5）。每次的上清液均收集至新的离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两种粒径组分的收集
	<ol>
		<li>将含有上清液的离心管置于 45 °C 烘箱中蒸发。注意不可完全干燥。当体积显著减少后，将三个上清液合并至一个 50 mL 离心管中，此即为 &#60; 8 µm 组分。</li>
		<li>将含有 &#60; 8 µm 组分的离心管以及含有 &#62; 8 µm 组分（来自步骤 5.2 的沉淀）的离心管重新放入 45 °C 烘箱中，蒸发剩余液体。注意不可完全干燥。 
		注意：应频繁检查烘箱，一旦管内无明显积液即刻取出样品。过度干燥可能导致强烈团聚，尤其在细颗粒组分中更为明显。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 根据密度分离两个尺寸组分
注意：此处对两种粒径组分均应用了密度分级。目的是将硅酸盐与氧化物分离，因此选择2.78 g·cm-3作为密度分界值。也可根据需要进行额外的分离。例如，使用密度为2.4 g·cm-3的溶液可实现高活性黏土与高岭石及原生硅酸盐的分离。需注意，较高的有机质含量会降低矿物颗粒的理论密度43。
<ol>
	<li>密度梯度离心 
	<ol>
		<li>加入35–40 mL密度为2.78 g·cm的SPT-3 向每个粒径组分中加入溶液。使用SPT溶液平衡离心管的质量以进行离心。</li>
		<li>通过倒置轻敲管壁并涡旋振荡重悬样品，在摇床中以200 rpm振荡至少4小时。 
		注意：该 &#60; 8 µm 组分难以充分重悬。若4小时后仍有团块存在，可置于摇床上过夜。不建议在非常浓稠的SPT溶液中进行超声处理。由于密度和黏度过高，超声能量难以有效传播。</li>
		<li>将试管直立放置，静置至少30分钟使内容物沉淀。在2,500 x g条件下离心90分钟。 g.</li>
		<li>倾倒所有漂浮和悬浮物质（&#60;2.78 g·cm-3 组分）转移至一个250 mL聚碳酸酯离心瓶中。确保沉淀（&#62; 2.78 g·cm-3 组分）仍牢固地沉积在管底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过离心洗涤四个人类成纤维细胞系 
	注意：经过密度分离后，我们获得了四种 hFs（hF1 至 hF4； 表 2）。每种样品均需通过离心洗涤以去除SPT。不建议对hFs采用超滤法（对于细组分hF3和hF4而言超滤不可行）。
	<ol>
		<li>转移 &#62; 2.78 g·cm-3 使用装有去离子水的洗瓶将沉淀转移至250 mL聚碳酸酯瓶中。</li>
		<li>向聚碳酸酯瓶中加入去离子水以降低密度，但液面不得超过200 mL刻度线。对所有组分均进行此操作。</li>
		<li>称量离心瓶及其瓶盖，并使用去离子水调整质量以达到平衡。检查是否未超过转子的最大负载。</li>
		<li>置于涡旋振荡器上重新悬浮样品。在5,000 x g条件下离心20分钟。 g.</li>
		<li>将上清液倾入“使用过的SPT”回收瓶中。后续的冲洗液可直接倒入水槽丢弃。 
		注意：倾析时需小心，避免丢失细小颗粒。一旦上清液中出现悬浮颗粒的痕迹（如漩涡状、碎片或浑浊现象），应立即停止倾析。</li>
		<li>将沉淀重悬于去离子水中（洗涤1），液面不超过200 mL刻度线。 
		注意：确保充分重悬至关重要，以防止SPT残留在颗粒之间。使用喷瓶的水流可最有效地悬浮附着在瓶壁上的细小颗粒。通过将瓶子倒置轻敲并涡旋振荡可重悬沉淀。如果样品仍无法完全重悬，可使用摇床。可采用低能量超声处理步骤（例如，75 J·mL⁻¹）辅助分散。-1也是可能的。</li>
		<li>重复洗涤步骤（5.2.3–5.2.6）两次（洗涤2和洗涤3）。</li>
		<li>通过称量10 mL上清液的重量来检测其密度；其密度应为 &#60; 1.01 g·cm-3. 如果上清液密度大于此值，则进行4次th 洗涤。</li>
		<li>使用 0.01 M NaCl 作为冲洗液进行最后一次洗涤，以防止胶体分散。彻底倾去最后一次冲洗液。</li>
		<li>收集hFs（沉淀物及瓶壁附着的细小颗粒）至铝舟中，在不超过105 °C的条件下干燥至恒重。储存方式与LFs相同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. SPT 的回收利用
注意：SPT 溶液可在使用后通过含活性炭和阳离子交换树脂的柱子进行回收再利用50。活性炭可吸附有机物，而钠饱和型阳离子交换树脂则可去除溶液中的钙离子及其他阳离子，并以钠离子替代。在将 SPT 溶液通过柱子前，我们先用过氧化氢对其进行消化处理，以确保彻底去除溶解的有机物。
<ol>
	<li>回收柱的安装与更换
	<ol>
		<li>在一根1,000 mL聚碳酸酯量筒底部钻5–8个直径约4–5 mm的小孔。</li>
		<li>将两张11 μm孔径的滤膜裁剪至合适尺寸，置于量筒底部。在滤膜上铺3–5 cm厚的玻璃棉，再加入8–10 cm的活性炭。 
		注意：由于大部分有机物已被H2O2消化去除，柱中活性炭的用量可较Six50建议的用量减少。</li>
		<li>再覆盖3–5 cm厚的玻璃棉，加入8–10 cm新的或再生的阳离子交换树脂，最后以3–5 cm厚的玻璃棉封顶。</li>
		<li>将柱体用夹具固定在金属支架上。在柱体顶部和底部安装带有2.5 μm孔径滤膜的大号塑料漏斗。底部漏斗通过管路连接至一个塑料瓶。</li>
		<li>首次使用前，用2 L去离子水冲洗柱体。</li>
		<li>当约10–15 L的SPT溶液通过后，更换活性炭并再生阳离子交换树脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SPT溶液的净化
	<ol>
		<li>将使用过的SPT溶液置于加热板上，磁力搅拌。每升使用过的SPT溶液加入15 mL 35% H2O2，在约60 °C条件下消化24小时。</li>
		<li>将SPT溶液从加热板上取下，在塑料容器中于室温静置至少7天。</li>
		<li>使溶液通过回收柱进行渗滤。每天更换漏斗中的滤膜。</li>
		<li>用约2 × 200 mL的去离子水冲洗柱体，以回收全部SPT溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蒸发浓缩
	<ol>
		<li>将回收的SPT溶液置于加热板上，磁力搅拌。每升SPT溶液加入15 mL 70%乙醇，以中和残留的氧化能力。过量乙醇在蒸发过程中会迅速挥发。</li>
		<li>在低温下加热蒸发溶液至所需密度。</li>
		<li>冷却溶液并检测密度，储存于塑料瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CSDF 实验的成功取决于方法中适当参数的选择，以便能够分离出组成相对均一的组分。以下将讨论在选择分级参数时的关键考虑因素。
fLF代表与矿物相互作用极小的有机质。该组分的提取需格外小心，因为将土壤与高密度溶液混合时，可能已经导致部分大团聚体破裂。然而，有研究表明，存在于大团聚体中的有机质可能与严格定义的fLF（stricto sensu）更为相似，而不同于通过高强度超声处理释放的oLF18。一些研究者甚至提出采用低强度超声步骤，以分离出自由态及与矿物弱结合的有机质库，该组分被称为“团聚体内的颗粒态有机质”（intra-aggregate particulate organic matter, iPOM）54。
为了释放被包蔽的有机质，已有多种技术可用于破坏土壤团聚体。其中应用最广泛的方法包括超声处理、玻璃珠振荡以及化学分散剂的使用33,62,63。本文选择超声处理，因其输出能量可精确控制，并被认为在样品中分布较为均匀。由于无需使用化学分散剂，超声处理可被视为对有机-矿物复合体相对保守的方法22, 33。然而，分散步骤仍然是最敏感的操作之一。一方面，分散作用过弱会导致团聚体保持完整，从而可能高估颗粒态有机碳（hF SOC）含量；另一方面，过于剧烈的分散可能通过部分破坏有机-矿物复合体，导致有机碳在不同组分间重新分布。有机质与砂粒之间的弱结合尤其容易受到这一过程的影响。由于团聚体内部的包蔽作用与表面吸附是连续发生的过程2，目前尚无完美解决方案。因此，超声处理的能量水平需根据土壤特性谨慎调整。Kaiser 和 Berhe64 发表了一篇极具参考价值的综述，提出了一种在土壤分散过程中最小化超声波引起假象的策略。
报道的超声能量范围为 60 至 5,000 J·mL-1。多个研究团队报道，100 J·mL-1 的能量足以破坏大团聚体并有效分散砂质土壤，而 500 J·mL-1 则可破坏较大的微团聚体，并实现对活性土壤的合理分散63,65,66,67,68。在物理分组方案中，可能无需完全分散粉粒和黏粒级的团聚体，因为在这些粒径范围内，保护机制很可能与吸附稳定化作用难以区分。在进行粒径或密度分组前，合理的分散目标可能是破坏大团聚体（&#62; 250 µm）和较大的微团聚体（&#62; 53 µm）。100 J·mL-1（砂质土壤）至 200 J·mL-1（壤质土壤）的能量可能是合适的选择。200 J·mL-1 的能量可能已经会提取出部分微生物代谢产物（推测为与矿物结合的）69，因此使用更高的超声能量应谨慎。然而，对于具有胶结团聚体的矿物活性土壤，可能需要高达 500 J·mL-1 的能量才能实现分散。关键在于，必须根据每种土壤类型及研究目标调整分散能量。最后，需要记住的是，即使在所谓的完全超声分散之后，黏粒级的微团聚体仍可能持续存在70。
物理分组技术在标准化过程中存在一个难点，即土壤中普遍存在的异质性，尤其是其矿物组成的差异。应根据已知或推断的土壤矿物学特性来选择重液，最终目标是分离出尽可能均质的组分。
在本文中，所使用的高密度溶液为 SPT - pH 371, 72。较低的 pH 值可最大限度减少可溶性有机化合物的损失。然而，密度分馏也可使用其他高密度溶液进行。历史上曾使用有机液体（如四溴乙烷、四氯甲烷），但因其卤代烃具有毒性，且会污染土壤有机质，现已逐渐被无机盐类（如碘化钠、SPT）取代。目前，SPT 是首选溶液，因其密度可在 1.0 至 3.1 g·cm-3 范围内调节，可循环利用，且毒性较低（除非被摄入）22, 50。主要生产商提供多种不同碳、氮污染水平的 SPT 产品等级。对于土壤的密度分馏，建议使用最纯净的等级，特别是当分馏组分需用于同位素组成分析时。
密度为 1.6 g·cm-3 的溶液传统上被用于分离轻质有机组分与矿物结合组分——例如参见 Golchin 等人21。尽管一些研究者认为密度为 1 g·cm-3（即水）的溶液已足以提取大部分轻组分73, 74，但也有研究者基于部分有机组分密度可达 1.60 g·cm-3 的观点，提出采用更高的密度切点，如 1.62 或 1.65 g·cm-3&#160;33,75,76。甚至有研究使用高达 1.85 g·cm-3 的密度50。在选择用于分离轻重组分的密度时，应注意并不存在完美的分离条件。实际上，较低的密度可能导致部分“轻质”有机物被归入重组分中，而较高的密度则可能导致部分矿物进入轻组分。当观察轻组分中的碳含量时，若其 SOC 含量低于 40–45%，即可提示存在一定程度的矿物污染。
对于重质组分，初步分析（如XRD）可揭示整个样品的矿物学特征60 并帮助确定能够区分土壤主要矿物组分的密度阈值，需注意高有机质含量会使矿物密度低于其理论值。类似地，对于颗粒大小分离，可采用质地分析77,78 有助于设定适当的界限。当顺序密度分级较为困难时，粒径分离作为对简单密度分级的补充尤为理想。例如，对于含有大量羟基氧化物和低活性黏土的土壤，样品易发生分散，难以在重液中实现清晰分离，此时粒径分离便显得尤为必要。此外，当需要分离密度相似但粒径不同的矿物时，也应采用粒径分离步骤。例如， 石英和伊利石
游离钙离子会与SPT反应生成不溶性的偏钨酸钙。因此，该方法不适用于含有大量结晶度差的成土碳酸盐的碱性土壤。只要样品与SPT接触时间不过长，少量低反应性碳酸盐不会干扰组分分离。偏钨酸钙沉淀会导致组分质量被高估。如果轻组分（LFs）需通过元素分析仪测定碳浓度，则该问题可被发现，但组分分离结果已受到干扰。
除了这些技术难题之外，密度分馏法（CSDF）（或任何物理分馏方法）的根本局限性在于：土壤中的活性矿物很少以独立的分离相存在，而是通常以包膜或胶结物的形式出现。在原本无活性的矿物（如石英）表面存在强吸附性但极薄的包膜时，可能导致对有机质-矿物结合关系的错误认识。因此，在解释结果时需格外谨慎，特别是对于那些反应活性主要由非晶质和氧化物相主导的土壤。对分馏组分进行进一步表征有助于减轻此类不确定性。尽管如此，CSDF等精细的物理分馏方法在揭示天然存在的有机质-矿物复合体组成方面具有无可比拟的优势。这类研究有望深化我们对土壤中最大有机质库——即矿物结合态有机质——的生物地球化学过程的理解。

土壤是一个复杂的系统，包含地质来源和生物来源的组分。研究这些组分之间的相互关系，是我们理解生态系统功能的核心基础1。特别是，有机质-矿物相互作用被认为在土壤有机质（SOM）动态过程中发挥关键作用2。目前，解析SOM动态过程是多个研究领域的热点课题。富含SOM的土壤通常表现出良好的内在肥力，同时也可能成为具有环境价值的碳封存途径3,4。
土壤中的有机质具有高度异质性，某些组分在数小时内即可发生周转，而另一些组分则可能存留数千年5。这种异质性的成因仍是颇具争议的课题，但普遍认为与矿物基质的结合尤为关键6,7，尤其是在底土层中8。因此，那些已知与有机组分密切结合的矿物相正受到越来越多的关注9,10,11。
土壤中含有多种矿物，这些矿物在定性和定量上对土壤有机质（SOM）具有不同的吸附潜力。研究表明，具有较大比表面积和/或高度活性表面的矿物对有机化合物具有较强的吸附能力4,12。在土壤中，次生矿物如高活性层状硅酸盐（例如蒙脱石）、铁氧化物氢氧化物以及结晶度较差的铝硅酸盐均被证实可显著参与某些有机化合物的吸附保护过程13,14,15,16,17。因此，根据矿物学差异将土壤分离成不同组分，有助于分离出功能上相对均一的有机质库。
本文旨在介绍一种根据组分分离有机-矿物复合体的方法，从而便于研究其特性。该方法结合了粒径和密度分级，将大量土壤物理分离为一系列不同组成的组分。联合粒径-密度分级法（CSDF）整合了两种有效的物理分级方法（颗粒粒径分离和密度分离），通过结合这两种方法，能够更清晰地揭示土壤中有机-矿物结合关系的特征。
有多种不同方法（化学、物理和/或生物化学方法）可用于确定整块土壤样品中的组分18，19。简单密度分级是一种物理分离方法，土壤科学家已广泛使用该方法研究土壤有机质（SOM）的动态变化（参见 Grunwald 等，2017 年及其中引用的文献）20。在其经典形式中，简单密度分级将密度低于某一阈值（通常为 1.6 至 1.85 g·cm-3）的物质——即轻组分（LF）与较重的物质——即重组分（hF）分离开。LF 有时进一步分为游离轻组分（fLF）和闭蓄态轻组分（oLF）21。
在许多土壤中，最大的土壤有机质（SOM）库存在于重液漂浮组分（hF）中22。通常认为，hF中的SOM比轻组分（LF）中的更稳定23，但研究表明其仍具有较高的组成异质性，可能也存在功能上的异质性18。这表明有必要进一步将hF分离为更均质的亚组分，以分离出具有不同生物地球化学特性（如滞留时间或功能）的SOM库。Sollins等人（2009年）所描述的逐级密度分馏法已被证明是一种有效的方法24；然而，仅基于密度的分离可能忽略因颗粒大小不同而导致的比表面积差异。例如，高岭石的密度与石英大致相同，但可根据其粒径分布进行分离（表1）。连续梯度密度分馏法（CSDF）同时考虑了颗粒大小因素，从而提高了分馏的分辨率。
基于物理、化学或生物化学特性的土壤有机质（SOM）组分分离已有较长历史。物理方法（如密度-粒径联合分离法，CSDF）依据土壤组分的物理特性，如颗粒或团聚体的大小或密度。化学方法包括对特定化合物或化合物类别进行选择性提取以及化学氧化。生物化学方法则依赖于在不同实验条件下微生物介导的氧化过程。化学和生物化学方法与物理方法基于不同的原理，目标也不同，但下文仍将简要回顾这些方法。
碱性提取法（例如使用氢氧化钠）是最早用于化学分离土壤有机组分的方法之一6现代化学方法分离土壤有机质（SOM）的示例包括：i）使用焦磷酸钠（Na-pyrophosphate）进行碱性提取，旨在分离与矿物结合的SOM；ii）盐酸（HCl）水解，旨在定量古老且稳定的SOM；iii）利用化学试剂选择性氧化，以降解游离态或不稳定的SOM。2尽管这些方法有助于深入了解功能上不同的有机质组分，但它们存在若干局限性。首先，提取过程可能不完善或不完全。例如，经典的碱提法仅能提取土壤有机碳（SOC）的50-70%6其次，分离产物可能无法代表实际存在的土壤有机质 原位 且可能难以分类5第三，这些化学方法只能在有限程度上揭示有机物与矿物之间的相互作用，因为其中许多方法无法保持有机物与矿物之间的原始结合状态。
生化提取包括培养实验，主要用于研究不稳定的和反应性强的土壤有机质（SOM）（参见 Strosser32 对生化方法的综述）。培养实验可被视为对生化需氧量的一种测定，直观上非常适合用于确定生物可利用的有机底物。然而，由于实验需要在与野外条件（温度、湿度、物理扰动、无新物质输入）不同的情况下进行长时间培养，因此将其结果外推至原位（in-situ）SOM 动态过程需格外谨慎。
与通常被认为具有转化性或破坏性的化学或生化方法相比，物理分级技术可被视为更具保护性22 （一个重要的例外是可溶性有机化合物，这些物质会在操作过程中流失）。在理想情况下，土壤物理组分可被视为田间固相土壤组分的“快照”，因而可能更直接地反映土壤有机质（SOM）的动态变化 原位33此外，该技术的非破坏性特点意味着可对组分进行后续表征，通过多种分析手段或依据化学与生物化学方法进一步分级。
土壤的物理分组并非新近提出的概念。关于物理分离技术的科学文献可追溯至20世纪中期。早在1965年就有研究报道了密度分组的应用34, 35。在同一时期及随后的几十年中，关于土壤有机质（SOM）动态及其与矿物相互作用的研究已在土壤科学领域广泛发表36,37,38,39。
基于密度、聚集体大小或颗粒大小的分离是目前最常用的物理分离方法。物理分离的主要挑战之一是分离出功能均一的土壤有机质（SOM）组分，即根据周转速率、大小或其他功能指标定义的组分。结合多种分离方法或标准（如组合密度与粒径分级法，CSDF）可能有助于提高土壤组分的功能分辨率；事实上，这些方法联合使用的趋势似乎日益普遍18,40,41,42,43。通过将能够获得不同有机质含量和矿物组成组分的逐级密度分离法，与能够反映比表面积差异的粒径分离法相结合，CSDF有望揭示土壤中有机质-矿物结合体的多样性及其功能。
CSDF 旨在将大量土壤样品按相对一致的矿物学和质地特性进行物理分组。此处采用的密度和颗粒大小分级阈值以及分散能量是基于我们的土壤类型选定的，但这些参数可根据待分离样品的性质及研究目的进行调整。在本示例中，我们选择采用一次分散处理、两次密度分级和一次粒径分级，最终将原始土壤分离为6个组分（表2）。图1 对该方法进行了概念性概述。本研究所处理的材料为热带土壤，但该方法同样适用于其他任何类型的土壤以及沉积物。CSDF 通常作为后续分析的预处理步骤，尽管各组分之间的物质分布本身已具有重要的信息价值。当应用于土壤时，CSDF 所获得的组分在以下两个方面存在差异：（1）矿物组成（矿物学和质地）；（2）土壤有机质（SOM）的浓度和组成。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;分步分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多钨酸钠</td><td>Sometu</td><td></td><td>推荐使用 SPT 0（低 C 和 N）。低等级的多钨酸盐可能污染样品。</td></tr><tr><td>密度计（1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3 g·cm&lt;sup&gt;-3&lt;/sup&gt;）</td><td>Allafrance</td><td></td><td>校准温度为 20 &amp;deg;C，例如 3050FG250/20-qp</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher</td><td></td><td>固定速度标准涡旋混合器，例如 02-215-410</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>VWR</td><td></td><td>Qsonica LLC - Q500 系统，配备标准探头 4220</td></tr><tr><td>超声破碎仪支架</td><td>VWR</td><td></td><td>大型夹持架</td></tr><tr><td>超声破碎仪隔音罩</td><td>VWR</td><td></td><td>隔音柜（可选）</td></tr><tr><td>水平转子离心机</td><td>Beckman</td><td></td><td>能够达到 4000 g 或更高的转速，配备可容纳 50 mL Falcon 管的转子</td></tr><tr><td>高速固定角转子离心机</td><td>Beckman</td><td></td><td>能够达到 7500 g 或更高的转速，配备可容纳 250 mL 瓶的转子</td></tr><tr><td>50 mL 离心 Falcon 管</td><td>Corning</td><td></td><td>例如 352070</td></tr><tr><td>250 mL 离心瓶</td><td>Beckman</td><td></td><td>推荐使用聚碳酸酯瓶（例如 352070），因其比其他塑料更透明。</td></tr><tr><td>真空过滤装置</td><td>Semadeni</td><td></td><td>聚砜可重复使用装置，例如 3029</td></tr><tr><td>聚丙烯软管</td><td>Semadeni</td><td></td><td>用于连接过滤装置与真空源</td></tr><tr><td>超滤膜片，孔径 0.45 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td></td><td>例如 HAWP04700</td></tr><tr><td>干燥器柜</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>三层搁板，例如 305317-0120</td></tr><tr><td>指示型干燥剂 Drierite</td><td>Millipore</td><td></td><td>蓝色 Drierite，例如 10276750</td></tr><tr><td>闪烁小瓶</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>高密度聚乙烯（HDPE），带分离盖，20 mL，例如 12341599</td></tr><tr><td>150 mL 铝舟（光滑边）</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;多钨酸钠回收柱&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>阳离子交换树脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Dowex&amp;reg; Marathon&amp;trade; C 钠型，强酸性，20-50 目</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Darco S-51，4-12 目</td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>滤纸，孔径 2.5 &amp;micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Whatman 42 号，例如 WHA1442150</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>试剂级。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>试剂级。</td></tr><tr><td>聚碳酸酯 1000 mL 量筒</td><td>Semadeni</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>支架和夹具</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>大号，双爪</td></tr><tr><td>聚丙烯软管</td><td>Semadeni</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>聚丙烯软管夹</td><td>Semadeni</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>聚丙烯漏斗</td><td>Semadeni</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>聚丙烯瓶（1 L，2 L）</td><td>Semadeni</td><td></td><td>任意型号。</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>任意型号。</td></tr></tbody></table>

结合土壤粒径与密度分级法研究有机质-矿物相互作用

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

结合粒径与密度的分步分离法（CSDF）是一种通过物理手段将土壤按颗粒大小和矿物组成差异分离成不同组分的方法。CSDF依赖于连续的密度分离和沉降步骤，以分离出（1）游离轻组分（未结合的有机质）、（2）包埋轻组分（被包裹在土壤团聚体中的未结合有机质）以及（3）数量可变的重组分（土壤矿物及其结合的有机质），这些重组分在组成上各不相同。若CSDF的参数（分散能量、密度截断值、沉降时间）选择得当，该方法可获得矿物组成相对均一的重组分。这些不同组分预期对有机质具有不同的络合能力，因此该方法可用于分离并研究有机质-矿物相互作用的本质。结合密度与粒径分离可比单纯的粒径或密度分离方法提供更高的分辨率，从而能够依据矿物学组成和颗粒大小（与表面积相关）两个标准对重组分进行区分。与其他物理分组方法类似，该方法相较于基于化学试剂的提取方法，可被视为对土壤结构扰动更小或更温和。然而，CSDF是一种耗时较长的方法，且某些组分所得物质量可能较少，限制了后续分析。在完成CSDF后，可对各组分进行矿物学组成、土壤有机碳浓度及有机质化学性质的分析。该方法可提供土壤样品中有机碳分布的定量信息，并揭示自然界中不同矿物相的吸附能力，从而为土壤中有机质-矿物相互作用的选择性特征提供机制性见解（即.，包括矿物种类和有机质类型。

联合粒径与密度分馏（CSDF）是一种通过物理方法将土壤按质地（颗粒大小）和矿物学（密度）差异分离成不同组分的方法。其目的是分离出对土壤有机质（SOM）具有不同反应活性的组分，以更深入地理解有机质-矿物相互作用及土壤有机质的动态变化过程。

结合粒径与密度分馏法（CSDF）是一种用于根据颗粒大小和矿物学差异对土壤进行物理分离的方法。CSDF ...

该方法是一种研究有机质-矿物相互作用的有趣途径，因为它可根据有机质与不同矿物的结合状态对土壤有机质进行分级。这是一种物理分级过程，意味着不会改变各组分的化学性质。因此，对组分的分析能够反映有机质-矿物复合体的自然组成特征。该方法在研究不同土壤将碳从大气中隔离储存的能力时非常有用。为分离游离轻组分，请在50毫升锥形离心管中称取5至8克风干过筛的土壤，记录土壤质量至四位有效数字。使用量筒加入 35 至 40 毫升多钨酸钠（SPT）。在密度为 1.62 克/立方厘米的条件下，于摆动桶式离心机中以 2500 ×g 离心 90 分钟，使游离轻组分与沉淀完全分离。将所有漂浮和悬浮物质倒入一个 250 毫升的聚碳酸酯离心管中。确保沉淀物牢固地停留在管底。将管壁上附着的材料冲洗至同一聚碳酸酯瓶中。使用装有去离子水的洗瓶，在聚碳酸酯瓶上方将近乎倒置的离心管进行冲洗。使用孔径为0.45微米的滤膜搭建真空超滤装置。将滤膜略微润湿，并在拧紧漏斗前先施加真空，以避免滤膜撕裂。缓慢将聚碳酸酯瓶中的内容物倒入真空过滤装置的漏斗中。将聚碳酸酯瓶中残留的任何残渣冲洗到过滤装置中。避免溶液在滤膜上的深度超过约一厘米。向过滤装置中加入10毫升以上的去离子水，至少重复三次，以确保完全去除SPT的所有残留痕迹。务必冲洗过滤漏斗的内壁。在解除过滤管路的真空后，将漏斗从过滤装置上取下。使用装有去离子水的冲洗瓶，将粘附在内壁上的物料收集到已标记的铝碗中。用镊子小心地提起滤膜，使用装有去离子水的冲洗瓶将滤膜上的物质冲洗至同一个铝制样品皿中。将样品皿中的内容物在不超过65摄氏度的条件下干燥至恒重。至少48小时后，将样品皿中的内容物置于装有新鲜干燥剂的干燥器中冷却至少30分钟。用塑料刮刀轻轻将物质从铝碗上刮下。记录游离轻组分的质量，保留四位有效数字，然后将样品放入储存小瓶中。为释放包埋的轻组分，向含有游离轻组分提取后沉淀物的离心管中加入 35 至 40 毫升密度为 1.62 克/立方厘米的 SPT 溶液。重悬沉淀。将超声探头插入溶液液面下两厘米处，并将试管置于冰水中，以防止溶液整体温度升高。根据所需时间对样品进行超声处理，直至达到每毫升280焦耳的目标能量。为分离被遮挡的光组分，在摆桶式离心机中以2500 ×g离心90分钟。将所有漂浮和悬浮的物质倒入一个250毫升的聚碳酸酯离心管中。确保沉淀物牢固地停留在管底。将附着在整根试管内壁上的堵塞性光敏有机物冲洗至之前使用的同一聚碳酸酯瓶中。向含有沉淀物的试管中加入冷藏的去离子水，直至液面达到40毫升刻度线。在每毫升75焦耳的条件下进行超声处理。静置溶液，直至粒径小于8微米的物质完全沉降。然后用移液器将上清液移出，直至剩余体积达到10毫升刻度线，收集至50毫升离心管中。将含有小于8微米组分以及大于8微米组分的离心管置于45摄氏度烘箱中，以蒸发残留的过量液体。进行密度分级时，向每个粒径组分中加入35至40毫升密度为2.78克/立方厘米的SPT溶液。重悬沉淀物，并在2500 × g条件下离心90分钟。然后，将所有漂浮物和悬浮物倒入250毫升聚碳酸酯离心管中，确保沉淀物牢固地留在管底。漂浮物与沉淀物之间可能难以获得清晰的分离。在此情况下，可尝试将上清液吸出至设定的液面高度。现在使用装有去离子水的冲洗瓶，将沉淀物转移至250毫升的聚碳酸酯瓶中。向聚碳酸酯瓶中加入去离子水以降低密度，但加水量不得超过200毫升刻度线。对所有组分进行此操作。将瓶子在5000 ×g 条件下离心20分钟后，将上清液倾倒至已使用的SPT罐中以回收利用。按照文本方案中所述的洗涤步骤操作后，将重质组分收集至铝碗中，该重质组分即为沉淀物以及附着在瓶壁上的细小颗粒。将重相组分在不超过105摄氏度的条件下干燥至恒重。重相组分的储存方式与轻相组分相同。不同采样点之间，物质质量在各组分中的分布表现出显著差异。通过粉末X射线衍射分析块体样品矿物学初步表明，在以石英和长石等原生硅酸盐为主的1号地点，大部分物质富集于重组分1中，该组分设计用于富集粗粒硅酸盐。矿物学分析显示，2号地点含有更高比例的层状硅酸盐，主要为高岭石。因此，设计用于富集细粒硅酸盐的重组分3在2号地点的物质含量高于1号地点。最后，3号采样点的氧化物含量最丰富，且在重液2中也表现出最多的物质，该重液的设计目的是富集粗颗粒氧化物。总体而言，数据表明该方法成功地将大量样品按其主要矿物学组分进行了物理分离。对于任何物理分离方案而言，根据具体的研究目标优化分离参数至关重要。务必进行预实验，并使用多个重复样本来验证结果的可重复性。尽管偏钨酸钠的毒性低于以往使用的溶液，但仍具有刺激性，若吞咽或吸入可能对人体有害。应避免其释放到环境中。分离后，可对不同组分进行矿物学以及有机质含量和组成的分析。这使我们能够了解有机-矿物复合体中矿物相和有机质相的特征。该方法可能为有机质的可降解性研究提供新的见解。事实上，所谓的难降解物质可能并非某种有机化合物本身的特性，而是其与不同矿物之间亲和力的表现。

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