Name: 宿主病原学反应及疫苗效果评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习体内评估疫苗效果与宿主免疫反应的方法，使用小鼠模型研究病原体感染后的细菌负荷与免疫应答。该技术适用于病毒、细菌或寄生虫疫苗模型的开发研究。

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本工作由1R01AI125560-01及俄亥俄州立大学的启动资金资助。

所有涉及活体动物的实验均依照美国俄亥俄州立大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行，并符合IACUC指南的要求。所有免疫和感染实验均使用C57BL/6小鼠。每组实验同时包含雄性和雌性小鼠，以符合美国国立卫生研究院（NIH）指南的要求。每组动物数量根据实验组间预期结果差异进行统计功效分析后确定。例如，在双样本t检验中，每组8只小鼠可在α = 0.05（双侧）时提供80%的统计功效，以检测出感兴趣结果的差异达到1.33个标准差（SDs）。
1. 小鼠免疫
<ol>
	<li>在无菌生理缓冲液（如生理盐水或DPS）中配制疫苗主混合液。 
	注意：混合液的总体积应比整个免疫组所需体积多出10%。疫苗组分的浓度详见步骤1.1.1和1.1.2。将物品置于冰上运送至动物房。
	<ol>
		<li>对于 B. pertussis 研究包括以下疫苗组：aPV 和 aPV + BcfA。此外，设置氢氧化铝佐剂对照组、单独疫苗抗原组（FHA 和 Prn）以及未免疫小鼠（naïve）作为对照组。 
		注意：aPV 为 1/5th 一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的无细胞百日咳疫苗（aPV），其组分包括破伤风类毒素、减量白喉类毒素、百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）和百日咳粘附素（Prn），以上成分吸附于铝盐。目前，人用百日咳aPV的单次剂量为0.5 mL，因此，1/5th 剂量为0.1 mL。aPV + BcfA的体积为0.1 mL的aPV（1/5）th 人体剂量）+ 每只小鼠0.046 mL BcfA（30 µg）。单块肌肉可安全注射的最大体积为0.1 mL。由于aPV + BcfA疫苗总体积超过0.1 mL，为确保安全接种，需将疫苗大致均等地注射至双侧肩部肌肉。</li>
		<li>制备实验性疫苗时，将1 µg FHA和0.5 µg Prn与50 µg氢氧化铝凝胶在无菌PBS中混合，配制成单剂量疫苗。将实验性aPV在室温（RT）下置于实验室滚轴混合器上混匀15分钟。随后，在4 °C条件下以18,000 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1 mL无菌PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在动物房中，安装麻醉机（图2). 
	注意：使用前确保氧气和异氟烷储罐中的含量充足。称量异氟烷废气吸收罐的重量，当其重量增加50 g时予以更换。</li>
	<li>彻底清洁生物安全柜（BSC），并将洁净的诱导室放入生物安全柜内。将麻醉机的麻醉气体输送管和废气清除管连接至诱导室。打开氧气瓶 通过 调节调节器以确保氧气流动，并将流量调至1.5–2 L/min。</li>
	<li>将所需年龄（6-12周）的小鼠放入诱导室中。开启异氟烷至2.5%-3%，以使小鼠轻度麻醉。持续观察动物，直至其在诱导室内停止活动且呼吸变慢。</li>
	<li>通过捏脚趾测试诱导程度，观察是否有反射性动作。若无反射性动作，则小鼠可进行注射。 
	注意：本实验中，动物整个笼具一次性进行麻醉。也可选择对动物 individually 进行麻醉后再注射，或在无麻醉状态下直接注射。上述任一方法均适用。</li>
	<li>同时，用1 mL胰岛素注射器（28G1/2）每支吸取0.1 mL疫苗备用。当动物完全麻醉后，从麻醉舱中取出一只动物，将小鼠腹侧朝下置于毛巾或实验台垫上。</li>
	<li>以45°角将注射器刺入小鼠三角肌，针尖斜面朝上，进针深度约5 mm，随后注射疫苗。 
	注意：可使用后肢/侧腹部作为注射部位，替代三角肌。</li>
	<li>注射后，将针头在肌肉内保留约5-10秒。注射液推注完毕后，将注射器旋转180°，使针尖斜面朝外，以形成密封并防止疫苗外漏。随后，缓慢将针头从注射部位拔出。</li>
	<li>将小鼠放回笼中。对指定组内的所有动物重复该操作。</li>
	<li>关闭异氟烷，用氧气冲洗诱导室，然后对下一笼小鼠进行麻醉。</li>
	<li>监测动物直至全部清醒并在笼内活动，然后将笼子放回饲养位置。</li>
	<li>接种后每12小时监测动物一次，持续至48小时，观察发病的临床症状，如毛发粗糙或蓬乱、步态迟缓或呼吸困难。若症状持续，应咨询机构兽医，并根据需要将小鼠移出实验。</li>
	<li>初次免疫4周后，通过麻醉小鼠并向其右侧三角肌注射与之前相同的疫苗制剂来加强免疫。</li>
	<li>再次监测动物是否有任何临床症状。将动物继续饲养两周后，再进行感染实验。</li>
</ol>
2. 百日咳杆菌（B. pertussis）菌株的培养及感染接种物的制备
<ol>
	<li>从冻存菌种开始 [在15%甘油中于-80 °C 冻存，来自Stainer-Scholte (SS) 培养基中浮游培养的菌液]12]，划线接种 B. pertussis 在Bordet-Gengou（BG）琼脂上13 添加10%脱纤维绵羊血和100 µg/mL链霉素（10% BG + Sm）的平板用于筛选。37 °C培养4天。</li>
	<li>从平板上挑取约8-10个单菌落，接种于3 mL SS培养基中，培养基中添加22.8 mM L-半胱氨酸、3.6 mM 硫酸亚铁、3.3 mM 烟酸、48.8 mM 谷胱甘肽、227 mM 抗坏血酸、1 mg/mL 七环糊精（heptakis）和100 µg/mL 链霉素。将培养物置于37 °C、60 rpm的摇床中培养16-24小时。</li>
	<li>第二天，将原代培养物用3 mL补充SS培养基按1:600、1:300、1:120、1:60、1:30和1:15比例稀释。在37 °C、60 rpm转速的滚筒摇床中孵育16–24小时。</li>
	<li>在600 nm处进行光密度（OD）测定600）进行细菌培养。使用分光光度计比色皿，将0.1 mL液体培养物加入0.9 mL无菌PBS中，稀释10倍。</li>
	<li>选择一个 OD 值适宜的培养物600≈ 0.8–1.2。计算获得 1 OD 所需的体积（图3). 在1.5 mL微量离心管中，于25 °C、6000 × g条件下离心5分钟，沉淀菌体。吸除上清液，将细菌沉淀重悬于1 mL无菌PBS中，调整菌液浓度至1 OD/mL [1–3 × 10⁸ CFU/mL]。9 菌落形成单位（CFU）/mL</li>
	<li>准备约 5 x 10⁶ CFU/mL 的接种物5 至 1.5 × 106 每只小鼠40-50 µL，涡旋混匀，并将步骤2.5中的细菌溶液用1 mL无菌PBS进行100倍系列稀释，以获得约1-3 × 107 CFUs/mL (图4A将接种物置于冰上运输至动物房。</li>
</ol>
3. 小鼠鼻内感染模型
<ol>
	<li>在动物房中，按照步骤 1.3 和 1.4 所述设置氧气和麻醉条件。如步骤 1.5 所述，将小鼠放入麻醉舱中进行麻醉。持续监测动物，直至麻醉生效。</li>
	<li>当小鼠进入麻醉状态后，逐只从诱导舱中取出。用手抓住小鼠背部肩胛骨后方的颈部皮肤，将其固定。将小鼠保持直立姿势，以便接触其鼻部。</li>
	<li>使用 200 µL 移液器吸头，缓慢将 40–50 µL 细菌接种物滴加至小鼠鼻孔（每侧鼻孔 20–25 µL）。握住小鼠，直至全部接种物被吸入。若部分接种物以气泡形式溢出，应收集气泡并重新滴入鼻孔。对一组小鼠给予等量无菌 PBS 作为阴性对照。</li>
	<li>参照步骤 1.10–1.12 的操作，将接种后的小鼠放回笼中，并监测其状态，直至清醒并能够活动。随后将笼子放回架子上原来的饲养位置。在对下一组动物进行麻醉前，用氧气冲洗诱导舱，以清除残留的异氟烷。接种后持续监测动物 48 小时。</li>
	<li>在实验室中，将接种物用无菌 PBS 进行系列稀释后涂布平板，以验证实际递送至小鼠的菌落形成单位（CFU）数量。取 0.1 mL 稀释液涂布于 10% BG + Sm 平板上（图 4A）。将平板置于 37 °C 培养箱中，培养 4 天。计数并计算递送至小鼠的接种物中的 CFU 数量（图 4B）。</li>
</ol>
4. 感染后动物组织的采集
<ol>
	<li>准备小鼠解剖和组织采集。
	<ol>
		<li>将处理组织所需的所有工具（粗剪刀、细剪刀、弯头剪刀、精细镊子、研磨杵、三角刮刀）在高压灭菌器中进行灭菌。将工具密封于灭菌袋中。用铝箔包裹玻璃Dounce匀浆器，并贴上高压灭菌指示胶带以确认灭菌状态。</li>
		<li>在组织采集前1至2天制备琼脂平板，确保使用前平板已完全凝固。对于B. pertussis，使用10% BG + Sm平板。根据每个实验的经验确定稀释度，并为每只小鼠的鼻中隔、气管和肺部分别标记相应平板。</li>
		<li>准备并标记CFU稀释管。根据待处理器官数量及每个器官所需的稀释倍数，在无菌1.5 mL离心管中加入0.9 mL无菌PBS。</li>
		<li>准备并标记组织收集管：
		<ol>
			<li>鼻中隔和气管：在无菌1.5 mL离心管中加入0.3 mL含1%酪蛋白（无Ca2+和Mg2+）的PBS。4 °C保存。</li>
			<li>肺：在无菌15 mL锥形管中加入2 mL含1%酪蛋白的PBS，4 °C保存。若用于组织学取材，则另加2 mL 10%中性缓冲福尔马林（NBF），室温保存。</li>
			<li>脾脏：在15 mL锥形管中加入3 mL RPMI + 5% FBS，4 °C保存。</li>
			<li>血液：标记两组无菌1.5 mL离心管，分别用于全血和血清收集。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>应现配新鲜70%乙醇，用于填充烧杯和喷雾瓶，以供解剖使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在采集当天，将所有材料用推车运送至动物房。清洁生物安全柜，并按照步骤1.3和1.4设置麻醉设备。</li>
	<li>将待解剖小鼠放入诱导室，通入氧气后，打开异氟烷至5%，待动物失去意识后，逐只取出，并采用颈椎脱位法作为辅助手段确保死亡。&#160;颈椎脱位后，应通过呼吸频率消失和/或撤退反射消失（脚趾夹捏测试）确认安乐死完成。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于解剖板上，展开四肢并用针固定。用70%乙醇喷洒小鼠体表。</li>
	<li>用镊子夹住腹部下方、骨盆中央的皮肤，用锋利剪刀沿中线向上剪至下颌。随后，闭合剪刀并以小幅度动作将皮肤与腹膜壁分离。将皮肤向两侧翻开，为无菌器官采集提供无障碍操作视野。</li>
	<li>用镊子夹住剑突下方完整腹膜（位于肝脏处或其附近），剪开腹膜并向肋弓方向切开。暴露下消化道，将结肠移向左侧以显露脾脏。用弯头镊夹住脾脏，用剪刀分离周围结缔组织。将脾脏放入含3 mL RPMI + 5% FBS的15 mL锥形管中，并将管置于冰上。</li>
	<li>用镊子在剑突处固定胸廓，剪开膈肌。肺部应自然塌陷并向脊柱方向下垂。沿两侧剪开胸廓以移除胸骨板。</li>
	<li>分离并取出右肺上叶14，切断肺动脉和静脉。将该肺叶放入含10% NBF的15 mL锥形管中，室温放置至少24小时以固定组织。分离右肺其余肺叶及左肺，放入含2 mL含1%酪蛋白PBS的15 mL锥形管中，并置于冰上。</li>
	<li>在切断肺静脉和动脉以取出肺组织后，允许胸腔充血以完成放血。使用带吸头的1 mL移液器吸取血液，转移至预先标记的1.5 mL离心管中，并将管置于冰上。</li>
	<li>从颈部开始，去除覆盖气管的软组织（腮腺、舌下腺、颌下腺及淋巴结）。打开并移除气管周围的保护膜。使用精细镊子和剪刀小心地从锁骨上方至下颌底部将气管与食管及其他结缔组织分离。</li>
	<li>用镊子夹住气管，在锁骨上方剪断气管。向下牵拉气管以最大限度拉伸，然后在喉部上方、下颌底部剪断，尽可能完整地分离气管（约1 cm）。将组织放入预先标记、含0.3 mL含1%酪蛋白PBS的1.5 mL离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>解除固定，将小鼠转为俯卧位，使头部朝向研究人员以便清晰暴露鼻部。用70%乙醇喷洒小鼠头部，并用手握住颅骨后方。</li>
	<li>用剪刀从鼻底开始向上剪除鼻部软组织。同时去除鼻周毛发、皮肤和触须。然后用镊子和弯头剪刀将剪刀尖端插入鼻孔，弯曲方向朝外，沿向眼方向剪开鼻腔通道，形成V形切口。</li>
	<li>用精细镊子收集V形切口内暴露的鼻中隔及周围软组织。将组织放入预先标记、含0.3 mL含1%酪蛋白PBS的1.5 mL离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>将尸体放入生物危害袋中丢弃。在解剖下一只动物前，先用去离子水冲洗工具，再将其浸入盛有70%乙醇的烧杯中。取出工具，甩去多余乙醇后，继续下一次解剖。</li>
	<li>按照步骤4.3–4.14依次解剖每只小鼠。</li>
	<li>按以下方法处理采集的组织。</li>
</ol>
5. 脾脏的处理
<ol>
	<li>为解离脾脏，将70 µm细胞滤器置于60 mm组织培养皿中。将脾脏及伴随的培养基倒入滤器中，使用3 mL注射器的推杆轻轻碾压组织，小心地将器官完全解离并使其通过细胞滤器过滤。</li>
	<li>用3 mL RPMI + 5% FBS冲洗滤器，将洗液收集至组织培养皿中。收集细胞悬液并转移至原有的15 mL离心管中。在4 °C条件下以450 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除或倾倒上清液，并通过加入2 mL氯化铵钾（ACK）缓冲液（150 mM氯化铵、10 mM碳酸氢钾、0.1 mM EDTA钠盐）重悬沉淀，以裂解红细胞。室温（25 °C）孵育3分钟。</li>
	<li>用RPMI + 5% FBS将管内液体补至8 mL，在4 °C条件下以450 × g离心5分钟。吸除或倾倒上清液。将细胞沉淀重悬于5 mL RPMI + 5% FBS中，使用血细胞计数板和显微镜计数脾细胞。</li>
	<li>根据细胞浓度计算每孔接种2.5 × 106个细胞所需的体积。在48孔板中，每孔加入0.5 mL T细胞培养基（RPMI 1640 + 10% FBS、10 µg/mL庆大霉素、50 µM β-巯基乙醇）进行细胞接种。</li>
	<li>根据上述计算结果，取所需体积的细胞悬液转移至新的离心管中，在4 °C条件下以450 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于所需体积的T细胞培养基中。在B. pertussis感染模型中，检测疫苗抗原——百日咳粘附素（Prn）和丝状血凝素（FHA）的抗原特异性细胞因子反应。因此需设置三种处理组：1）无刺激（NS，作为阴性对照）；2）Prn；3）FHA。每组实验需1.5 mL T细胞培养基中含7.5 × 106个细胞（即每0.5 mL含2.5 × 106个细胞）。</li>
	<li>将0.5 mL细胞悬液分装至48孔板中。</li>
	<li>为刺激细胞，先将抗原用T细胞培养基配制成目标浓度2倍的刺激液。Prn和FHA的终浓度分别为1 µg/mL和0.5 µg/mL，因此需在0.5 mL中分别加入2 µg/mL Prn或1 µg/mL FHA。随后将0.5 mL刺激液加入指定孔中，使抗原处理液在每孔终体积1 mL中被稀释至1×浓度。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。第7天收集上清液，将0.5 mL上清液分装至预先标记的微量离心管中。将样品储存于-20 °C，待后续通过ELISA检测抗原特异性细胞因子（图6）。</li>
</ol>
6. 肺组织的处理
<ol>
	<li>将肺组织（置于2 mL含1%酪蛋白的PBS溶液中）转移至无菌的15 mL Dounce匀浆器中。使用研杵充分匀浆组织，直至无明显大块组织残留。将匀浆后的悬液重新转移回原15 mL离心管中。</li>
	<li>取0.3 mL匀浆液用于菌落形成单位（CFU）涂板，其余匀浆液于4 °C条件下以450 × g离心5分钟。收集上清液，并以每管0.5 mL分装至预先标记的微量离心管中。将样品储存于-20 °C，待后续通过ELISA检测细胞因子。</li>
	<li>将0.1 mL肺组织匀浆悬液依次加入稀释管（含0.9 mL无菌PBS）中进行系列稀释。根据经验选择合适的稀释度，取0.1 mL涂布于预先标记的10% BG + Sm平板上，并使用无菌三角涂布棒均匀涂布。</li>
	<li>将平板置于室温空气中，37 °C培养4天。</li>
	<li>计数并计算每肺组织的菌落形成单位（CFU）（图6）。简而言之，将所获得的CFU数值乘以平板对应的稀释倍数，再乘以器官匀浆的总体积。随后将每只动物的CFU数值转换为Log10值并作图。
	<ol>
		<li>含有30–300个菌落的平板易于准确计数。菌落数少于6个的平板不应用于计算，因菌落数过低会引入较大误差15。为确定检测下限，将器官匀浆的总体积除以从未稀释匀浆液中涂布到平板的体积（例如，2 mL总体积除以0.1 mL未稀释匀浆液体积，得到可检测的最低限值为20 CFU）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 鼻中隔和气管的处理
<ol>
	<li>使用0.3 mL的1% PBS/酪蛋白溶液，采用带研磨杵的无线电动匀浆器对组织进行匀浆。匀浆0.5-1分钟，直至组织基本解离。细菌应释放到悬浮液中。</li>
	<li>将0.1 mL匀浆液加入含有0.9 mL无菌PBS的稀释管中，通过系列稀释法制备所需的10倍梯度稀释液。取每种稀释液0.1 mL点样于预先标记的10% BG + Sm平板上，并使用经70%乙醇清洗并火焰灭菌的三角涂布棒将悬浮液涂布均匀。</li>
	<li>将平板置于37 °C空气中培养4天。</li>
	<li>按照步骤6.5的方法计数并计算每器官菌落形成单位（CFU/器官）（图6）。为获得检测下限，将组织匀浆的总体积除以从未稀释匀浆液中点样至平板的体积（例如，0.3 mL总容积除以0.1 mL未稀释样品，得到可检测的最低限值为3 CFU）。</li>
</ol>
8. 血液处理
<ol>
	<li>将含有分离全血的试管在 4 °C 条件下以 18,000 x g 离心 30 分钟，使红细胞沉淀。</li>
	<li>小心移除血清上清液，并用移液器转移至预先标记的血清微量离心管中。将管子储存于 -20 °C，直至进行后续下游分析即总Ig及特异性Ig ELISA</li>
</ol>

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<li>Martinez de Tejada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neither+the+Bvg-+phase+nor+the+vrg6+locus+of+Bordetella+pertussis+is+required+for+respiratory+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).</li>
<li>Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+mediates+vaccine-induced+protective+cellular+immunity+to+Bordetella+pertussis%3A+role+of+IL-17-producing+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells.</a> Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).</li>
<li>Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+Bordetella+pertussis+in+mice+in+the+absence+of+detectable+circulating+antibody%3A+implications+for+long-term+immunity+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).</li>
<li>Karlsson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ELISPOT+and+cytokine+flow+cytometry+assays+for+the+enumeration+of+antigen-specific+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells.</a> Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).</li>
<li>Hagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Multi-Donor+Study+of+IFNgamma+Secretion+and+Expression+by+Human+PBMCs+Using+ELISPOT+Side-by-Side+with+ELISA+and+Flow+Cytometry+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays.</a> Cells. 4 (1), 84-95 (2015).</li>
<li>Raeven, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+signatures+underlying+superior+immunity+against+Bordetella+pertussis+upon+pulmonary+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination.</a> Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述用于研究疫苗诱导的针对B. pertussis感染免疫反应的综合方案，也可用于评估宿主对多种其他病原体的免疫应答。该方案介绍了疫苗接种的实施方法、病原体攻击后疫苗效力的测定方法，以及免疫功能的平行分析方法。在将该方案调整用于研究其他病原体时，需修改若干参数，包括但不限于动物麻醉方式、疫苗成分、剂量和接种途径。此外，所研究病原体的攻击剂量与接种途径、选定的组织采集部位，以及免疫应答的后续检测方法，也均可根据特定病原体或疾病的研究需求进行调整。
B. pertussis 感染的小鼠模型被广泛使用，是研究百日咳杆菌致病机制和疫苗学的优秀模型16,17,18,19,20。小鼠模型在许多方面与人类感染具有相似性，包括：i）细菌...

疫苗是20世纪公共卫生领域最伟大的成就之一，但我们仍未完全理解成功疫苗激发保护性免疫的分子机制。分子特征谱（例如细胞激活标志物、细胞亚群扩增以及疫苗接种后诱导的基因表达模式，为预测和产生有效的免疫应答提供了大量信息。宿主与病原体相互作用的复杂性无法通过现有模型充分复制 体外 细胞培养系统1. 体内 疫苗模型旨在同时评估宿主内多种免疫细胞类型，这在表征疫苗抗原的加工与呈递、不同细胞因子的分泌以及免疫细胞扩增时具有优势。本文所述方案提供了一种通过评估系统性和局部免疫应答以及定量目标组织中的病原体负荷来确定疫苗效力的详细方法。此处提供的示例用于测试针对某种病原体的实验性疫苗的效力 百日咳鲍特菌 (B. pertussis).
B. pertussis 是一种革兰氏阴性细菌，是呼吸道疾病百日咳（pertussis）的致病原2,3。与感染者（有症状或无症状）密切接触会导致病原传播、定植及发病。尽管全球疫苗接种覆盖率较高4，百日咳在世界许多国家仍被视为一种再度出现的疾病，并且是可预防的儿童死亡的主要原因之一5,6,7,8。2015年，B. pertussis 及百日咳被纳入美国国家过敏与传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID）公布的新兴传染病病原/疾病名单，凸显了开发一种能够提供持久保护性免疫的新疫苗的迫切需求。
目前，控制百日咳再现的一个活跃研究领域是开发下一代无细胞百日咳疫苗（aPV），该疫苗需包含新型佐剂与抗原的最佳组合，以模拟全细胞百日咳疫苗（wPV）所诱导的免疫反应9。利用本方案，我们近期报道了通过添加一种新型佐剂——百日咳杆菌定植因子A（BcfA），对现有美国食品药品监督管理局（FDA）批准的aPV进行改良后，可更有效地减少小鼠肺部的B. pertussis细菌载量10,11。这种增强的保护作用伴随着由铝佐剂诱导的Th1/Th2免疫反应向更具保护性的Th1/Th17免疫谱型的偏移10。本方案详尽而全面，使研究人员能够通过同时评估宿主对多种病原体的免疫反应，获得最大限度的信息。
此处所述方案遵循图示的代表性疫苗接种时间表， 图1，以确保最佳的宿主免疫反应。

<table><tbody><tr><td>2L 诱导室</td><td>Vet Equip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>Vet One</td><td>V1 501017</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>Bordet Gengou 琼脂基础</td><td>BD bioscience</td><td>248200</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma</td><td>C-7078</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>VWR</td><td>J851-500G</td><td>Strainer Scholte (SS) 培养基组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Research Products Int</td><td>G36020-500</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Research Products Int</td><td>P50200-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Fisher</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td><td>Fisher</td><td>BP376-100</td><td>SS 培养基补充剂</td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁</td><td>Sigma</td><td>F-7002</td><td></td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Research Products Int</td><td>N20080-100</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Research Products Int</td><td>G22010-25</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Research Products Int</td><td>A50040-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442-500mL</td><td>&amp;nbsp;美国来源，非热灭活</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>15mL Dounce 组织研磨器</td><td>Wheaton</td><td>357544</td><td>任何类似品牌均可</td></tr><tr><td>无线手持匀浆器</td><td>Kontes/Sigma&amp;nbsp;</td><td>Z359971-1EA</td><td>任何类似品牌均可</td></tr><tr><td>器械——剪刀、弯头剪、镊子、精细镊子、三角涂布棒</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>3mL 注射器</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>15mL 锥形管</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 微量离心管</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>70μm 细胞筛</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>60mm 培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>48 孔组织培养板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>1mL 胰岛素注射器 28G 1/2</td><td>Fisher Scientific/Excel Int.</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IFN-γ ELISA Ready-SET-Go! 试剂盒</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-21</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-17 ELISA Ready-SET-Go! 试剂盒</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-77</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-5 ELISA Ready-SET-Go! 试剂盒</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-172-09</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠中宿主-病原体反应及疫苗效力的评估

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

疫苗是一种20th 世纪医学奇迹。它们显著降低了传染病导致的发病率和死亡率，并推动了全球预期寿命的显著增长。然而，确定疫苗的有效性仍是一项挑战。新兴证据表明，目前的无细胞疫苗（aPV）在预防某些感染方面存在局限性。 百日咳鲍特菌 (B. pertussis）会引发次优免疫反应。因此，一个主要挑战是设计下一代疫苗，以在不产生全细胞疫苗（wPV）不良副作用的前提下诱导保护性免疫。本文描述了一种我们用于评估一种有前景的新型佐剂有效性的方案，该佐剂可使免疫反应偏向具有保护性的Th1/Th17表型，并促进更有效地清除病原体 B. pertussis 来自小鼠呼吸道的攻毒挑战。本文描述了小鼠免疫接种、细菌接种、组织采集以及免疫应答分析的实验方案。利用该方法，在本研究模型中，我们成功阐明了一种有前景的下一代无细胞百日咳疫苗所诱导的关键免疫机制。该方法可应用于任何传染病模型，以评估疫苗的有效性。

本文所述模型展示了一种用于评估宿主-病原体相互作用过程中疫苗效力及免疫应答的方法。图1展示了用于小鼠免疫、感染及组织采集分析的代表性疫苗接种方案。图2展示了所采用的麻醉系统的设置，该系统用于对小鼠进行麻醉，以便研究人员实施免疫接种和细菌接种。图3展示了为制备用于小鼠接种的100倍稀释细菌接种物而进行的OD600测量与计算示例，以获得1 OD的细菌悬液。图4展示了用于感染的接种物制备过程、系列稀释的涂布方案，以及基于系列稀释涂布结果对递送至小鼠的菌落形成单位（CFU）进行计数的示例计算方法。图5展示了疫苗抗原FHA刺激7天后诱导的抗原特异性回忆应答。联合疫苗组（Alum/FHA/BcfA）免疫的小鼠脾细胞产生IFNγ和IL-17，同时显著下调IL-5的表达。...

本文介绍了一种简洁的实验方案 体内 评估疫苗有效性和宿主免疫反应。该方案可适用于研究病毒、细菌或寄生虫病原体的疫苗模型。

疫苗是20世纪的医学奇迹。它们显著降低了由传染病引起的发病率和死亡率，并有助于……

该方案可用于评估宿主对多种病原体及疫苗制剂的反应。此技术的主要优势在于，它能够在可操作的动物模型中，对细菌载量和免疫应答进行体内评估。本实验操作由本实验室的研究生 Kacy Yount 示范。进行免疫接种时，确认麻醉后的6至12周龄小鼠对脚趾夹捏无反应，用感兴趣的疫苗0.1毫升填充一支带有28.5号针头的1毫升胰岛素注射器。将注射器以45度角持握，针尖斜面朝上，将针头插入小鼠三角肌约5毫米，注入疫苗。保持针头在肌肉内5至10秒，然后将注射器旋转180度，使针尖斜面朝下，以形成密封并防止疫苗外漏，再缓慢将针头从注射部位拔出。然后将小鼠放回笼中，并进行监测，直至完全恢复。加强免疫约两周后，感染已免疫的小鼠。抓住一只麻醉后小鼠背部肩胛骨后方及颈部的皮肤，使其直立，以便接触鼻部。使用200微升移液枪头，缓慢地将20至25微升目标细菌接种物滴加到动物的每个鼻孔中，并固定小鼠直至全部接种物被吸入。随后，向一组小鼠给予等体积的无菌PBS作为阴性对照。在适当的实验终点，将感染的小鼠仰卧置于解剖板上，并固定其四肢。用70%乙醇润湿尸体，用镊子夹住骨盆中心腹部下方的皮肤。使用锋利的剪刀，从该处垂直剪至下颌，分离皮肤与腹膜壁。将皮肤向尸体两侧翻开，以获得无遮挡的无菌器官采集视野，并夹住肋骨下方完整腹膜，位置在肝脏处或靠近肝脏处。沿肋骨方向切开腹膜以暴露下消化道，并将结肠向左移动以显露脾脏。使用弯头镊子夹住脾脏，用剪刀剥离周围的结缔组织。然后将脾脏置于含有3毫升RPMI和5%胎牛血清的15毫升锥形管中，冰上保存。使用镊子在剑突处固定肋骨，切开膈肌。肺部应随之塌陷并移向脊柱方向。沿两侧切开肋骨以移除胸骨，切断肺动脉和静脉，以分离并摘除右肺的上叶。将肺叶置于含有10%中性缓冲福尔马林的15毫升锥形管中，在室温下固定至少24小时，并分离左右肺的其余肺叶。然后将肺叶放入含有2毫升PBS中1%酪蛋白的15毫升锥形管中，置于冰上。使用带吸头的1毫升移液器收集充满胸腔的血液，并将血液转移至预先标记的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。去除覆盖气管的腮腺、舌下腺、颌下腺及淋巴结，并打开并清除气管周围的保护膜。使用精细镊子和剪刀，从锁骨上缘至下颌骨下缘，仔细将气管与食管及其他结缔组织分离。用镊子夹住气管，并在锁骨上缘处剪断气管。向下牵拉气管以最大程度地拉伸其弹性，然后在下颌底部、喉部上方切断气管，分离出约一厘米长的组织。随后将器官放入预先标记的1.5毫升微量离心管中，管内含有0.3毫升含1%酪蛋白的PBS溶液，并置于冰上。现在将小鼠翻转，以便清晰接触鼻部，并用70%乙醇喷洒头部。用手在动物颅骨后方直接抓住，使用剪刀从鼻底开始向上剪除吻部的软组织。清除鼻周的毛发、皮肤和触须，将一对弯头剪刀的尖端插入鼻孔，弯头朝下。沿鼻腔向眼睛方向剪开，形成类似“V”字的形状。然后使用精细镊子采集鼻中隔及其中的软组织，并将组织置于预标记的含有0.3毫升PBS中1%酪蛋白的1.5毫升微量离心管中，冰上保存。处理肺组织时，将整个肺组织样本管内容物转移至无菌的15毫升Dounce匀浆器中，用研杵匀浆组织。持续解离样本直至无大块组织残留，然后将匀浆后的悬液转回原始的15毫升管中。取0.3毫升等分试样用于涂布平板以计数菌落形成单位，其余匀浆液通过离心收集。将上清液0.5毫升分装至预先标记的微量离心管中，于20摄氏度保存，直至进行ELISA法细胞因子表达分析。随后，将预留的肺匀浆悬浮液取0.1毫升等分试样，每步稀释均加入0.9毫升无菌PBS，进行系列稀释，并使用无菌三角涂布棒将每个经经验选择的稀释度中0.1毫升涂布于预先标记的含链霉素的10% Bordet-Gengou平板上。此处展示了用于获得光密度为600的代表性测量值和计算方法，以制备光密度为1的细菌悬液，并进一步稀释100倍后用于向小鼠接种的细菌接种物。在疫苗抗原刺激七天后，联合疫苗组免疫小鼠的脾细胞产生干扰素γ和IL-17，同时显著下调IL-5，从而在百日咳博德特菌（B. pertussis）感染期间促进免疫反应向T辅助细胞1型（Th1）和T辅助细胞17型（Th17）极化。通过计数从感染百日咳博德特菌小鼠呼吸道组织中回收的细菌菌落形成单位（CFU），可用于评估目标疫苗的保护效果。应尽快且高效地操作，以避免组织坏死，并将分离的组织置于冰上保存，以维持所回收细菌的活性。可进行ELISpot、流式细胞术以及DNA和RNA提取，以评估免疫细胞、分析物产生情况，并用于表观遗传学和转录组学分析。在处理百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）等病原体时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE），并在经认证的生物安全柜内操作，以防止病原体传播。本方案详细描述了从呼吸道（特别是鼻咽部）进行菌落形成单位（CFU）计数的方法，旨在回答疫苗和传染病研究领域中关于靶向鼻腔细菌定植的相关问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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