石蜡包埋三维胶质瘤神经球培养的免疫组织化学评价胶质瘤生物标志物

该协议是重要的，因为可用于研究胶质瘤生物标志物的存在的方法，保持肿瘤神经球的3D结构。该协议的主要优点是，神经球的形态与细胞平方法相比，保持细胞平的方法，其中细胞受到压力操纵，并变得扁平。这种方法可以应用于任何其他组织培养系统，其中细胞在3D培养和结构的维护是重要的。

首先，培养肿瘤神经球或NS在T-25烧瓶，直到细胞汇合。在 15 毫升锥形管中选择肿瘤 NS。在 300 Gs 下使用 NS 进行 5 分钟。

在此之后，将颗粒重新悬浮在10%甲醛的一毫升中，并在室温下孵育管子10分钟。在重新悬挂的 NS 中加入五毫升的 HBSS。如前所述，将细胞进行浸渍。将含有颗粒的管子放在冰上。

将洗涤的 NS 颗粒重新悬浮在 500 微升中，其中含有 2% 的热液体 agarose。并混合通过温和的移液或搅拌。将阿加罗斯嵌入的 NS 放在冰上，直到加糖聚合。

然后取出一块加糖，拿着 NS。将一块阿加罗斯放入盒式磁带中进行组织处理。将水浴设置为 42 摄氏度。并小心地将刀片插入显微原子中。

然后将石蜡块放入显微原子中。用一只手向下按控制机器左侧每个部分厚度的操纵杆。将操纵杆按至第二个停止，将微切片设置为 30 微米厚度。

转动粗手轮开始修剪块。样品表面几乎暴露后，将控制厚度的操纵杆设置为 5 或 10 微米。到达样品表面时停止修剪。

将冰盒装满冰块，并有足够的水保护石蜡块，防止其直接接触冰。丢弃旧的微原子刀片，并插入一个新的进行剖切。用纱布擦干石蜡块，放在微原子上。

转动粗手轮开始切截石蜡。然后使用潮湿的画笔将石蜡带转移到 42 摄氏度的水浴。使用钳子的曲线，将钳子放在两个石蜡部分之间，然后轻轻地将截块分开。

使用潮湿的画笔将分离的部分推到带正的粘附显微镜幻灯片上。首先，在60摄氏度的金属架上孵化滑梯20分钟，将石蜡熔化。然后根据文本协议，在室温下在补水列车中通过孵育将幻灯片去分离。

将幻灯片存放在自来水中，以防止非特异性抗体结合。在此之后，在125摄氏度的柠檬酸盐缓冲液中孵育幻灯片30秒，90摄氏度孵化10秒。在用蒸馏水冲洗幻灯片五次之前，让滑梯冷却。

接下来，在室温下将幻灯片孵育为0.3%过氧化氢20分钟。然后，用温和的搅拌将幻灯片洗涤五分钟，在洗涤缓冲液中三次。在将稀释原抗体的加湿室中孵育一夜，温度定在摄氏四度。

在此之后，用轻轻的搅拌将幻灯片洗三次，五分钟。接下来，在室温下将稀释的生物素化二次抗体的幻灯片孵育一小时。用温和的搅拌将滑梯洗涤三次，在洗涤缓冲液中洗五分钟。

然后，在黑暗中的室温下孵育在阿维丁-生物基化马萝卜过氧化物酶复合物中的幻灯片一小时。重复上述清洗。在此之后，用DAB过氧化氢基板品牌孵育幻灯片在室温下两到五分钟。

用自来水冲洗幻灯片，将幻灯片浸入赤氧树脂溶液中，以对抗它们。然后用自来水彻底冲洗滑梯，直到水清澈。根据文本协议使幻灯片脱水。

最后，用二甲苯基安装介质盖住幻灯片，并在室温下将它们干燥在平坦的表面上。在此协议中，NS 是固定的，并嵌入在红糖和石蜡中。然后，他们被染色为特定的胶质瘤生物标志物。

ATRX是一种调解染色质结构的伴郎蛋白，其表达水平较低。Ki67是细胞增殖的生物标志物，在胶质瘤NS中呈阳性。最后，NS对OLI62也呈阳性，这是一种促进寡头细胞分化的转录因子。要记住的最重要的事情是将细胞重新悬浮在温暖的阿加罗斯中，然后再转移到冰中，以确保神经球的均匀分布。