非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

为了评估有前景的新型基因治疗策略的有效性和安全性，在经过验证的临床前体内模型中对基因修饰细胞进行全面测试至关重要。非人灵长类动物模型具有相关细胞表面标志物的保守性、试剂的交叉反应性，并能够应用与患者相同的辅助治疗措施，从而紧密模拟临床参数。本次操作将由来自汉斯-彼得·基姆博士实验室的研究技术员Anai Perez进行演示。

首先，将来自健康非人灵长类供体的10至12毫升骨髓等分试样加入50毫升锥形管中。用溶血缓冲液将管内液体体积补足至50毫升，并在室温下孵育细胞，时间不超过7分钟。通过离心去除细胞碎片，弃去上清液，仅保留最后2至5毫升。

通过轻弹管壁将沉淀物在残留的上清液中重悬，使用70微米孔径的细胞滤网将骨髓悬液转移至新的50毫升离心管中，以去除任何血凝块。加入新鲜的溶血缓冲液至终体积为50毫升，室温孵育5分钟，随后通过离心收集细胞。吸除全部上清液，并将细胞重悬于10毫升max缓冲液中。

在将细胞悬液通过另一个70微米孔径的滤网过滤之前，用40毫升新鲜缓冲液冲洗试管，并将洗涤液与细胞悬液合并。根据标准的磁辅助细胞分选方案富集CD34阳性细胞后，用最多50毫升新鲜Max缓冲液洗涤磁珠分离的细胞，并将细胞沉淀重悬于HSPC培养基中。随后将10至20毫升细胞接种于透气的组织培养处理T75培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中过夜培养。

为评估骨髓细胞样本在富集前后的纯度，需建立一个流式细胞术检测方案，包含适当的图谱和细胞群层级结构，展示所有事件的散点图、CD34阳性细胞、造血干细胞、多能性非红系髓系祖细胞以及淋系-髓系祖细胞的设门策略。接着，运行一份未染色的富集前白细胞样本，以调整前向散射和侧向散射参数的电压，并校正所有荧光通道；随后使用单染补偿微珠，调节相邻荧光通道之间的补偿。最后，采用经电压和补偿调整后的检测方案，运行其余未染色和染色的样本，以记录CD34富集效率。

当所有补偿设置完成后，配置细胞分选仪，用于将 CD34 亚群分选至集落形成细胞检测中，并将染色后的 CD34 富集样本管上机至流式细胞仪。随后记录 2000 至 3000 个事件，并根据信号强度和目标细胞群精细调整分选门。设置完成后，开始采集细胞，调节流速至每秒 500 至 1000 个细胞，并分别从侧向散射光、CD34 阳性、造血干细胞、多能非红系髓系祖细胞以及淋系-髓系祖细胞门中分选出 800 至 1200 个细胞，收集至各含有 3.6 毫升集落形成细胞培养基的独立试管中。

分选完成后，收集离心管中的涡旋液，将1毫升细胞悬液分别加入三个无菌的3.5厘米非组织培养处理的培养皿中，每个培养皿置于一个15厘米培养皿内，每种细胞群体设置三份，于37摄氏度孵育10至14天。次日早晨，使用10毫升移液器，用无菌HBSS轻轻冲洗每个培养瓶底部的贴壁细胞，并通过离心收集收获的细胞。将细胞重悬于转导培养基中，调整浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。

在重组纤连蛋白片段包被的12孔板中，向其中一个孔加入一毫升细胞，作为模拟对照，于细胞培养孵箱中过夜孵育。然后将剩余细胞分装为每份10毫升，加入重组纤连蛋白片段包被的T75培养瓶中，于细胞培养孵箱中孵育30分钟，瓶盖保持通气状态。孵育期间，解冻病毒条件培养基样品，并根据滴度及每毫升细胞的感染单位数计算所需添加的病毒量。

从培养箱中取出培养瓶，加入适量的病毒条件培养基，然后将细胞放回37摄氏度、5%二氧化碳的环境中。次日早晨，将细胞从培养瓶转移至单独的50毫升锥形管中。每次用最多50毫升的HBSS洗涤细胞，并重复此步骤最多三次，以去除残留的病毒。

将细胞在添加前列腺素 E2 的 HSPC 培养基中孵育两小时。然后洗涤细胞，并将细胞重悬于每管含 2% 自体血清的 10 毫升 HBSS 中。接着使用配备 16.5 号针头的 20 毫升注射器吸取细胞悬液。用新鲜的 HBSS 加 2% 自体血清冲洗管内壁，并吸入注射器中。

在将细胞溶液置于冰上直至回输至自体宿主之前，请小心地用针头帽盖住注射器。为测定转导细胞的基因修饰效率，将每毫升HSPC培养基中保留的1 × 10⁶个模拟处理或转导细胞接种至非组织培养处理的培养板中。在转导后的第2、5和12天，收集细胞并进行计数。

在第2天和第5天，将33%的细胞以每毫升1 × 10⁶个细胞的浓度重新接种至新鲜的HSPC培养基中。在第2、5和12天，将33%的细胞冻存于DNA提取缓冲液中，用于定量实时PCR检测；其余最后33%的细胞则按照标准操作流程进行流式细胞术分析，以评估造血后代的表型组成。为了通过流式细胞术定量检测转基因表达水平，额外增加三个侧向散射光 vs.

转基因图谱；第一个图门控造血干细胞，第二个图门控多能性红系-髓系祖细胞，第三个图门控淋系-髓系祖细胞，均相对于转基因进行分析。然后记录2000至3000个事件，并微调分选门以适应信号强度和目标细胞群。

采用本方案富集的非人灵长类动物 CD34 阳性 HSPC 数量通常与输入的总白细胞计数成正比。先前的研究表明，总的 CD34 阳性 HSPC 产物中包含并非真正具有长期重建造血功能的造血干细胞，因此可利用基于流式细胞术和集落形成细胞的技术，可靠地鉴定并区分富集的长期重建造血干细胞亚群与定向祖细胞。CD34 阳性人干细胞富集细胞可利用慢病毒载体高效地进行基因修饰。

携带非整合型载体的细胞在为期12天的液体培养检测过程中会逐渐稀释，而稳定整合到基因组中的载体则会传递给所有子代细胞。这一点已通过集落形成细胞实验中载体的表达得到证实。该临床前方法可用于分离经过基因修饰的、质量可控的非人灵长类造血干细胞和祖细胞，用于基因治疗。

该方法可轻松适用于其他物种、造血干细胞和祖细胞来源、基因治疗工具及疾病。这一经过充分验证的方案在模拟多种人类疾病的有效疗法方面展现出巨大前景。请注意，操作非人灵长类动物组织时需要加强安全措施，包括使用个人防护装备。