Name: 同时进行机电刺激增强细胞心肌成功能的潜能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 了解如何应用电机械联合刺激技术来增强细胞的心肌分化潜能。该方法可同时施加电刺激与机械刺激，适用于细胞治疗、疾病建模和药物筛选等心血管研究领域。

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作者感谢ICREC研究项目（IGTP，巴达洛纳）和电子与生物医学仪器组（UPC，巴塞罗那）的成员，特别是J. Rosell-Ferrer教授。此外，作者感谢《STEM CELLS Translational Medicine》期刊及AlphaMed Press允许改编此前发表的图示（Llucià-Valldeperas, 等30）。本原型的开发及实验方案的设计得到了西班牙教育与科学部（SAF 2008-05144）、经济与竞争力部（SAF 2014-59892）、欧盟第七框架计划（RECATABI, NMP3-SL-2009-229239）、Fundació La Marató de TV3（080330、201516、201502）以及西班牙卫生创新与前瞻性基金会（FIPSE；06-00001396-15）的支持。

本研究使用来自患者样本的人类心脏ATDPCs。其使用已获得当地伦理委员会批准，所有患者均签署了知情同意书。研究方案符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则。
1. 准备工作
<ol>
	<li>将两把镊子、12个用于电刺激的铂金PTFE电极以及一些纸巾在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
	<li>对12个定制的PDMS构件进行灭菌（图1A）。
	<ol>
		<li>每个构件用5 mL无菌蒸馏水在室温下磁力搅拌清洗15分钟。</li>
		<li>用5 mL 70%乙醇在室温下磁力搅拌清洗1次，每次5分钟。</li>
		<li>用5 mL无菌蒸馏水在室温下磁力搅拌清洗5次，每次10分钟，以去除残留的酒精。</li>
		<li>将构件置于超净工作台内的无菌纸巾上过夜晾干。</li>
		<li>使用前储存在无菌的50 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞接种（第 -1 天）
<ol>
	<li>细胞接种前，将清洁的PDMS结构转移至无菌培养皿中，并用紫外线照射5分钟，以确保完全灭菌。</li>
	<li>将每个结构转移至35 mm细胞培养皿或6孔板中，&#160;用于立即接种细胞。</li>
	<li>消化一个汇合的T75培养瓶中的心源性ATDPCs细胞。
	<ol>
		<li>用5 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗T75培养瓶。</li>
		<li>加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。</li>
		<li>加入5 mL完全培养基以中和胰蛋白酶-EDTA的活性。</li>
		<li>将所有细胞收集至15 mL离心管中，并用5 mL PBS清洗培养瓶两次，以收集残留细胞。</li>
		<li>在22 °C下以230 × g离心5分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL完全培养基中，用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将200 µL心源性ATDPCs细胞悬液（2.5 × 105 个细胞/mL）接种至12个PDMS结构的细胞池中（图1A,B），使次日细胞覆盖约80%的接种表面，并在37 °C、5% CO2条件下培养。 
	注意：接种后2–4小时，细胞应已贴壁。细胞接种量应根据细胞大小和生长特性进行调整。对于较小的细胞，应提高接种密度。</li>
	<li>每孔轻轻加入2 mL预热的完全培养基（α-MEM添加10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素）。</li>
	<li>将结构置于培养条件（通常为37 °C和5% CO2）下过夜孵育。</li>
</ol>
3. 电机械刺激装置设置（第0天）
<ol>
	<li>开始实验前，准备六个用于电机械刺激的构建物，另设六个作为非刺激对照组。若每组刺激的培养板少于六块，需使用装有相同体积培养基的空构建物，以确保电场刺激的均匀性。</li>
	<li>用70%乙醇清洁刺激装置，并将其放入超净工作台中。</li>
	<li>将无菌电极和镊子放入超净工作台内。</li>
	<li>从培养板中移除90%的培养基，以便于操作电极和构建物。首先，将PDMS构建物放置在正确位置，确保固定磁铁与移动磁铁之间产生磁吸引力（即PDMS构建物在培养板内向磁铁方向发生位移）。接着，将铂丝连接至电极接头，并将PTFE部件安装到PDMS构建物的指定位置。</li>
	<li>向每个构建物中加入2.5 mL预热的新鲜完全培养基。 
	注意：整个操作过程中需保持无菌，每次仅操作一个构建物。其余构建物应暂时存放于37 °C、5% CO2的培养箱中，待用时取出。</li>
	<li>当所有PDMS构建物均已正确放置并连接至刺激平台后，将整个平台放回37 °C、5% CO2的培养箱中。</li>
	<li>连接电源和机械刺激源。</li>
	<li>配置刺激程序。通过电刺激仪的用户界面以及控制机械刺激的应用程序，分别设定电刺激和机械刺激的参数。按以下方式设置同步模式。
	<ol>
		<li>打开电刺激仪，等待主菜单在显示屏上出现。
		<ol>
			<li>选择 选项2：编辑序列 + 确认。</li>
			<li>按如下方式编辑 菜单 序列：
			<ol>
				<li>使用 模式 选项选择电压或电流模式，点击 + 选择电流，然后按 确认。</li>
				<li>在 幅值 选项中，使用 +/- 选择 1 (mA)，然后按 确认。</li>
				<li>在 周期 (T) 选项中，使用 +/- 选择 1000 (ms)，然后按 确认。</li>
				<li>将 脉冲持续时间 (Tw) 设置为 2 (ms)，使用 +/- 调整后按 确认。</li>
				<li>在 触发模式 选项中，选择 软件外部触发，然后按 确认。</li>
				<li>返回主菜单后，选择 选项4：生成序列 并按 确认。 
				注意：电刺激仪将保持待机状态，直到通过串口接收到机械刺激仪应用程序发出的触发指令。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在控制应用程序面板的机械刺激部分执行以下步骤（图2C）：
		<ol>
			<li>在 脉冲周期 文本框中输入 1,000 (ms)。</li>
			<li>在 开启时间 (Tw) 文本框中输入 500 (ms)，以设定机械脉冲的持续时间。</li>
			<li>在 行程 文本框中输入 2,000 (AU)，以实现10%的构建物拉伸。该数值对应线性控制电机的步数。 
			注意：本实验采用的刺激方案为：交流单相方波脉冲，强度50 mV/cm，频率1 Hz，脉冲宽度2 ms，同时施加10%拉伸，持续7天。机械脉冲的上升和下降时间设定为100 ms，以近似模拟心脏压力脉冲的波形。重复模式设为 连续，并设有计数器显示脉冲次数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周更换两次培养基（周一和周四下午）。首先移除旧培养基，然后将预热的培养基沿PDMS支架边缘加入，切勿直接滴加在细胞层上。 
	注意：若细胞增殖较快，应每周更换三次培养基（例如周一、周三和周五）。更换时需断开并重新连接所有电缆，但无需将培养板和电极从原位取出。</li>
	<li>实验结束后收集样本。</li>
</ol>
4. 实验结束时的样本采集（第7天）
<ol>
	<li>用于RNA分析
	<ol>
		<li>用3 mL 1×PBS在室温下洗涤构建体2次，每次5分钟。</li>
		<li>向每块培养板中加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（足以覆盖整个结构），在37 °C下孵育5分钟。</li>
		<li>细胞脱离后，加入 2 mL 完全培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA。</li>
		<li>将所有细胞收集至15 mL离心管中，用3 mL PBS洗涤结构物2次，以收集残留的细胞。</li>
		<li>230 x g 离心 g 在22 °C下持续5分钟。</li>
		<li>移除上清液，并将沉淀重悬于1 mL PBS中。</li>
		<li>将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，在230 x g条件下离心 g 5 分钟。</li>
		<li>移除上清液，将沉淀物溶于700 µL裂解试剂中，于-80 °C保存，用于后续RNA提取。</li>
		<li>使用商业试剂盒，按照制造商说明书提取RNA。</li>
		<li>使用试剂盒和随机六聚体，按照制造商的说明书对分离的RNA进行逆转录。</li>
		<li>对于低浓度的小RNA，先进行预扩增，然后用无RN酶的水按1:5稀释，再进行后续的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。继续执行实时RT-PCR的标准操作流程，并检测主要的心脏标志物。 
		注意：典型的心脏标志物包括来自不同类别的早期和晚期标志物，如心脏转录因子（心肌特异性增强子因子2A [MEF2A]、GATA结合蛋白4 [GATA-4]）、结构蛋白（心肌肌钙蛋白I [cTnI]、心肌肌钙蛋白T [cTnT]、α-辅肌动蛋白）以及钙调节蛋白（连接蛋白43 [Cx43]、肌浆/内质网Ca2+-ATP酶 [SERCA2]）30蛋白质的分离也可根据需要进行。可使用市售试剂和试剂盒，从同一样本中同时进行RNA和蛋白质的分离。材料表若样本量较少。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于免疫染色 
	注意： 此操作直接在附着于PDMS结构细胞池中的细胞上进行。因此，我们建议每次在细胞池上方（除培养皿盖外）放置一块1 cm × 1 cm的石蜡膜，以尽量减少孵育溶液的蒸发。
	<ol>
		<li>用3 mL PBS在室温下洗涤构建物2次，每次5分钟。</li>
		<li>用 2 mL 10% 福尔马林在室温下固定附着在支架上的细胞，孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 3 mL 磷酸盐缓冲液在室温下洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。如需长期保存，将样品置于含 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中，4 °C 保存。</li>
		<li>用 3 mL PBS + 0.5% 去垢剂对细胞进行透化处理（洗涤 3 次，每次 5–10 分钟，室温）。</li>
		<li>将细胞与100 µL PBS + 10% 马血清 + 0.2% 去垢剂 + 1% 牛血清白蛋白在室温下孵育1小时，以阻断非特异性抗体结合。</li>
		<li>将细胞与含有10%马血清、0.2%去垢剂、1%牛血清白蛋白及一抗的100 µL PBS溶液在室温下孵育1小时。例如，使用针对Cx43（1:100）、肌节性α-肌动蛋白（1:100）、GATA-4（1:50）、MEF2（1:25）和SERCA2（1:50）的一抗。</li>
		<li>室温下用 3 mL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将细胞与100 µL PBS + 二抗在室温避光条件下孵育1 h。 
		注意： 使用了与不同荧光染料偶联的二抗以及一种复染剂。</li>
		<li>在室温避光条件下，用 3 mL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温避光条件下，用100 µL核染色液（0.1 µg/mL，溶于PBS）孵育细胞15分钟。</li>
		<li>在室温避光条件下，用 3 mL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将样品置于含0.1%叠氮化钠的3 mL PBS中，4 °C保存至检测。 
		注意： 由于构建物厚度约为0.5 mm，可在配备长工作距离物镜的倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜上进行显微成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露，但声明刺激设备和方案此前已申请专利（WO-2013185818-A1，WO-2017125159-A1）。

电机械刺激似乎是一种安全的替代方法，可用于使细胞适应严酷的心脏环境并增强其向心肌细胞分化的能力。在此，针对心脏前体细胞所描述的一种方案提高了主要心脏标志物的表达水平，并被报道对其后续移植到梗死小鼠心肌中具有益处30。总体而言，经电机械刺激的心脏ATDPCs显著上调了与早期发育、结构蛋白以及钙调节相关基因的表达，而这是以往单独使用电刺激或机械刺激均未能实现的效果。事实上，经电机械刺激的心脏ATDPCs表现出更完整的心肌细胞基因表达谱，其向心肌谱系分化的程度也似乎较以往报道的更为显著。
电机械刺激后，两种细胞类型的 cardiac 基因表达均发生改变，尤其是与皮下来源的 ATDPCs 相比，心脏来源的 ATDPCs 表现出显著增强。这一结果可能与用于细胞分离的脂肪组织来源有关，即分别为心外膜脂肪或皮下脂肪。包围心脏和心包的心外膜脂肪是一种具有代谢活性的器官，也是前体细胞的来源。值得注意的是，心外膜脂肪在解剖结构和功能上与心肌具有连续性。在正常情况下，心外膜脂肪具有生化和产热性的保护心脏作用；而在病理状态下，它可分泌促炎性细胞因子，从而影响...

心脏功能依赖于电兴奋与机械收缩的耦合。简而言之，心肌细胞间的细胞连接允许电信号传播，从而产生几乎同步的心脏收缩，将血液系统性地泵送至全身及肺循环系统。因此，心肌细胞会经历电学和力学双重作用力，这些力可调控基因表达和细胞功能。为此，许多研究团队尝试开发能够模拟心脏生理环境的培养平台，以深入理解机械和电刺激在心脏发育、功能及成熟过程中的作用。体外条件下，单独施加电刺激或机械刺激已在心脏组织工程中得到广泛应用，用以增强组织功能特性、促进细胞成熟，或改善细胞间耦合与钙处理能力1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。然而，由于缺乏合适的刺激装置与实验方案，以及必须进行复杂的参数优化，同步的电-机械联合刺激至今仍未被充分开发和利用22。
初步研究将电机械刺激定义为电刺激与培养基灌注的结合；然而，该流动并不涉及基于应变的心室充盈典型变形23,24,25随后，更接近生理条件的方法将电刺激与物理形变或拉伸相结合，以模拟等容收缩26,27,28,29,30,31. Feng et al. 在2005年首次报道了电机械刺激的实验验证，结果显示心肌细胞尺寸增大且收缩功能增强26. Wang et al. 采用5-azacytidine预处理间充质干细胞，并施加同步的电刺激与机械刺激，从而改善了再细胞化、细胞活力、心肌向分化及组织重塑27自这些出版物以来，越来越多的研究团队报道了对细胞单层或工程化组织的电机械刺激（例如，Black28，Vunjak-Novakovic29,31，以及我们团队30) 对首次经体内测试的条件化细胞30简而言之，Morgan 和 Black 测试了多种电刺激与机械刺激的组合，报道指出刺激之间的时序至关重要，因为延迟的联合电机械刺激效果最佳28随后，Godier-Furnémont 及其合作者优化了一种电机械刺激方案，用于由新生大鼠心肌细胞构建的工程化心肌组织，并首次实现了正向的力-频率关系。29随后，我们的研究小组报道了经电机械预处理的细胞可上调主要心肌标志物的表达水平 体外 以及在体内的广泛有益效应，例如心功能改善或梗死边缘区域血管密度增加30最近的一项研究表明，经电机械刺激的干细胞来源心肌细胞所形成的心脏组织，其成熟度更接近于人类成人心脏的结构与功能。31此外，其他三维刺激平台包括电活性支架，可为附着的细胞提供电学、力学和形貌学刺激信号32此外，还可利用可拉伸电极诱导机械形变（细胞单层的拉伸与压缩），以模拟正常的生理条件以及极端条件。33.
因此，其原理在于基于生理条件的体外电机械刺激可增强细胞的心肌生成潜能。事实上，这种刺激在临床情况下可能有助于治疗性细胞进一步整合到心肌中，或在药物筛选应用中促进组织成熟。
此外，我们分离并鉴定了一群来源于心脏的脂肪组织来源的心脏祖细胞（cardiac ATDPCs）34。这些细胞位于心外膜脂肪中，在心肌梗死的治疗中表现出有益的组织病理学和功能效应，同时具有心源性和内皮分化潜能30,35。我们推测，经过生物物理刺激后，这些益处将进一步增强。
因此，我们开发了一种针对目标细胞群体的装置和刺激方案，并研究了其效应。该电机械刺激方案是一种新的策略，可无菌且非侵入性地诱导细胞主动拉伸，与以往文献相比具有优势36，并结合了电场刺激。本文详细阐述了用于细胞电刺激、机械刺激及电机械联合刺激的装置与方法。
该设备可独立或同时提供电刺激和机械刺激。刺激通过一种非侵入性且无菌的新型方法实现，包括预灭菌的细胞支撑装置、置于标准培养板内部的电极，以及可产生机械力和电力的平台（图1）。
该平台最多可容纳六个培养板，由激光切割的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和印刷电路板部件构成三明治结构。平台原型依赖于一个单相可编程、计算机控制的电刺激器、一块用于电极稳定连接的印刷电路板，以及六个尺寸为10 mm × 10 mm × 5 mm的镀镍钕铁硼固定磁铁，这些磁铁放置在培养板的一侧附近。此外，在培养板另一侧前方设有一根铝制横杆，其上安装有六个驱动磁铁（相同型号），并通过直线伺服电机驱动移动。电机由电机控制器驱动，并通过RS-232端口由商用软件控制（见材料表）。通过用户界面和可编程刺激器，可设定电刺激强度、脉冲持续时间与频率、机械刺激频率、占空比、脉冲次数、脉冲幅度（磁铁位移行程）以及斜率。
<img alt="带有磁体、电极和电刺激连接器的电生理学装置，以及数据显示分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：电机械刺激器 (A用于细胞培养的PDMS结构。BPDMS结构示意图，包括电极和磁体。C) 用于实施电机械刺激的印刷电路板（平台）细节。该面板由 Llucià-Valldeperas 修改而来 等30. (D) 电机械刺激平台及用户界面（计算机）示意图 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
刺激器及电机械刺激方法均在两项国际专利WO-2013185818-A137和WO-2017125159-A138中有完整描述。
先前已有文献描述过用于为细胞、电极和磁体提供结构支撑的生物相容性硅胶结构10,21。简而言之，该结构由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，在室温下成型并固化，其杨氏模量为1.3 MPa，接近生理水平。该结构包含一个位于柔性区域的细胞培养池（10 mm × 10 mm × 2 mm），两个用于固定电极的内部横向槽，以及两个嵌入式的镀镍钕铁硼磁体（6 mm × 2 mm × 4 mm）。电极由直径0.2 mm的铂丝缠绕在聚四氟乙烯（PTFE）核心棒（2 mm × 3 mm × 12 mm）上构成（每根电极长约21 cm，约23圈），并置于柔性区域的相对两侧，以形成用于施加电刺激的电场。机械拉伸通过支撑结构内嵌磁体与培养板旁及移动铝臂上外部磁体之间的磁吸引力实现。通过这种方式，可在不破坏无菌屏障的情况下对细胞支撑结构进行拉伸。该方法适用于细胞单层培养，也可适配用于三维结构。
此外，可以使用刻线衍射光栅（1,250 条/mm）在细胞接种区域印制规则的图案。由于该PDMS结构具有透明性且厚度为0.5 mm，因此可以在明场和荧光显微镜下直接观察培养于其上的细胞。在本案例中，PDMS培养池具有垂直方向的表面图案，该图案垂直于拉伸力方向，从而使细胞排列方向垂直于电场方向，以最小化细胞所受的电场梯度。
图1展示了用于刺激的构建体和装置的详细描述。PDMS构建体及其特性已针对细胞拉伸进行了优化（图1A,B）。该刺激器经过开发和验证，可有效地对附着在PDMS构建体上的细胞施加所需的电刺激和机械刺激。该过程包括通过软件界面确保良好的连接性和用户操作性（图1C,D）。
使用该自制装置进行细胞刺激的步骤详见方案部分。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;刺激器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镀镍钕磁铁</td><td>超强磁铁</td><td>Q-10-10-05-N</td><td></td></tr><tr><td>镀镍钕磁铁</td><td>Supermagnete</td><td>Q-06-04-02-HN</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard 184 硅弹性体试剂盒</td><td>道康宁公司</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>刻线衍射光栅（1250 条/mm）</td><td>纽波特</td><td>05RG150-1250-2</td><td></td></tr><tr><td>电机控制器</td><td>Faulhaber</td><td>MCLM-3006-S</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>国家仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>70013-065</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>45353001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM，100倍浓缩液</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素，10,000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>最小必需培养基伊格尔（α-MEM）</td><td>Sigma</td><td>M4526-24x500ML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;蛋白质 &amp;和 RNA 分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol 裂解试剂</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep RNA/蛋白提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>50980404</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal Probes 一步法试剂盒</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>172-5140</td><td></td></tr><tr><td>随机六聚体</td><td>Qiagen</td><td>79236</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp MasterMix 2x</td><td>应用生物系统公司</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR MasterMix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;免疫染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma</td><td>HT-501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S8032-100g</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>连接蛋白-43 兔单克隆抗体</td><td>Sigma</td><td>C6219 批号#061M4823</td><td></td></tr><tr><td>肌节的 &amp;alpha;α-肌动蛋白小鼠一抗</td><td>Sigma</td><td>A7811 批号#080M4864</td><td></td></tr><tr><td>GATA-4 山羊一抗</td><td>R&amp;研发</td><td>AF2606 VAZ0515101</td><td></td></tr><tr><td>MEF2 兔抗一抗</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-313 批号#E0611</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2 山羊一抗</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-8095 批号#D2709</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>712-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>715-225-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>711-225-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>705-225-147</td><td></td></tr></tbody></table>

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

心血管疾病是发达国家死亡的首要原因。因此，对有效心脏细胞疗法的需求促使干细胞和生物工程领域的研究人员致力于开发 体外 用于基础研究和临床应用的高保真人心肌组织。然而，心肌细胞的未成熟表型限制了在功能上模拟成人的心肌组织的获得，而成人心肌的主要特征在于其机械和电学信号。因此，本方案旨在通过电-机械刺激，模拟生理参数，以制备并促进目标细胞群体的成熟。心脏组织工程正朝着更具生物学特性的方向发展，基于生物物理刺激的策略因此日益受到重视。为此开发的装置具有独特性，可实现独立或同步的电刺激与机械刺激，并经过严谨的表征与验证。此外，尽管该方法已针对此刺激器及特定细胞群体进行了优化，但仍可便捷地适配于其他设备和细胞系。本文结果表明，经电-机械刺激后，细胞群体的心肌定向分化能力显著增强。电-机械刺激的细胞显示出主要心肌标志物表达的上调，包括早期、结构性及钙调节相关基因。此类细胞预处理策略有望应用于后续的再生细胞治疗、疾病建模以及高通量药物筛选。

图2展示了细胞刺激所遵循的总体方案。简而言之，将细胞接种于PDMS支架上，并对其进行电机械刺激，每周更换培养基两次。未接受刺激的细胞作为电机械刺激条件化的对照。此外，本实验增设了另一对照组，采用皮下脂肪组织来源的ATDPCs作为心脏ATDPCs的对照。皮下ATDPCs来源于皮下脂肪组织，其分离与培养流程与心脏ATDPCs相同33。细胞在PDMS支架上贴附后，在刺激前后均表现出典型的梭形表型。此外，细胞沿支架表面的图案排列，在本例中为垂直方向排列。
首先分别优化了电刺激和机械刺激的参数。电刺激方案基于先前的一项研究，该研究发现，对于心脏来源的ATDPCs，采用50 mV/cm、1 Hz的交流电、持续2 ms的单相方波脉冲效果最佳10。我们曾报道，电刺激可上调心脏ATDPCs中早期心脏标志物的表达，例如...

本文介绍了一种利用模拟心脏生理环境的电刺激和机械刺激来训练细胞群体的实验方案。这种电机械刺激可增强经处理细胞的心肌生成潜能，是在细胞治疗、疾病建模及药物筛选领域具有前景的策略。

心血管疾病是发达国家死亡的首要原因。因此，对有效心脏细胞疗法的需求推动了……

这是一种对细胞施加电机械刺激的方法。该方法具有多种应用，可用于研究刺激对细胞群体的影响、体内递送前的预训练以及细胞成熟。其优势在于，可以使用同一设备单独或同时施加电刺激和机械刺激，同时保持无菌环境且不破坏病毒的完整性。该技术是实现我们治疗目标的一种间接方法。经过电机械刺激的细胞被认为是一种有潜力用于治疗心肌内层的细胞群体。该方法通常属于心血管领域，但也可能应用于神经系统。这是一种简单的技术，但需要耐心。最困难的部分是处理微小的部件，并始终保持无菌状态。操作中有一些细微之处难以用语言解释清楚，因此视觉演示非常有帮助。首先将12个已清洗的PDMS结构转移至无菌的10厘米培养皿中。为确保完全灭菌，将培养皿暴露于紫外光下照射5分钟。随后将每个结构分别转移至独立的35毫米细胞培养皿中，或立即用于细胞接种时可转移至6孔板中。开始细胞接种时，首先用5 mL的1×PBS洗涤一个融合的T75培养瓶中的心源性ATDPCs。为使细胞脱离，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育5分钟。然后加入 5 mL 完全培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA。将所有脱落的细胞收集至 15 mL 离心管中。用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞培养瓶两次，以收集残留的细胞，并将洗涤液一并加入 15 mL 离心管中。在22°C下以230 ×g离心五分钟。弃去上清液，将细胞重悬于2毫升完全培养基中，并用血细胞计数板进行计数。将200 µL心脏来源的ATDPCs接种至各含有PDMS结构的培养板中，使次日细胞覆盖约80%的接种表面。在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。每孔加入2毫升预热的完全培养基，轻轻混匀。将细胞与构建物在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。开始此操作之前，从12个构建体中指定6个用于电机械刺激，其余6个作为无刺激对照组。使用70%乙醇清洁刺激装置。将刺激装置、无菌电极和镊子放入超净工作台内。为了便于操作电极和构建物，从每块细胞培养板中移除90%的培养基。将PDMS构建物放置在靠近磁铁的正确位置，以确保固定磁铁与可移动磁铁之间产生磁吸引力。在保持整个过程无菌的条件下操作接种了细胞的PDMS构建物和电极，是上述两个最关键的步骤。然后，将铂丝连接到电极连接器上。将电极的聚四氟乙烯（PTFE）部分放置在PDMS结构中指定的位置。向每个结构中加入2.5毫升新鲜的、预热的完全培养基。将所有PDMS构建体放置到位并电连接至平台后，将平台放回37摄氏度、5% CO2培养箱中，然后连接电源和机械源。通过电刺激器的用户界面以及控制机械刺激的应用程序界面设置刺激程序，指定电刺激和机械刺激的参数条件。为设置同步，请打开电刺激器，等待主菜单显示在屏幕上。然后选择选项二“编辑序列”，并按 Enter 键。在编辑序列菜单中，使用模式选项卡，通过点击“加号”选择“电流”，然后按 Enter 键；对于周期，使用加/减号选择“1000”，然后按 Enter 键；对于触发模式选项卡，选择“软件外部触发”，然后按 Enter 键；对于幅度选项卡，使用加/减号选择“1”，然后按 Enter 键。返回主菜单后，选择选项 4，然后选择“生成序列”，并按 Enter 键。在控制应用程序面板的机械刺激部分，首先在“正周期”文本控件中输入“1000”。然后在“ON时间”文本控件中输入500，以设置机械脉冲持续时间。最后在位移文本控件中输入2000，以实现10%的构建物伸长。每周更换两次细胞培养基，先移除旧培养基，然后在PDMS支架两侧加入温热的新鲜培养基。在第七天实验结束时，按照文稿中所述方法收集样品。经电机械刺激的心脏来源ATDPCs增强了其心肌生成潜能。实时PCR结果显示，早期和晚期心脏基因的表达均有所上调，特别是心脏转录因子GATA-4、结构标志物β-肌球蛋白重链以及与钙相关的基因Connexin43。针对肌动蛋白纤维的鬼笔环肽染色显示，大多数细胞沿垂直图案排列。连接蛋白43主要分布在细胞质和质膜上，通过缝隙连接参与细胞间通讯。MEF2和GATA-4转录因子位于心源性ATDPCs的细胞核内。但在皮下ATDPCs中未检测到GATA-4。细胞质标志物SERCA2和肌节α-肌动蛋白未显示出心肌细胞典型的成熟肌节结构，且在对照组和刺激组细胞群体中均未观察到搏动现象。在本方案开始时，健康的细胞单层以及整个操作过程中保持无菌状态至关重要。在样品采集后，可进行标准的基因组蛋白表达技术操作。该技术有助于更好地理解细胞电刺激和/或机械刺激的作用。直到最近，还无法使用同一设备进行刺激，这使得结果更难比较。

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科研

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Bioengineering

生物工程

同时进行机电刺激增强细胞心肌成功能的潜能

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

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利用电刺激在生物导线中促进人干细胞来源心肌细胞的成熟

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在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。...

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利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

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了解如何应用电机械联合刺激技术来增强细胞的心肌分化潜能。该方法可同时施加电刺激与机械刺激，适用于细胞治疗、疾病建模和药物筛选等心血管研究领域。

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

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