Name: 使用自动微生物反应器系统从中国仓鼠卵巢细胞中纯化和分析单克隆抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解使用自动微生物反应器系统从中国仓鼠卵巢细胞中纯化单克隆抗体的完整流程。本方法涵盖关键质量属性分析、N-糖谱检测及电荷异构体表征，适用于小体积样品的高效处理与生物制药质量控制研究。

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作者谨此感谢 Scott Lute 提供的分析支持。本研究的部分内部资金和支持由 CDER 关键路径计划（合同编号：CA #1-13）提供。本项目部分得益于美国食品药品监督管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划的资助，该计划由橡树岭科学与教育研究所通过美国能源部与食品药品监督管理局之间的机构间协议管理。

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本文内容仅代表作者观点，不应被解读为反映美国食品药品监督管理局（FDA）的观点或政策。

HCCF 含有碎片和大颗粒，可能会堵塞并损坏昂贵的仪器，因此在进行后续下游处理之前需要对培养液进行澄清。离心通常是将细胞和其他不溶性颗粒与蛋白质分离的第一步，随后进行过滤。经过滤的 HCCF 随后通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行纯化。从自动化微型生物反应器中纯化 HCCF 以获得目标产物，是下游处理中的关键步骤。本实验采用台式 FPLC 系统结合蛋白 A 柱，从 HCCF 中获取单克隆抗体。上游工艺的分析可为细胞行为提供有价值的见解，并指导生物工艺设计，有助于获得质量一致且可靠的产品。分析技术还可帮助我们将关键质量属性（CQAs）与上游及下游工艺相关联。本文介绍了四种常用于单克隆抗体表征的检测方法。这些技术具有良好的稳健性、可靠性，可便捷地用于来自多种上游来源的工艺和产品分析，即使样品仅经过部分纯化且仍含有残留水平的 DNA 和 HCP，亦可适用。
在为分析处理样品时，必须在制备出足够纯净的样品以供分析的同时，保留生物反应器中存在的变异性的两者之间取得重要平衡。影响产品的两种最常见污染物是DNA和HCP，可通过测定260/280 nm处的吸光度比值以及通过SDS-PAGE或µCE-SDS进行检测。此处介绍的检测方法对低水平的DNA含量不敏感。根据µCE-SDS测定结果，产品的纯度&#62;95%。
采用微毛细管电泳系统进行电荷变体分析，可提供一种高通量的方法来鉴定电荷变体，其芯片和试剂易于操作实施。该技术本身及标记试剂的化学性质均对辅料和其他伯胺类物质敏感，因此大多数样品基质需要进行脱盐步骤。根据经验，低水平的DNA会与标记反应中的游离染料共迁移，但不会影响结果质量。尽管碱性、主峰和酸性峰的定量变异性通常&#60;1%，但较高水平的DNA及其他污染物可能增加检测的变异性。在蛋白质标记过程中保持操作一致性至关重要，并应在从瓶中取出后立即使用DMF与染料混合。建议使用赖氨酸和/或组氨酸标准品作为标记对照。随着时间推移，并取决于样品质量，芯片可能发生污染或微流控通道涂层脱落，导致背景噪声增大、出现鬼峰以及样品间变异增大。为识别此类情况，应定期在分析样品的同时平行分析空白样品和系统适用性标准品（如NISTmAb）。当出现芯片问题时，可用储存液清洗芯片或直接更换芯片。
用于治疗性糖蛋白糖链分析的方法主要涉及液相色谱（LC）和/或质谱（MS），而凝集素微阵列分析作为第三种选择正逐渐受到关注25。本文所述方法结合了液相色谱与质谱技术，具有各自的优缺点。质谱分析方法的优势在于能够对所分析的糖链进行质量验证，而基于液相色谱的荧光检测方法或凝集素微阵列则无法实现这一点。本方法采用液相色谱结合荧光检测，通过将洗脱时间与葡聚糖梯度标准品进行比对，从而确定糖链的结构。荧光检测因其灵敏度高且易于检测，有助于提高检测灵敏度和定量能力；相比之下，质谱单独使用时可能难以对丰度较低的组分进行定量，原因在于寡糖的离子化效率较低。本方法中质谱提供的质量信息用于确认糖链结构，但数据处理软件并不将质量信息作为结构指认的主要依据。因此，若色谱重复性不佳或峰难以分辨，则该方法在糖链结构指认方面可能受到影响。幸运的是，即使在色谱条件不理想的情况下（例如保留时间偏移导致糖链结构难以重复指认），质谱提供的质量信息仍有助于糖链的鉴定。如果该方法在不使用质谱的情况下单独运行，则色谱性能必须达到最高水平，因为无法利用质谱信息来校正保留时间的漂移。
本文所述的氨基酸分析方法利用液相色谱-质谱法（LC-MS）对粗制细胞培养基中的未衍生化氨基酸进行快速定量。其他氨基酸分析方法则需要使用氨基酸衍生化试剂以实现紫外检测26。与液相色谱-紫外检测法（LC-UV）相比，LC-MS 方法具有重要优势：它可根据保留时间和离子质量进行鉴定，而 LC-UV 方法因缺乏质荷比表征能力而受限。此外，LC-MS 方法在时间和重现性方面也更具优势，因为 LC-UV 方法需要耗时的衍生化反应，该过程可能引入样品间的变异性27。然而，在 LC-MS 方法中直接进样粗制细胞培养基可能导致离子喷雾毛细管污染，从而对质谱信号产生不利影响。因此，需频繁进样校准梯度样品以进行系统适用性检查，并对样品进样顺序进行随机化处理，以避免数据偏差。
使用微生化反应器进行抗体生产的细胞培养过程此前已有描述9。本研究详细阐述了单克隆抗体表征方法的操作流程，旨在从有限的样品体积中获取最大程度的数据信息。收获的细胞培养液体量有限时，可能限制所获得的产品信息，因此选择合适的分析方法以获取产品质量数据至关重要。分析检测对于关联上游工艺参数与产品质量变化具有重要意义。本文为使用微生化反应器的研究人员提供了表征单克隆抗体（mAbs）的操作指南。

蛋白质治疗药物正被用于治疗越来越多的疾病，包括组织移植并发症、自身免疫性疾病和癌症1。自2004年以来，美国食品药品监督管理局（USFDA）记录显示，在药品评价与研究中心（CDER）监管的所有批准中，生物制品许可申请（BLA）所占比例持续上升，2014年和2015年BLA占比已超过25%2。
鉴于这一不断扩大的市场，生物制药生产商面临着在保证质量一致的前提下快速提供更多产品的挑战。为提高产品产量，研究主要集中在CHO细胞工程和生产线筛选上，但迄今为止最显著的改进主要归功于制造过程中培养基/补料策略优化以及细胞培养环境控制方面的进展1,3,4,5。
由于单克隆抗体（mAbs）是在生物系统中生产的，因此可能存在固有的蛋白质变异。抗体的组成可能在翻译后发生改变，例如发生糖基化，或受到降解或酶促反应的影响。这些结构上的变化可能引发危险的免疫反应，或改变抗体的结合能力，从而降低甚至消除其预期的治疗功能5。因此，在生产过程中采用质量源于设计（Quality by Design, QbD）的方法，常规监测和控制单克隆抗体的关键质量属性（CQAs），包括N-糖型谱、电荷变体分布以及单体形式抗体的百分比1,6。在受监管的生产环境中，治疗性蛋白质必须符合既定的可接受标准，才能被批准作为上市药品7。本文所介绍的方法通常用于抗体的质量表征过程7,8，任何蛋白质领域的科研人员都应熟悉这些方法的应用。
在先前的研究中9，已描述了微生物反应器在上游生物加工过程中用于细胞培养条件高通量筛选的应用与操作。从不同培养基条件下获得的纯化产物通过液相色谱-质谱法（LC-MS）进行N-糖链分析。利用LC-MS技术可检测并表征治疗性蛋白质的糖基化模式10,11，并且多种糖链种类的存在已被证实与补料策略、pH值和温度等生物工艺参数相关12。通过尺寸排阻色谱-多角度激光散射法（SEC-MALS）评估不同培养基条件对产品质量的影响，该影响以单体形式IgG的百分比作为指标13,14,15。电荷变体谱型代表了一系列可能影响产品功能的修饰16。微毛细管区带电泳（mCZE）是一种相较于传统阳离子交换（CEX）色谱和用于电荷变体分析的毛细管等电聚焦（cIEF）方法具有显著更短分析时间的技术17,18。对使用后的生物反应器培养基进行分析，以追踪蛋白质生产过程中氨基酸的消耗情况，进而关联抗体识别特征的变化19,20,21,22,23。
蛋白质分析技术能够基于工艺输入与关键质量属性（CQA）变化之间的关系，识别关键工艺参数（CPP）。在生物工艺开发过程中，识别并测定关键工艺参数是证明工艺可控性的基础，同时确保产品未发生改变，这在受到严格监管的生产环境中至关重要。本文介绍了用于测定与产品质量属性最相关的一些蛋白质生化特性的分析方法，包括N-糖型谱、电荷变体和分子大小均一性。

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 细胞系</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>通用电气生命科学</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA Ultra 层析树脂</td><td>Millipore Sigma</td><td>115115830</td><td>纯化固定相</td></tr><tr><td>Omnifit 10 cm 柱</td><td>Diba 流体智能</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>固定相外壳</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Superloop</td><td>GE 医疗</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Dawn 多角度光散射检测器</td><td>Wyatt</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Millex GV 滤器单元 PVDF 膜</td><td>默克密理博</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液</td><td>康宁</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mL 注射器</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity 二元泵</td><td>安捷伦科技</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&amp;nbsp;</td><td>安捷伦科技</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity 进样器</td><td>安捷伦科技</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity 恒温器</td><td>安捷伦科技</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity 恒温柱温箱</td><td>安捷伦科技</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>康宁公司</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>150 µL 带聚合物底脚的玻璃内衬管&amp;nbsp;</td><td>安捷伦科技</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>康宁公司</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>菲舍尔化学</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC BSM</td><td>沃特世公司</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC 样品管理器</td><td>沃特世公司</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC 荧光检测器</td><td>沃特世公司</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 100 kDa 离心滤器</td><td>默克密理博</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸标准品，1 nmol/&amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>安捷伦科技</td><td>5061-3330</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸补充剂</td><td>安捷伦科技</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵溶液 - 糖链分析</td><td>沃特世公司</td><td>186007081</td><td></td></tr><tr><td>蓝色带隔垫螺帽</td><td>安捷伦科技</td><td>5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>电荷变体芯片</td><td>珀金埃尔默</td><td>760435</td><td></td></tr><tr><td>电荷变体试剂盒</td><td>珀金埃尔默</td><td>CLS760670</td><td></td></tr><tr><td>层析用水（质谱级）</td><td>菲舍尔化学</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>赛默飞科技</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>Oasis 96 孔板用萃取板真空 manifold</td><td>沃特世公司</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>菲舍尔化学</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks RapiFlour-MS N-糖链起始试剂盒 - 24 样本</td><td>沃特世公司</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII 缓冲液管</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>697075- NC</td><td></td></tr><tr><td>GXII 检测窗清洁布</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT Touch</td><td>珀金埃尔默</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII 梯状管</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII 无尘棉签</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>菲舍尔科技</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>完整单克隆抗体质量校准标准品</td><td>沃特世公司</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Intrada 氨基酸柱 150 x 2 mm</td><td>Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX 差示折光检测器</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td>高氯酸</td><td>Aldrich 化学</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>用于上样凝胶的带微毛细管吸头</td><td>Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯 96 孔微孔板，F 型底，烟囱式，黑色</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS 葡聚糖校准梯</td><td>沃特世公司</td><td>186007982</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 螺口透明小瓶</td><td>安捷伦科技</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>菲舍尔科技</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>碘化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 4.6 mm 内径 x 30 cm 长度</td><td>东曹生物科学</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI 科学信息系统</td><td>沃特世公司</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>真空 manifold 垫片</td><td>沃特世公司</td><td>186007986</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>沃特世公司</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>沃特世公司</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin 脱盐柱，0.5 mL</td><td>赛默飞科技</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

利用自动化微型生物反应器系统从中国仓鼠卵巢细胞中纯化和分析单克隆抗体

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

单克隆抗体（mAb）是目前生产最广泛且表征最充分的生物制品之一。这类抗体通常使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行生产，需优化培养条件和工艺参数，以最大化抗体滴度并达到目标质量特征。通常，该优化过程采用自动化微尺度生物反应器（15 mL）并行筛选多种工艺条件。优化标准包括细胞培养性能以及单克隆抗体（mAb）产品的关键质量属性（CQAs），这些属性可能影响其疗效与安全性。培养性能指标包括细胞生长和营养物质消耗，而关键质量属性则包括mAb的N-糖基化和聚集特征、电荷变体以及分子量。本详细实验方案描述了如何纯化并分析由自动化微型生物反应器系统产生的收获细胞培养液（HCCF）样品，以获得有价值的性能指标和结果。首先，采用自动化蛋白A快速蛋白液相色谱（FPLC）方法从收获的细胞培养样品中纯化mAb。纯化浓缩后，利用特定平台通过质谱法分析糖链谱型（参见材料表）。抗体分子量和聚集特征通过尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）测定，电荷变体则通过微芯片毛细管区带电泳（mCZE）进行分析。除了在生物反应器运行过程中采集的培养性能数据（如培养物活力、细胞计数，以及谷氨酰胺、葡萄糖、乳酸和氨等常见代谢物），还对使用后的培养基进行分析，以鉴定限制性营养成分，从而优化补料策略和整体工艺设计。因此，本文还描述了一种通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）对使用后培养基中氨基酸进行绝对定量的详细实验方案。本方案所采用的方法利用了高通量平台，适用于大量小体积样品的分析。

采用快速蛋白液相色谱法（FPLC）对自动微尺度生物反应器收获的细胞培养液进行纯化，如图1所示，并通过多种下游分析方法对纯化后蛋白质的关键质量属性（CQAs）进行表征。这是自动微生物反应器系统的一个关键优势；可在广泛的不同条件下快速评估CQAs的差异。由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达并经质谱处理的单克隆抗体（mAbs）的N-糖链数据应呈现如图2所示的色谱图形态。该图展示了两张色谱图的对比，显示其中一个样品的甘露糖5峰（M5）显著降低。若观察到的仅为噪声基线而无明显峰形，则可能表明色谱系统设置存在问题或实验操作未成功。通过使用对照品可简化故障排查过程。首先，评估葡聚糖分子量标准品（dextran ladder）产生的FLR峰；这些峰的存在表明色谱系统运行正常。随后，将实验获得的峰图谱与经处理的完整单克隆抗体标准品所得图谱进行比较。若标准品的峰清晰可见，但样品中未检测到相应峰，则说明mAb样品未被正确处理。这可能是由于缓冲液中存在SDS或亲核试剂，干扰了N-糖链的标记与纯化过程所致。
SEC-MALS 可用于评估另外两个关键质量属性（CQA）：抗体的聚集谱和分子量。一个典型的 SEC-MALS 色谱图与图3中所示相似。使用配套软件，结合消光系数 1.37 mL*(mg*cm)-1 和 dn/dc 值 0.185 mL/g，测定分子质量分布和绝对分子量。由于软件中的峰识别和基线设定需手动完成，不同操作者之间的结果可能略有差异。图3中单体 IgG1 的绝对分子量为 1.504 × 105 Da ± 0.38%（蓝色），高阶复合物为 7.799 × 105 Da ± 3.0%（红色）。聚集体的多分散性远高于单体，如峰1的红色摩尔质量分布曲线所示（图3）。由于该方法所需样品量少，且聚集状态作为关键质量属性的重要性突出，因此该技术是自动化微型生物反应器系统的极具价值的补充分析工具。
mCZE 的结果是一张电泳图谱，如图4所示，展示了单克隆抗体的电荷变体谱型。该谱型是所研究蛋白质的独特特征，且对操作pH值高度敏感。在电荷变体谱型左侧还可观察到一个游离染料峰。在确定操作pH值时，操作者可在分辨率与信号强度之间进行权衡；此外，操作者必须确保电荷变体与在约30秒处迁移的游离染料峰之间具有良好的分离度。样品在标记后可进行脱盐处理以消除该峰，但这会导致信号显著降低。一旦确定了操作pH值，即可对样品谱型进行比较。尽管谱型通常具有一致性，但标记效率的变化或辅料成分的差异仍可能导致样品迁移行为及电荷变体谱型出现微小差异，从而难以直接比较电泳图谱。因此，通常采用碱性、主峰和酸性组分的百分比来进行比较。在此情况下，使用mCZE可检测到低至1-2%的相对差异。
可通过监测氨基酸消耗情况，以确定其耗竭是否引起关键质量属性（CQAs）的变化。质谱仪的色谱图输出可用于评估在粗制生物反应器培养基样品中实现氨基酸绝对定量的校准曲线是否成功建立。图5展示了在此过程中两个总离子色谱图（TIC）和一个提取离子色谱图（XIC）的代表性结果。在图5A中，所示TIC显示了仅注入纯水空白样时缓冲系统的背景信号。图5B展示了一张氨基酸标准品的代表性TIC，与纯水空白样相比，可观察到对应于各个氨基酸组分的小峰（例如在7.96分钟处的赖氨酸）。为实现峰面积的积分并促进定量分析（从而推算浓度），需使用提取离子色谱图（XIC），其中仅显示特定“色谱质量窗口”内的信号。根据仪器的灵敏度和色谱分离的质量，用户需自行确定最佳的质量窗口。在本示例中（图5C），展示了赖氨酸（m/z = 147.1144）在10 ppm质量窗口下的XIC，其中氨基酸标准品中的赖氨酸在8.03分钟时从色谱柱中洗脱。
<img alt="蛋白质纯化层析；紫外吸收图谱；杂质与单克隆抗体峰洗脱过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1。采用快速蛋白液相层析（FPLC）技术的纯化方案代表性层析图谱。 横轴标注了对应于体积（mL）的纯化方法各阶段。在整个纯化过程中监测280 nm处的紫外吸光度（mAU，纵轴实线）。在高盐洗涤阶段，通过增加电导率（mS/cm，纵轴虚线）去除非特异性结合的杂质。当pH降低至4时（未显示），通过引入洗脱缓冲液（B组分，点线）从Protein A柱上洗脱抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱图；聚糖分析；标注峰 G0F、M5；强度与保留时间数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2。由标记并经质谱验证的聚糖获得的代表性荧光色谱图。 横轴为保留时间（分钟），纵轴为信号强度。14.94 分钟处的峰代表甘露糖 5（M5）聚糖，可观察到叠加的两个样品之间 M5 信号强度存在显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱分析图，吸光度对时间，突出显示高分子量（HMW）和单体的摩尔质量峰。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. IgG1单克隆抗体的分子量分布。 在1×PBS（pH 7.4）中通过尺寸排阻色谱分离的完整IgG1单克隆抗体的色谱图。在280 nm处监测吸光度（黑色；左侧纵轴），并使用光散射和折射率检测器计算每个峰的绝对分子量（红色和蓝色；右侧纵轴）。高分子量物质由标注为“HMW”的峰指示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示物种分离的色谱图；RFU 与时间关系；主峰位于 0.60 分钟处" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4．IgG1 单克隆抗体的电荷变体谱型。 该电泳图谱在 mCZE 平台上生成。游离染料峰迁移至约 30 秒处，并与 IgG1 实现良好分离。用于定量分析时，使用仪器配套的数据分析软件将峰划分为碱性、主峰和酸性组分。红线标示了积分峰面积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TIC 和 XIC 的色谱图；水空白、氨基酸、赖氨酸色谱图；LC-MS 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5. 基于质谱的粗生物反应器培养基中氨基酸分析的典型离子色谱结果。 横轴为时间（分钟），纵轴为信号强度（A）水空白作为阴性对照，显示了液相色谱梯度过程中观察到的背景信号（B）此处使用 225 pmol/µL 氨基酸标准品作为阳性对照，该总离子色谱图中出现的各个峰代表标准混合物中不同氨基酸在色谱上的分离情况（C）m/z 147.1144 的代表性提取离子色谱图，即赖氨酸。B 中 7.96 分钟的峰对应于 C 中赖氨酸的 8.03 分钟峰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文详细描述了从自动化微载体生物反应器收获的细胞培养液（HCCF）中纯化单克隆抗体并进行后续分析的实验方案。同时介绍了如何利用分析方法测定关键质量属性（CQAs），以及如何最大限度地利用有限的样品体积以获取关键信息。

单克隆抗体（mAbs）是当今生产最广泛且特征最明确的生物制品之一。通常采用……方法生产。

本方案旨在解决从微型生物反应器中获取的有限样品的分析问题，以提取有关产品质量关键属性的重要信息。这些技术的另一优势在于，其分析时间极短，即可确定决定终产品质量参数的关键属性。演示该操作流程的人员为来自我实验室的研究员 David Powers、Talia Faison 和 Phillip Angart。首先打开与纯化系统连接的软件，并将15毫升锥形管放入馏分收集器中用于收集纯化的抗体洗脱液，同时将50毫升锥形管用于收集高盐洗涤步骤中的穿流液。接着，将经过0.22微米孔径滤膜过滤的收获细胞培养液加入一支12毫升空注射器中，注射器前端带有帽盖。取下帽盖后，将注射器喷嘴插入纯化系统的手动进样口。旋转注射器以将其固定到位，并按下柱塞，直至样品的全部体积被注入，并在连接的10毫升大体积样品环中可见。选择已保存的方法，当仪器软件提示时，点击“运行”。当所有抗体均被洗脱后，立即用1摩尔三羟甲基氨基甲烷碱（Tris base）将纯化后的蛋白质中和至pH约5.5。为通过离心浓缩纯化的抗体，将100千道尔顿滤膜放入滤液收集管中。用500微升双蒸水洗涤滤膜，然后离心。重复洗涤滤膜两次。第二次洗涤后，弃去滤液，并将清洗过的滤膜转移至新的离心管中。接着，向每个滤膜中加入 500 µL 样品进行离心。离心结束后，将滤膜倒置插入新的收集管中，以获得经最终离心浓缩的样品。进行N-糖链标记与分离时，将每份浓缩的抗体样品各取7.5微升，用试剂盒中1毫升离心管中的15.3微升液相色谱-质谱联用（LCMS）级水稀释，并加入6微升酶和质谱兼容的5%表面活性剂溶液，在90摄氏度下变性3分钟。变性结束后，将样品置于室温冷却3分钟，然后加入1.2微升肽-N-糖苷酶F，在50摄氏度下孵育5分钟。将样品在室温下冷却 3 分钟后，加入 12 微升溶解于无水二甲基甲酰胺中的荧光标记试剂，在室温下标记 5 分钟。孵育结束后，用 358 微升乙腈稀释标记后的 N-聚糖混合物，并将亲水相互作用色谱板置于带有垫片和废液托盘的真空 manifold 中。用 200 微升水对孔板进行活化，调节真空压力至 10 至 15 千帕，以确保液体通过亲水相互作用色谱树脂的时间为 15 至 30 秒。在每孔中加入400微升标记的聚糖混合物之前，先用200微升85%乙腈平衡微孔板，处理15至30秒，每次加入新液体后均应用真空抽吸。所有样品加样完成后，用600微升含1%甲酸和90%乙腈的溶液洗涤树脂两次，每次洗涤后更换废液盘，并在下方放置600微升收集管。随后用3次30微升的质谱洗脱缓冲液洗脱标记的N-聚糖，并将收集的洗脱液混合物用310微升乙腈中的二甲基甲酰胺进行稀释。使用超高效液相色谱系统耦合荧光检测器和四极杆飞行时间质谱仪分析标记的N-糖链洗脱样品时，流动相采用50毫摩尔每升甲酸铵和100%液相色谱-质谱级乙腈。初始流速设为0.4毫升每分钟，液相梯度在洗脱阶段逐步增加甲酸铵浓度。将荧光检测器设置为激发波长265纳米，发射波长425纳米，采样频率为2赫兹。将四级飞行时间质谱仪设置为 MS1 正离子灵敏度模式，质荷比范围为 100 至 2,000 道尔顿，扫描时间为 0.25 秒，并采用连续模式进行数据采集。然后将样品载入设定为 10 摄氏度的自动进样器中，并运行已加载的方法。为进行电荷变体分析前对样品进行脱盐处理，需折断 0.5 毫升脱盐柱底部的塞子，松开顶部塞子，并将脱盐柱放入 1.7 毫升离心管中。将新的层析柱转移至新的微量离心管中，向柱顶部加入80微升浓度为3.5毫克/毫升的抗体溶液。保持层析柱原有方向，离心层析柱。然后弃去脱盐柱，并充分混匀浓缩后的样品。在96孔板的单个孔中，将样品用25微升超纯水稀释至浓度为2毫克/毫升，然后向该孔中加入5微升标记缓冲液和5微升标记试剂。室温避光孵育10分钟后，将60微升试剂级水与样品混合，并用封板膜封板以进行离心。准备电荷变体芯片时，移除保存液，并用水清洗第1、3、4、7、8和10号孔。用 pH 7.2 的运行缓冲液替换水，并向缓冲液管中加入 750 微升运行缓冲液。在仪器用户界面上按下“卸载板”（Unload Plate），然后从 96 孔板上移除密封膜。将板和缓冲液管插入 GX2 样品架上指定的位置，然后按下“加载板”（Load Plate）。将芯片放入芯片室，关闭芯片室盖，当系统提示时选择高通量蛋白质电荷变体检测法，然后点击运行。通过快速蛋白液相色谱法对自动微尺度生物反应器收获的细胞培养样品进行纯化，可利用多种下游分析方法对纯化后的蛋白质关键质量属性进行表征，如图所示。由中国仓鼠卵巢细胞表达的单克隆抗体经质谱分析处理后所得的N-糖链数据应与这些代表性色谱图相似。尺寸排阻色谱-多角度激光散射技术可用于评估抗体的聚集特性及分子量。由于所需样品量少，且聚集状态是关键的质量属性，因此该技术成为自动化微型生物反应器系统中一种极具价值的补充分析工具。微毛细管区带电泳的结果为电泳图谱，可用于展示单克隆抗体的电荷变体谱型，这是所研究蛋白质的独特特征，且对操作pH值高度敏感。还可以监测氨基酸的消耗情况，以确定其耗竭是否会引起抗体关键质量属性的变化。确保对生产出的产品进行适当且高效的纯化非常重要，因为只有经过适当纯化的蛋白质才能进行后续的分析步骤。该产品还可进行肽图谱分析和稳定性测试。但一旦蛋白质被用于一种表征方法后，通常就无法再用于其他方法。这些技术可用于分析从小体积、高通量生物工艺筛选平台所获得产物，以理解生物工艺参数对产品质量的影响。其中一些技术使用浓高氯酸、甲酸和N-二甲基甲酰胺，这些试剂均具有危害性，操作时应佩戴适当的防护装备并谨慎处理。

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